3D Görüntüleri Hızlı Toplama Yüksek çözünürlüklü Episcopic Mikroskopi kullanma

Özet

We describe a detailed protocol using high-resolution episcopic microscopy to acquire three-dimensional (3D) images of mouse embryos. This improved protocol utilizes a modified tissue preparation method to enhance penetration of the fluorescent dye, thereby permitting morphometric analysis of both small and large-sized specimens.

Özet

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) morphometric data. Here, we describe the detailed protocol to image the entire mouse embryo. The protocol consists of four major sections: sample preparation, embedding, image acquisition and finally, 3D visualization. The technology requires specimens to be stained with a fluorescent dye, which can be problematic for large or dense specimens. To overcome this limitation, we have improved the existing protocol to enhance tissue penetration of the dye by pretreating the specimen with a solution containing urea and sodium dodecyl sulfate. The protocol uses only routine laboratory equipment and reagents for easy adaptation in standard laboratory settings. We show that the resulting high-resolution 3D images faithfully recapitulate the detailed morphologic features of the internal organs of mouse embryos, thereby permitting morphometric analyses. Together, we present a detailed and improved protocol using standard laboratory equipment to acquire high-resolution 3D images of small and large sized specimens.

Giriş

The advent of 3D imaging technologies has opened the possibility of systemic analysis of detailed morphological features during fetal development. A variety of 3D imaging modalities is now available include micro-magnetic resonance imaging (micro-MRI), micro computed tomography, high frequency ultrasound, optical coherence tomography, optical project tomography and episcopic microscopy^1-4. Each modality has its own unique features in resolution, contrast, speed, cost, in utero capability and availability.

Episcopic fluorescence image capture (EFIC) and high-resolution episcopic microscopy (HREM) are episcopic microscopy imaging methods⁴. Here, high-resolution serial images are captured continuously from the block face instead of tissue sections. The resulting images faithfully reflect detailed morphological features with minimal or no tissue distortion. The acquired volumetric data is readily converted to high-resolution 3-D images suitable for accurate morphometric analysis. Because of relative low cost and high resolution, HREM and EPIC have become the superior alternatives for systemic assessment of mouse models of human birth defects^2,4-8.

Both EFIC and HREM methods require specimens to be embedded in the suitable medium. EFIC detects autofluorescence emitted from the embedded tissue. Because of this, it is limited to specimens emitting high levels of autofluorescence but not those with relatively weak autofluorescence such as early stage embryos⁹. To overcome the dependency of autofluorescence, specimens are stained with a fluorescent dye such as eosin for HREM imaging. The choices of dyes and staining methods also make HREM more compatible to detect molecular signals in the context of tissue architecture and morphology^4,10.

In this article, we present an improved HREM protocol suitable for whole body assessment of the late stage mouse embryos. To facilitate staining, we include a pretreatment step to increase tissue penetration, thereby enabling HREM imaging of older mouse embryos.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan kullandığı Boston Çocuk Hastanesi'nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. Numune Hazırlama

1. Zamanlı çiftleşme
   1. Aynı kafeste birlikte C57BL6 vahşi tip erkek ve bir dişi koyun.
   2. Bir çiftleşme fiş oluşumu sonraki sabah erken olup olmadığını kontrol edin. Çiftleşme fişi (aka vajinal veya çiftleşme fişi) bloke vajina sertleştirilmiş jelatinli birikmesidir.
   3. embriyonik gün 0.5 (E0.5) olarak fiş tarihini ayarlayın.
2. Fare embriyolarının izolasyonu
   1. CO ₂ boğulma hamile kadın öldürülür.
   2. emici ped sırtüstü fareler koyun ve% 70 etanol ile karın bölgesini püskürtün.
   3. Cildi kaldırın ve cerrahi makas kullanarak kaudal karın bölgesinde bir ilk 5 mm kesi yapmak. Kes ve tam iç organları maruz karın cilt kaldırmak
   4. va yakın Cutgina tüm rahim kaldırmak için.
   5. uterin horn boyunca implantasyon siteleri arasında kesin. Her segment veya konseptus içinde sadece tek bir embriyo olmalıdır.
   6. 1x buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde uterus segmentleri tutun.
3. embriyo diseksiyonu
   1. Stereoskop altında buz soğukluğunda PBS ile ayrı bir kapta, her bir konseptus yerleştirin.
   2. sırayla ince diseksiyon forseps kullanarak rahim dokuları, plasenta ve sonra fetal membranlar çıkarın.
   3. 1x soğuk PBS büyük transfer pipeti kullanılarak 50 ml'lik bir tüpe parçalara embriyo transferi. doku hasarı en aza indirmek için forseps ile doğrudan embriyo toplayıp kaçının.
4. tespit
   1. fiksatif en az 10 numunelerle fazla 24 saat boyunca 4 ° C'de% 10 nötr tamponlu formalin çözeltisinde kesildi embriyolar düzeltildi.
5. Tedavi öncesi
   1. Takas Çözüm hazırlayın: 4M üre, çift damıtılmış su içinde% 10 gliserol,% 4 sodyum dodesil sülfat (SDS).
   2. Takas Çözümü ile fiksatif değiştirin.
   3. 2 hafta - yavaşça 1 oda sıcaklığında bir rocker örnek döndürün. İkinci ve üçüncü gününde bir kez Takas Çözüm alışverişi. Numune yavaş yavaş açık ve saydam hale gelir.
   4. % 10 formalin ile Takas değiştirin Çözüm ve 2 gün boyunca bir rocker bırakın.
6. kurutma
   1. Her biri 5 dakika için 1 x 3 defa PBS ile muamele edilmiş numune yıkanır.
   2. yumuşak bir rocker oda sıcaklığında artan etanol seri örnekleri kurutmak. E15.5 embriyo için,% 50,% 60,% 70,% 80,% 85,% 90,% 95 ve% 100 etanol, 2 saat her bir aşama dahil olmak üzere yükselen etanol serisi kullanır. büyük embriyolar için inkübasyon süresi arttırılması gerekir.
7. boyanma
   1. Eosin Y Disodyum Tuz ve 0.02 0,1375 gram ekleyin: Boyama Çözüm hazırlayınAkridin Portakal Hemi (çinko klorür)% 100 etanol içinde 50 ml tuz 75 gram. 2 saat boyunca karıştırın. Bir filtre kağıdı ile filtre. Oda sıcaklığında saklayın ve alüminyum folyo ile kaplanarak ışık kaçının.
   2. 1 saat Boyama Çözüm örnek aktarın.
   3. Taze Boyama Çözüm ve leke gecede ile değiştirin.
8. Süzülme
   1. Sızma çözeltisi hazırlayın: JB-4 gömme kiti çözeltisi bir 100 ml, C Katalizörünün 1.25 g, Eosin Y disodyum tuzunun 0.275 g ve Akridin Portakal Hemi (çinko klorür) tuzunun 0.055 g 'ını. 2 saat boyunca, bir buz kova içinde (200 rpm) karışımı karıştırılmış ve bundan sonra filtre kağıdı ile süzülür.
   2. 4 ° C'de Sızma Çözüm saklayın ve alüminyum folyo ile kaplanarak ışık kaçının.
   3. (1: 1) Boyama Çözüm: Çözüm infiltrasyon embriyo transferine ve 4 ° C'de bir rocker en az 3 saat süreyle inkübe.
   4. Çözüm infiltrasyonuna embriyo transferi ve 3 saat süre ile inkübeSoğuk bir odada bir rocker r.
   5. bir zamanlar her gün Sızma değiştirin Çözüm ve üç gün daha nazik bir rocker soğuk bir odada bırakın.

2. gömülmesi

1. buz üzerinde Çözüm B ve Sızma Çözüm tutun.
2. hemen gömmeden önce (Çözüm Yatak ve Sızma Çözüm 1:25) gömülmesi Çözüm olun.
3. Bir gömme kalıp Orient örnek, daha sonra yavaşça gömme kalıp içine soğuk katıştırma Çözüm dökün. Yeniden yönlendirmek gerekirse bir iğne ile.
4. Gömme Çözüm katılaşmış olup olmadığını incelemek için bir iğne kullanın. Numune bloğu dışarı itmek, ve gerekirse düzeltin.
5. çapraz yönlendirme elde etmek için ayrı kalıp kullanılarak örnek blok yönünü değiştirin.
6. gömme kalıp üstünde bir blok tutucu koyun. Kalıp ve blok tutucu Çözüm gömülmesi ile batık kadar yavaşça kalıp içine gömülmesi Çözüm dökün.
7. ikincil kapta numune tutun ve bırakınBir çeker ocak içinde 4 saat - 3 boyunca buz üzerinde.
8. 4 ° C'de katılaştırıldı örnekleri saklayın.
9. gömme kalıp uzak soyun. bloğundaki numunenin konumunu incelemek için eğik aydınlatma ile stereomicroscope altında blok koyun. numune etrafında blok yüzünde işaretleyiniz ızgara çizgileri.
10. referans olarak işaretlenmiş kılavuz çizgileri kullanarak gömülü malzemenin erişim miktarını kaldırmak için blok Trim.

3. Görüntü Alma

1. mikrotom numune bloğu Kelepçe ve taze kesilmiş bir yüzey elde. Set kesit kalınlığı (örneğin, e9.5-10.5, 1.5 um; e11.5-12.5, 2.0 um; e13.5-15.5, 2.5 mikron; e16.5-yaşlı, 3 um). microtome ev pozisyonunda numune / blok tutun.
2. yatay numunenin blok yüzeyine bakan stereo zoom mikroskop monte edin.
3. Bilgisayar ve mikroskop açın ve görüntü elde etme yazılımı başlatmak.
4. Görselleştirmek ve blok yüze optik odakgörüntüleme yazılımı "canlı görüntü" modunda.
5. Blok-yüz vizörün merkezde olacak şekilde gerekirse mikroskop ve mikrotom hizalayın.
6. Tüm blok yüz vizör içinde olacak şekilde zoom ayarlayın.
7. Yeşil floresan proteini (GFP) filtre (uyarma 470 ± 20 nm, dikroik 495 nm, emisyon 525 ± 25 nm) seçin ve gerekirse tekrar odaklayın.
8. Tedbir ve manuel pozlama süresi ayarlayın (örneğin, 80-400 küçük sn).
9. Her taze kesilmiş sonra blok-yüz görüntüleri elde etmek ve mümkünse otomatik olarak görüntüleri kaydetmek.
10. çözünürlük, kesit kalınlığı ve zoom dahil Tutanak önemli parametreler.
11. Tüm örnek, ihracat terbiye ve gerekirse JPEG formatına tüm resim dosyalarını dönüştürdükten sonra.
12. Bir görüntü işleme yazılımı kullanarak tüm orijinal görüntüleri haricindekileri ve parlaklık ve kontrastı ayarlayın.
13. Ayrı bir klasördeki tüm işlenmiş görüntüler kaydedin.

4. 3Dgörüntüleme

1. talimatları izleyerek bir 3B görselleştirme yazılımı tüm işlenmiş görüntüleri yükleyin.
2. Giriş hassasiyeti ve kesit kalınlığı hacimsel veri (yani voksel boyutu) tüm görüntüleri dönüştürmek ve 3B dosyayı kaydedin.
3. Otomatik modu kullanarak tüm görüntüleri hizalayın. Gerekirse elle tek tek görüntüleri ayarlayın.
4. yeni bir dosya adı hizalanmış görüntü kaydetme.
5. 3D görselleştirme yazılımı kullanarak numunenin morfometrik özelliklerini analiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Biz E9.5 ve E13.5 ⁸ arasında fare embriyoları yüksek kaliteli HREM görüntüler bildirdi. Geç sahnelenen embriyoların Görüntü kalitesi, ancak, önemli ölçüde, çünkü floresan boya eozin sınırlı doku penetrasyonu tehlikeye düşer. Boyama verimini artırmak için, biz floresan görüntüleme ¹¹ uyumlu birkaç ön yöntemleri test ettik. Özel olarak, E15.5 fare embriyo Sca / e A2 ¹² veya tüm vücut ¹³ KÜP ile tedavi edildi. Ay...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada, hızlı 3 boyutlu görselleştirme ve karmaşık yapıların morfometrik analizi için uyumlu seri HREM görüntüleri elde etmek için rutin laboratuvar ekipmanı kullanılarak modifiye edilmiş bir protokol mevcut. yüksek çözünürlüklü görüntüler yerine bireysel bölümlerin blok yüzüne doğrudan alınır, çünkü ince morfolojik özellikleri korunmuş ve hızla bir 3B görselleştirme programında dijital olarak yeniden yapılandırılmaktadır.

3D görüntü görselle...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	The Jackson Laboratory	C57BL6
Ethyl Alcohol	Pharmco-Aaper	111000200	200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade
Formalin	Sigma	HT501128-4L
Urea	Sigma	U5128	Clearing Solution
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	Clearing Solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Invitrogen	15525-017	Clearing Solution
Eosin Y Disodium Salt	Fisher scientific	BP241925	Infiltration Solution
Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt	Sigma	A6014	Infiltration Solution
Whatman paper	GE	3030-153
JB-4 Embedding Kit - Solution A	Polysciences, Inc.	0226A-800	Infiltration Solution
JB-4 Embedding Kit - Solution B	Polysciences, Inc.	0226B-30	Embedding Solution
JB-4 Embedding Kit - Catalyst	Polysciences, Inc.	02618-12	Infiltration Solution
Embedding Molds	Polysciences, Inc.	23185-1	16 x 8 mm
Peel-A-Way Sharp Embedding Molds	Polysciences, Inc.	18986-1	22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm
JB-4 Plastic Block Holders	Polysciences, Inc.	15899
Disposable Graduated Transfer Pipes	VWR	414004-014
Petrl Dish	VWR	25384-088	Embryo dissection
Forceps Inox Tip	ROBOZ	RS-5015	Embryo dissection
Graefe Tissue Forcep	ROBOZ	RS-5153	Embryo dissection
Delicate Operating Scissor	ROBOZ	RS-6700	Embryo dissection
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes	Falcon	352059
50 ml Polypropylene Conical Tubes	Falcon	352098
Ice Bucket	Magic Touch Iceware International Corp.	R19-343
100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats	VWR	89106-766
330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats	VWR	89106-770
Sodium Chloride	MP Biomedicals	102892	PBS Solution
Potassium Chloride	Sigma	P0662	PBS Solution
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5405	PBS Solution
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	PBS Solution
Digital Camera	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Microtome	Leica	RM2265
Illuminator	Carl Zeiss	HXP 200C
Fluorescence Stereo Zoom Microscope	Carl Zeiss	Axio Zoom.V16
Stereo Microscope	Olympus	SZX16
Fiber Optic Light Source	Leica	KL 1500 LCD
Disposable Microtome Blade	VWR	95057-832
Single Edge Dispenser	Personna	62-0330-0000
ZEN	Carl Zeiss	pro 2012
Photoshop	Adobe	CS6 v13.0
Amira 3D Software	Visage Imaging	5.4
Computer	Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory
Rocking Platform Shakers	VWR	40000-304
Standard Hot Plate Stirrer	VWR	12365-382
Analytical Balance	Mettler Toledo	AB54-S