Acquisition rapide des Images 3D Utilisation de haute résolution épiscopique Microscopie

Résumé

We describe a detailed protocol using high-resolution episcopic microscopy to acquire three-dimensional (3D) images of mouse embryos. This improved protocol utilizes a modified tissue preparation method to enhance penetration of the fluorescent dye, thereby permitting morphometric analysis of both small and large-sized specimens.

Résumé

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) morphometric data. Here, we describe the detailed protocol to image the entire mouse embryo. The protocol consists of four major sections: sample preparation, embedding, image acquisition and finally, 3D visualization. The technology requires specimens to be stained with a fluorescent dye, which can be problematic for large or dense specimens. To overcome this limitation, we have improved the existing protocol to enhance tissue penetration of the dye by pretreating the specimen with a solution containing urea and sodium dodecyl sulfate. The protocol uses only routine laboratory equipment and reagents for easy adaptation in standard laboratory settings. We show that the resulting high-resolution 3D images faithfully recapitulate the detailed morphologic features of the internal organs of mouse embryos, thereby permitting morphometric analyses. Together, we present a detailed and improved protocol using standard laboratory equipment to acquire high-resolution 3D images of small and large sized specimens.

Introduction

The advent of 3D imaging technologies has opened the possibility of systemic analysis of detailed morphological features during fetal development. A variety of 3D imaging modalities is now available include micro-magnetic resonance imaging (micro-MRI), micro computed tomography, high frequency ultrasound, optical coherence tomography, optical project tomography and episcopic microscopy^1-4. Each modality has its own unique features in resolution, contrast, speed, cost, in utero capability and availability.

Episcopic fluorescence image capture (EFIC) and high-resolution episcopic microscopy (HREM) are episcopic microscopy imaging methods⁴. Here, high-resolution serial images are captured continuously from the block face instead of tissue sections. The resulting images faithfully reflect detailed morphological features with minimal or no tissue distortion. The acquired volumetric data is readily converted to high-resolution 3-D images suitable for accurate morphometric analysis. Because of relative low cost and high resolution, HREM and EPIC have become the superior alternatives for systemic assessment of mouse models of human birth defects^2,4-8.

Both EFIC and HREM methods require specimens to be embedded in the suitable medium. EFIC detects autofluorescence emitted from the embedded tissue. Because of this, it is limited to specimens emitting high levels of autofluorescence but not those with relatively weak autofluorescence such as early stage embryos⁹. To overcome the dependency of autofluorescence, specimens are stained with a fluorescent dye such as eosin for HREM imaging. The choices of dyes and staining methods also make HREM more compatible to detect molecular signals in the context of tissue architecture and morphology^4,10.

In this article, we present an improved HREM protocol suitable for whole body assessment of the late stage mouse embryos. To facilitate staining, we include a pretreatment step to increase tissue penetration, thereby enabling HREM imaging of older mouse embryos.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

Toutes les utilisations des animaux sont approuvés par le Comité soin et l'utilisation des animaux institutionnels à l'Hôpital pour enfants de Boston.

Préparation 1. Echantillon

1. accouplement Timed
   1. Placez un C57BL6 type sauvage mâle et une femelle dans la même cage.
   2. Vérifiez la formation d'un bouchon d'accouplement tôt le lendemain matin. La fiche d'accouplement (aka, vaginale ou la prise de copulation) est un dépôt gélatineux durci qui bloque le vagin.
   3. Réglez la date de prise de jour embryonnaire 0,5 (E0.5).
2. L' isolement d'embryons de souris
   1. Euthanasier femmes enceintes par le CO ₂ asphyxie.
   2. Mettez la souris sur le dos sur un tampon absorbant et pulvériser région abdominale avec 70% d'éthanol.
   3. Soulevez la peau et faire une incision de 5 mm initiale à la région abdominale caudale en utilisant des ciseaux chirurgicaux. Couper et enlever la peau abdominale pour exposer pleinement les organes internes
   4. Couper près vagina pour enlever tout l'utérus.
   5. Couper entre les sites d'implantation le long de la corne utérine. Chaque segment ou conceptus devraient avoir un seul embryon à l'intérieur.
   6. Gardez les segments de l'utérus en 1x phosphate glacée solution saline tamponnée (PBS).
3. Embryo dissection
   1. Placez chaque conceptus dans un plat séparé avec PBS glacé sous un stéréoscope.
   2. Retirer les tissus utérins, le placenta et puis membranes fœtales utilisant séquentiellement fines pinces à dissection.
   3. Transférer l'embryon disséqué dans un tube de 50 ml avec 1 x PBS glacé en utilisant une grande pipette de transfert. Évitez ramasser embryon directement avec une pince pour minimiser les lésions tissulaires.
4. Fixation
   1. Fixer les embryons disséqués dans 10% neutre solution formaline tamponnée à 4 ° C pendant plus de 24 heures avec au moins 10 volumes de fixateur de l'échantillon.
5. Prétraitement
   1. Préparer la solution de compensation: 4M d'urée, 10% de glycerol, 4% de dodécylsulfate de sodium (SDS) dans de l'eau bidistillée.
   2. Remplacer le fixateur avec la solution de compensation.
   3. Tournez doucement l'échantillon sur une bascule à la température ambiante pendant 1 - 2 semaines. Remplacez la solution de compensation une fois sur le deuxième et le troisième jour. L'échantillon devient lentement clair et translucide.
   4. Remplacer la solution d'échange avec 10% de formaline et de laisser sur une bascule pendant 2 jours.
6. déshydration
   1. Laver les échantillons prétraités avec 1 x PBS 3 fois pendant 5 min à chaque fois.
   2. Déshydrater les échantillons dans une série d'éthanol ascendant à la température ambiante sur une bascule douce. Pour les embryons E15.5, utiliser une série ascendante d'éthanol comprenant 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% et 100% d'éthanol, 2 h chaque étape. Pour les embryons plus âgés, le temps d'incubation doit être augmentée.
7. tachant
   1. Préparer Coloration Solution: ajoutez 0,1375 grammes de Eosine Y sel disodique et 0,0275 grammes d'acridine orange hémi (chlorure de zinc), le sel de 50 ml d'éthanol à 100%. Agiter pendant 2 heures. Filtrer avec un filtre en papier. Stocker à température ambiante et éviter la lumière en couvrant avec une feuille d'aluminium.
   2. Transférer l'échantillon de la solution de coloration pendant 1 heure.
   3. Remplacer avec la solution de coloration fraîche et tache pendant la nuit.
8. Infiltration
   1. Préparer Infiltration Solution: combiner 100 ml de solution A de JB-4 kit d'encastrement, 1,25 g de catalyseur C, 0,275 g de Eosine Y disodique Sel et 0,055 g de Acridine orange hémi (chlorure de zinc) de sel. Bien mélanger (200 rpm) dans un seau à glace pendant 2 heures, puis filtrer avec le papier filtre.
   2. Conservez la solution de Infiltration à 4 ° C et éviter la lumière en couvrant avec une feuille d'aluminium.
   3. Transférer les embryons Infiltration Solution: Solution de coloration (1: 1), et incuber pendant au moins 3 heures sur une bascule à 4 ° C.
   4. Transférer les embryons à l'infiltration Solution et incuber pendant 3 hr sur une bascule dans une chambre froide.
   5. Remplacez Infiltration Solution une fois par jour, et laisser dans une chambre froide sur une bascule douce pendant trois jours.

2. Embedding

1. Gardez Solution B et Infiltration Solution sur la glace.
2. Faire Embedding Solution (1:25 de la solution B et Infiltration Solution) immédiatement avant l'intégration.
3. Orient l'échantillon dans un moule enrobage, puis verser la solution d'enrobage à froid dans le moule intégration en douceur. Réorienter avec une épingle si nécessaire.
4. Utilisez une épingle d'examiner si la solution Embedding est solidifié. Poussez le bloc d'échantillons, et les garnitures si nécessaire.
5. Réorienter le bloc d'échantillons à l'aide du moule séparé pour obtenir une orientation transversale.
6. Mettre un porte-bloc sur le dessus du moule enrobage. Verser délicatement Embedding Solution dans le moule jusqu'à ce que le moule et le support de bloc sont submergés par incorporation Solution.
7. Gardez l'échantillon dans un récipient secondaire et laissersur la glace pendant 3 - 4 heures dans une hotte.
8. Conserver les échantillons solidifiés dans un 4 ° C.
9. Décollez le moule enrobage. Mettez le bloc sous le stéréomicroscope avec éclairage oblique pour inspecter la position de l'échantillon dans le bloc. Sur la face du bloc, marque quadrillage autour de l'échantillon.
10. Coupez le bloc pour retirer le montant de l'accès du matériau d'enrobage en utilisant les lignes de quadrillage marquées comme références.

3. Image Acquisition

1. Fixer le bloc de spécimen à l'microtome et obtenir une surface fraîchement coupée. Épaisseur de la section Set (par exemple, e9.5-10.5, 1,5 pm; e11.5-12.5, 2,0 um; e13.5-15.5, 2,5 um; E16,5-âgés, 3 pm). Gardez l'échantillon / bloc à la position de la maison de microtome.
2. Monter le microscope zoom stéréo face horizontalement la surface du bloc de l'échantillon.
3. Allumez l'ordinateur et d'un microscope, et démarrer le logiciel d'acquisition d'image.
4. Visualiser et concentrer l'optique au bloc-facesous le mode "live view" du logiciel d'imagerie.
5. Alignez microscope et microtome si nécessaire pour que le bloc-face est au centre du viseur.
6. Ajuster le zoom de telle sorte que l'ensemble du bloc-face est dans le viseur.
7. Sélectionnez la protéine fluorescente verte (GFP) filtre (excitation 470 ± 20 nm, dichroïque 495 nm, émission 525 ± 25 nm) et de recentrer si nécessaire.
8. Mesurer et régler le temps d'exposition manuellement (par exemple, 80-400 mini - sec).
9. Acquérir les images du bloc-face après chaque coupe fraîche et enregistrer automatiquement les images si possible.
10. Enregistrez des paramètres importants, y compris la résolution, l'épaisseur de coupe et le zoom.
11. Après avoir terminé l'échantillon entier, l'exportation et convertir tous les fichiers d'image au format JPEG si nécessaire.
12. Inversez toutes les images originales en utilisant un logiciel de traitement d'image, et d'ajuster la luminosité et le contraste.
13. Enregistrer toutes les images traitées dans un dossier séparé.

4. 3DVisualisation

1. Téléchargez toutes les images traitées à un logiciel de visualisation 3D en suivant les instructions.
2. Résolution d'entrée et de l'épaisseur de coupe pour convertir toutes les images à des données volumétriques (taille de voxel) et enregistrez le fichier 3D.
3. Aligner toutes les images en utilisant le mode automatique. Régler les images individuelles manuellement si nécessaire.
4. Enregistrez l'image aligné à un nouveau nom de fichier.
5. Analyser les caractéristiques morphométriques de l'échantillon à l'aide du logiciel de visualisation 3D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Nous avons rapporté des images de MEHR de haute qualité d'embryons de souris entre E9.5 et E13.5 ^8. qualité des embryons en retard par étapes de l'image, cependant, est considérablement compromise en raison de la pénétration tissulaire limitée de l'éosine de colorant fluorescent. Pour augmenter l'efficacité de coloration, nous avons testé plusieurs méthodes de prétraitement qui sont compatibles avec l' imagerie de fluorescence ^11. Pl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Ici, nous présentons un protocole modifié à l'aide du matériel de laboratoire de routine pour acquérir des images de MEHR série qui sont compatibles pour la visualisation 3D rapide et l'analyse morphométrique de structures complexes. Parce que les images à haute résolution sont prises directement à partir de la face du bloc au lieu des sections individuelles, les caractéristiques morphologiques fines sont préservés et reconstruits rapidement numériquement dans un programme de visualisation 3D.

...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	The Jackson Laboratory	C57BL6
Ethyl Alcohol	Pharmco-Aaper	111000200	200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade
Formalin	Sigma	HT501128-4L
Urea	Sigma	U5128	Clearing Solution
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	Clearing Solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Invitrogen	15525-017	Clearing Solution
Eosin Y Disodium Salt	Fisher scientific	BP241925	Infiltration Solution
Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt	Sigma	A6014	Infiltration Solution
Whatman paper	GE	3030-153
JB-4 Embedding Kit - Solution A	Polysciences, Inc.	0226A-800	Infiltration Solution
JB-4 Embedding Kit - Solution B	Polysciences, Inc.	0226B-30	Embedding Solution
JB-4 Embedding Kit - Catalyst	Polysciences, Inc.	02618-12	Infiltration Solution
Embedding Molds	Polysciences, Inc.	23185-1	16 x 8 mm
Peel-A-Way Sharp Embedding Molds	Polysciences, Inc.	18986-1	22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm
JB-4 Plastic Block Holders	Polysciences, Inc.	15899
Disposable Graduated Transfer Pipes	VWR	414004-014
Petrl Dish	VWR	25384-088	Embryo dissection
Forceps Inox Tip	ROBOZ	RS-5015	Embryo dissection
Graefe Tissue Forcep	ROBOZ	RS-5153	Embryo dissection
Delicate Operating Scissor	ROBOZ	RS-6700	Embryo dissection
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes	Falcon	352059
50 ml Polypropylene Conical Tubes	Falcon	352098
Ice Bucket	Magic Touch Iceware International Corp.	R19-343
100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats	VWR	89106-766
330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats	VWR	89106-770
Sodium Chloride	MP Biomedicals	102892	PBS Solution
Potassium Chloride	Sigma	P0662	PBS Solution
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5405	PBS Solution
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	PBS Solution
Digital Camera	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Microtome	Leica	RM2265
Illuminator	Carl Zeiss	HXP 200C
Fluorescence Stereo Zoom Microscope	Carl Zeiss	Axio Zoom.V16
Stereo Microscope	Olympus	SZX16
Fiber Optic Light Source	Leica	KL 1500 LCD
Disposable Microtome Blade	VWR	95057-832
Single Edge Dispenser	Personna	62-0330-0000
ZEN	Carl Zeiss	pro 2012
Photoshop	Adobe	CS6 v13.0
Amira 3D Software	Visage Imaging	5.4
Computer	Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory
Rocking Platform Shakers	VWR	40000-304
Standard Hot Plate Stirrer	VWR	12365-382
Analytical Balance	Mettler Toledo	AB54-S