Kanser hücre istilası ve Uydu Tümör oluşumu keşfedin Kültür Testi Üç Boyutlu

Özet

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Özet

mono tabakaları memeli hücre kültürü çok çeşitli fizyolojik ve moleküler süreçleri incelemek için kullanılır. Ancak, artan hücrelerin incelemek için bu yaklaşım, genellikle istenmeyen eserler üretir. Bu nedenle, genellikle hücre-dışı matris bileşenlerini kullanarak üç boyutlu (3D) bir ortamda, hücre kültürü, in vivo bağlı doku veya organ nativ yakından benzerlik için ilginç bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Bir fibrin jel yapılmış bir sözde primer macrospherical tümör ve (ii) bir çevresel hücresiz bölme bir kollajen jel hareket gömülü kanser hücrelerini ihtiva eden bir merkez bölme iki bölme, yani: (i) ile 3 boyutlu bir hücre kültür sistemi geliştirmiştir örneğin, merkezi kullanılandan farklı bir hücre dışı matris bileşeni, burada kanser hücrelerinin göç (yayılma ön) ve / veya ikincil veya uydu tümörler temsil mikroküresel tümörler oluşturabilir. periferal bölme uydu tümör oluşumuoldukça bu 3D kültür sistemi benzersiz kılan doğal tümör hücrelerinin bilinen saldırganlık veya metastatik kökenli korelasyon. Bu hücre kültürü Kanserin hücre istilası ve motilite, hücre-hücre üstü matris etkileşimlerini ve anti-kanser ilaç özelliklerini değerlendirmek için bir yöntem olarak değerlendirilmesi için kabul edilebilir.

Giriş

Kanser hücre işgali / göç ve sonraki metastaz kurulması temel ve biyomedikal özelliklerini inceleyen yoğun araştırma ^1,2 konusudur. Metastaz kanser nihai aşamasıdır ve klinik yönetim belirsizliğini koruyor. Hücresel ve moleküler düzeyde metastaz daha iyi anlaşılması daha etkin tedavilerin ³ gelişmesini sağlayacaktır.

Metastatik hücrelerin çeşitli özellikleri kendi stemness ve göç içinde ve primer tümörün ^5'ten işgal etmeye bir geçiş durumu (örneğin, epiteloid-mezenkimal geçiş) elde etmek için potansiyeli de dahil olmak üzere in vitro ⁴ keşfedilebilir. Neredeyse kan / lenfatik dolaşımı katkısını hariç çünkü Ancak, işgali / metastaz süreçlerinde in vitro değerlendirilmesi bir meydan okuma olmuştur. kollajen jel tümör fragmanları gömmek organotipik kültürlerinin Previou bilgisisinsi kanser saldırganlık izlemek için kullanılmaktadır. Tümörlerin karmaşıklığı korunmuş olsa da (örneğin, kanserli olmayan hücrelerin varlığı), tümör fragmanları örnekleme varyasyonuna, sınırlı orta difüzyon maruz ve stromal hücrelerinin ⁶ aşırı büyümesi için vardır. Alternatif bir yöntem, üç boyutlu (3D) hücre ortamı taklit eden hücre dışı matris (ECM) bileşenleri içinde mevcut kanser hücrelerinin büyüyen oluşur. kollajen jel ve / veya bir bazal membran türetilen matriks içinde meme kanseri hücre çizgilerinin proliferasyonu 3D hücre kültürünün en iyi karakterize örnekleri arasındadır. Belirli bir 3D hücre kültür ortamları kullanılarak standart koşullar altında yetiştirilen göğüs kanseri hücreleri için gözlemlenen dağınık düzeneği meme asinüs ve boru şeklindeki yapılar ^7-10 kendiliğinden oluşumuna ters çevrilebilir. Ayrıca, adenokarsinom kanser hücrelerinden türetilen çok-hücreli tümör parçacıklarının oluşumunun (başka teknikler kullanılarak toplanmışÖrneğin, şu anda en yaygın olarak kullanılan 3D hücre kültürü tahlil ^11-13 oluşturmaktadır) gömme ağar, sferoidler yüzen, damla asılı. Bununla birlikte, bu deney, parçacıklarının oluşturabilen kanseri hücre çizgilerinin sınırlı dizi ve bu koşullarda hücrelerin çalışma süresinin kısalığı ile sınırlıdır.

Bu görsel teknik olarak, bu tarifnamede ilgi kanser hücrelerinin alternatif olarak bir bazal membran türetilmiş matris ile kaplanabilir sözde primer tümörün in vitro oluşumunu sağlamak için, bir kollajen jel gömülü gelişmiş bir 3D hücre kültürü analizinde getirmektedir. Oluştuktan sonra, psödo-primer tümör sonra kanser hücrelerinin, iki matris bölme arasında bir arayüz çapraz sağlayan bir hücresel olmayan matris (mevcut durumda fibrin jel) içinde sandviç (Şekil 1 e bakınız). İlginç bir şekilde, agresif kanser hücreleri ile sözde primer tümörden kaynaklanan sekonder tümör benzeri yapılar görünürfibrin jel. Bu 3 boyutlu bir kültür sistemi, örneğin, anti-kanser ilaçları, gen ifadesi ve hücre-hücre ve / veya hücre-ECM etkileşimleri ^14-16 için araştırmak için gerekli esnekliği sunmaktadır.

Şekil 1:.. Yöntem bakış kanser çalışmaları için bir model olarak 3D hücre kültür sistemi oluşturmak için yöntemin şematik özeti bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Protokol

NOT: insan ve hayvan kanser hücreleri satın alınabilir veya lütfen bize sağlanan beri yok etik dikkate.

Yapma 1. Kollajen Fiş (Sözde birincil Tümör)

1. Bir kollajen dağılımını hazırlayın. Daha önce ¹⁷ ya da satın bildirdiği gibi ben de ayıklanır ve sterilize edilebilir sıçan kuyruğu tendonları (RTT) den kollajen yazın. (Beşi 2 dakika çalışır yüksek hız) üniform bir karışımı için dondurularak kurutulmuştur RTT kollajen (0.02 N, asetik asit içinde 3.25-3.50 mg / ml), bir karıştırıcı kullanılarak dağıtılır.
2. Hasat (tripsin-EDTA, genellikle) ve hemasitometre kullanarak canlı hücreleri saymak için tripan mavisi dışlama kullanın. İstenilen hücre yoğunluğu (fiş başına 5 x 10 ⁴ hücreler) ayarlayın.
3. Steril koşullar altında tüm çözümler (NaOH, fetal sığır serumu, DMEM 5x, _NaHCO3) Bileşen (Tablo 1) Hazırlama ve buz üzerinde soğutulmuş tutun. Not: çeşitli çözümler eklenme sırası hücreleri ozmotik veya asidik şokları önlemek için önemlidir.
4. Olabildiğince hızlı bir şekilde son kolajen çözeltisi (5 mi) içine hücre dispersiyonu (1.25 x 10 ⁶ hücre) uygulayın. Hava kabarcıklarını önlemek ve daha sonra hızlı bir şekilde 96 oyuklu plakanın her bir hazır kullanımlı çözeltisi 200 ul dağıtma ise (aşağı yukarı pipetleme) tarafından iyice karıştırın. Yavaşça hava kabarcıklarını çıkarmak için hücre kültürü kaput çalışma alanı yüzeyinde çoklu plaka grev ve kuyuların içinde eşit çözüm yaymak için.
5. Tüm oyuklara doldurduktan sonra inkübatör içine saklamak, (bu adım 96 oyuklu plaka başına yaklaşık 15-20 dakika sürer).
6. gece boyunca 2 saat 37 ° C'de inkübe plakası. Kollajen jelasyon (yani, fibrillogenesis), 30 dakika içinde meydana gelir. Bir gecelik inkübasyondan gerçekleştirmek için kültür kültür ortamı (100 uL / ​​oyuk) ilave edin.

Fibrin Gel 2. İlk Katman

1. Fibrinojen solüsyonu hazırlanması.
   Not: fibrin jel aynı parti, ideal daha tekrarlanabilir Resul için kullanılmalıdırts, fibrin jel oluşumu, ticari dondurularak kurutulmuş fibrinojen farklı yükleri arasında değişebilir.
   1. Her zaman taze hazırlanmış fibrinojen çözümü kullanın. Hidrat kristal oluşumunu önlemek için, şişeyi açarken, oda sıcaklığına kadar dondurularak kurutuldu fibrinojen getirin.
   2. Kademeli önceden ısıtılmış (37 ° C), ^{Ca2 +} ile Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) / 3 mg / ml çalışma konsantrasyonunda Mg2 ⁺ (en az son hacminin% 15 fazlalık hazırlanması düşünülebilir gerekli fibrinojeni çözülür : örneğin, 5 ml çözelti için 5.75 ml 17.25 mg) verdi.
      1. fibrinojen parçaları çözmek için ilk başta önceden ısıtılmış HBSS damla damla ekleyin. beher bir spatula ile büyük parçaları yıkmak. zaman ve karıştırma işleminin kolaylaştırılması için zaman beher çalkalayın. İşlem sırasında bir karıştırıcı plaka kullanmayın. yukarı ve aşağı süspansiyon pipetleme kalan tozu eritin.
   3. Steri ise ılık fibrinojen çözüm tutun0.22 um'lik bir filtreden geçirilerek çözelti lizing. Not: HBSS yeterince sıcak değil veya fibrinojen tamamen çözülmüş değilse, çözüm filtreyi tıkayabilir. Varsa, fibrinojen konsantrasyonunu azaltmak ve böylece fibrin pıhtı sertliği olabilir, bir veya iki kez filtreyi değiştirin.
   4. Bir alternatif prosedür olarak, son hacmi ayarlarken hazır kullanım fibrinojen çözeltisi içine ilgi hücreleri (örneğin, endotel hücreleri) süspanse edin.
2. Trombin Çözümleri hazırlanması.
   1. GKD ₂ O (50 NIH birim / mi) içinde bir stok çözelti hazırlayın, daha sonra bir 0.22 mikron filtre kullanılarak sterilize edin.
   2. bir fibrinojen / trombin oranı ≥1 kullanın: 0.0075 (h / h), fibrin jel oluşturmak için.
3. Fibrin Jel oluşturuluyor.
   1. Steril fibrinojen tutmak ve tüm sonraki adımlar boyunca buz üzerinde stok solüsyonları trombin. fibrin jel 24 oyuklu plakalar içinde oluşturmak üzere izin verilir.
   2. Derhal bindirme inciHer bir E yüzeyi de hava kabarcığı oluşumunu engelleyerek fibrinojen solüsyonu (200 ul / oyuk). Bir seferde 6 kuyu işleyin.
   3. fibrinojen çözüm tamamen kuyu yüzeyini kaplayan sonra, bir 45 ° açıyla plaka yatırmak ve iyi merkezi haline trombini bırakarak ilk kuyuya trombin çözeltisi 1.5 ul ekleyin ve sonra yavaşça için yatay plaka girdap 1-2 sn.
      1. Laminer akış kaputu (5-10 dk) jelleşme / pıhtılaşma işlemi tamamlanıncaya kadar altında stabil pozisyonda plaka bırakın (Not: polimerizasyon işlemi inkübatör plaka taşıyarak, örneğin, rahatsız edilmemelidir).
   4. İlk altı kuyu polimerize sonra tüm kuyular işlendikten kadar, önümüzdeki altı kuyuları için aynı diziyi (yani 3 Önceki adımlar) tekrarlayın.

Fibrin Gel ve sandviç Kollajen Plug 3. İkinci Kat

1. seçenekA: (hemen Kollajen Tak Kullanarak).
   1. fibrin jel ilk kat ince plaka eğerek bütün kuyularda polimerize emin olun. kolajen fişleri transferini kolaylaştırmak için (fibrin jeller ihtiva eden), 24 oyuklu bir plaka ile yan kollajen jel fişler yan ihtiva eden 96 oyuklu plaka koyun.
   2. kolajen fişleri ihtiva eden plakanın her oyuğuna HBSS bir damla ekleyin.
   3. İnce (bir kolu olarak kullanılır) bir şırınga üzerine monte iğne veya (video) bir mikro-kaşık kullanarak iyi her kollajen fişini çıkartın. kollajen fiş de kuyuya merkezli ve kısırlık bakımlı olduğundan emin yaparken, bir veya iki mikro-kaşık kullanarak ilk fibrin jel tabakası üzerine her kollajen fiş aktarın.
   4. fibrinojen çözeltisi, ikinci tabaka ile daha önce oluşan fibrin jel Yerleşimi (300 ul / oyuk) ve 2.3 de tarif edildiği gibi en az 1 tutarak, trombin tanıtmak. seferinde 0.0075 oranı altı kuyu bir sekans
2. (Büyüme Faktörü-azaltılmış Bodrum Membran (GFRBM) ince bir tabaka ile Kollajen Tak Kaplama) Seçenek B.
   1. Serin, tüm Hazırlanan çözümler ve aletleri önceden ve GFRBM donmuş alikotları beri işlenmesi sırasında (örneğin, pipet, ipuçları, test tüpleri), 4 ° C'de veya buz üzerinde saklayın (üreticinin talimatlarına uyun) çözülme sırasında aşırı ısınma oranına çok duyarlı .
   2. plaka oyuklarından ayrılmasından sonra, saf GRFBM çözeltisi 100 ul buz ihtiva eden bir 1.5-ml santrifüj tüpü içinde 2 dakika boyunca her kollajen fiş ıslatın.
   3. Daha önce açıklandığı gibi sağlanması, iyi merkezli iken ilk fibrin tabakası üzerine her kaplanmış fişi aktarın. 5 dakika GRFBM bir jel oluşturmak için izin vermek için 37 ° C'de eklenti ihtiva inkübe edin. Adım 3.1.4 olarak ikinci fibrin katmanı ekleyin.

4. Hücre Kültürü Ortamı koşullar

1. (Kültür ortamı ile de 4 her dolum00 ul). Kültür ortamları ve takviyeleri hücre çizgisi ve deneysel koşullara bağlı olarak seçilir.
2. 100 kallikrein önleyici birim (KIU) / ml'lik bir son konsantrasyonda kültür ortamına aprotinin bir antifibrinolitik ekleyin.
   NOT: test edilen hücre hattı için kullanılan şartlar altında, bir hücre kültürü inkübatöründe plakaları saklayın.
3. Her gün taze ortam ile kültürler doldurun veya deneysel şemasına göre ve aprotinin ekleyin. Taze orta eklemeden önce biraz (30-35 ° açıyla) plaka yatırın ve dikkatle sürekli gözlem altında klimalı ortam aspirasyon sırasında kuyunun kenarına pipet eğin.

Sonuçlar

Daha önce de belirtildiği gibi, bu 3D hücre kültürü deneyinde ilginç bir özelliği, kanser hücreleri sadece bitişik fibrin jel kolajen fiş göç değil, aynı zamanda, ikincil tümörlerin (örneğin, uydu, tümör benzeri yapılar) tesis olup olmasıdır. Bu, doğrudan doğruya, özellikle uzun bir çalışma mesafesi kondansatör (Şekil 2) ile birlikte, jel kalınlığı boyunca düşük ve yüksek büyütmelerde bir ters faz kontrast mikroskop ile...

Tartışmalar

önemli bir teknik dipnot olarak, bir boşluk, merkezi ve periferik jeller arasındaki ara yüzeyde mevcut olması gereklidir. Aksi takdirde, / göç fibrin jel işgal hücrelerin kapasitesini azaltabilir. Trombin uygun seyreltilmiş edilmemiş ise, kollajen ve fibrin jel arasındaki boşluk kültür ilk 24 saat içinde meydana gelebilir. Kollajen jel neden olabilir test edilen hücre hattı, böylece, her iki jeller arasındaki oluşturmak için göreceli olarak büyük bir alan neden kültür sırasında sözleşme ol...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Freeze-dried collagen	Sigma-Aldrich	C7661	from rat tail tendon (soluble dispersion) or home-made (see Rajan et al., ref.#14)
Fibrinogen (freeze-dried)	Sigma-Aldrich	F8630	Type I-S, 65 - 85% protein with ≥ 75% of protein is clottable
Thrombin	EMD Chemicals Inc.	605157	Gibbstown, NJ; NIH units/mg dry weight
Growth factor-reduced Matrigel	Corning	356234	Previously from BD Biosciences
Aprotinin	Sigma-Aldrich	A6279	solution at 5 - 10T IU/ml (Trypsin Inhibitor Unit)
Micro-spoons	Fisher Scientific	2140115	Fisherbrand Handi-Hold Microspatula
96 well plate, round base	Sarstedt	3925500
24 well plate	Sarstedt	3922
Dulbecco's modified Eagle's Medium	Sigma Chemical, Co.	D5546	DMEM
Fetal Bovine Serum	VWR	CAA15-701	FBS, Canadian origin.
Trypsin-EDTA	Sigma Chemical, Co.	T4049
Hank’s Balanced Salt Solution	Sigma Chemical, Co.	H8264	HBSS