Schnelle Erfassung von 3D-Bildern mit hoher Auflösung Episcopic Mikroskopie

Zusammenfassung

We describe a detailed protocol using high-resolution episcopic microscopy to acquire three-dimensional (3D) images of mouse embryos. This improved protocol utilizes a modified tissue preparation method to enhance penetration of the fluorescent dye, thereby permitting morphometric analysis of both small and large-sized specimens.

Zusammenfassung

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) morphometric data. Here, we describe the detailed protocol to image the entire mouse embryo. The protocol consists of four major sections: sample preparation, embedding, image acquisition and finally, 3D visualization. The technology requires specimens to be stained with a fluorescent dye, which can be problematic for large or dense specimens. To overcome this limitation, we have improved the existing protocol to enhance tissue penetration of the dye by pretreating the specimen with a solution containing urea and sodium dodecyl sulfate. The protocol uses only routine laboratory equipment and reagents for easy adaptation in standard laboratory settings. We show that the resulting high-resolution 3D images faithfully recapitulate the detailed morphologic features of the internal organs of mouse embryos, thereby permitting morphometric analyses. Together, we present a detailed and improved protocol using standard laboratory equipment to acquire high-resolution 3D images of small and large sized specimens.

Einleitung

The advent of 3D imaging technologies has opened the possibility of systemic analysis of detailed morphological features during fetal development. A variety of 3D imaging modalities is now available include micro-magnetic resonance imaging (micro-MRI), micro computed tomography, high frequency ultrasound, optical coherence tomography, optical project tomography and episcopic microscopy^1-4. Each modality has its own unique features in resolution, contrast, speed, cost, in utero capability and availability.

Episcopic fluorescence image capture (EFIC) and high-resolution episcopic microscopy (HREM) are episcopic microscopy imaging methods⁴. Here, high-resolution serial images are captured continuously from the block face instead of tissue sections. The resulting images faithfully reflect detailed morphological features with minimal or no tissue distortion. The acquired volumetric data is readily converted to high-resolution 3-D images suitable for accurate morphometric analysis. Because of relative low cost and high resolution, HREM and EPIC have become the superior alternatives for systemic assessment of mouse models of human birth defects^2,4-8.

Both EFIC and HREM methods require specimens to be embedded in the suitable medium. EFIC detects autofluorescence emitted from the embedded tissue. Because of this, it is limited to specimens emitting high levels of autofluorescence but not those with relatively weak autofluorescence such as early stage embryos⁹. To overcome the dependency of autofluorescence, specimens are stained with a fluorescent dye such as eosin for HREM imaging. The choices of dyes and staining methods also make HREM more compatible to detect molecular signals in the context of tissue architecture and morphology^4,10.

In this article, we present an improved HREM protocol suitable for whole body assessment of the late stage mouse embryos. To facilitate staining, we include a pretreatment step to increase tissue penetration, thereby enabling HREM imaging of older mouse embryos.

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Protokoll

Alle Tier Anwendungen werden von der Institutional Animal Care und Use Committee bei Boston Kinderkrankenhaus zugelassen.

1. Probenvorbereitung

1. Timed Paarung
   1. Legen Sie eine C57Bl6 Wildtyp-Männchen und ein Weibchen zusammen in der gleichen Käfig.
   2. Prüfen Sie, ob die Bildung eines Gegenstecker früh am nächsten Morgen. Der Gegenstecker ist (aka, vaginal oder Kopulation Stecker) eine gehärtete gallertartig Ablagerung der Vagina, blockiert.
   3. Stellen Sie den Stecker Datum wie embryonale Tag 0.5 (E0.5).
2. Isolierung von Maus - Embryonen
   1. Euthanize trächtige Weibchen von CO ₂ Ersticken.
   2. Setzen Sie Mäuse in Rückenlage auf einem absorbierenden Kissen und Spray Bauchbereich mit 70% Ethanol.
   3. Heben Sie die Haut und machen einen anfänglichen 5 mm Schnitt an der Schwanzbauchregion mit chirurgische Scheren. Schneiden Sie und entfernen Sie die Bauchhaut vollständig die inneren Organe aussetzen
   4. Schneiden Sie in der Nähe von vagina die gesamte Gebärmutter zu entfernen.
   5. Schneiden Sie zwischen Implantationsstellen entlang der Uterushorn. Jedes Segment oder conceptus sollte innerhalb nur ein Embryo haben.
   6. Halten Sie die Gebärmutter-Segmente in 1x eiskalter phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
3. Embryo Dissektion
   1. Platzieren Sie jede conceptus in einer separaten Schüssel mit eiskaltem PBS unter einem Stereoskop.
   2. Entfernen Sie Gebärmuttergewebe, Plazenta und dann sequentiell Eihüllen mit feinen Dissektionszangen.
   3. Übertragen Sie die seziert Embryo in einen 50-ml-Röhrchen mit 1x eiskaltem PBS eine große Transferpipette. Vermeiden Embryo Aufnehmen direkt mit einer Pinzette Gewebeschäden zu minimieren.
4. Fixierung
   1. Fixieren die sezierten Embryonen in 10% neutral gepuffertem Formalin-Lösung bei 4 ° C für mehr als 24 h mit mindestens 10 Probenvolumina von Fixativ.
5. Vorbehandlung
   1. Bereiten Sie die Clearing-Lösung: 4M Harnstoff, 10% Glycerin, 4% Natriumdodecylsulfat (SDS) in doppelt destilliertem Wasser.
   2. Ersetzen Sie das Fixiermittel mit der Clearing-Lösung.
   3. Vorsichtig drehen für auf einer Wippe bei Raumtemperatur 1 die Probe - 2 Wochen. Tauschen Sie die Clearing-Lösung einmal auf dem zweiten und dritten Tag. Die Probe wird langsam klar und durchscheinend.
   4. Ersetzen Sie die Clearing-Lösung mit 10% Formalin und verlassen auf einer Wippe für 2 Tage.
6. Entwässerung
   1. Waschen Sie die vorbehandelten Proben mit 1x PBS 3 mal für jeweils 5 Minuten.
   2. Entwässern Proben in einer aufsteigenden Ethanolreihe bei Raumtemperatur auf einem sanften Rocker. Für E15.5 Embryonen, verwenden eine aufsteigende Ethanolreihe einschließlich 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% und 100% Ethanol, 2 Stunden jeden Schritt. Für ältere Embryonen, muss die Inkubationszeit erhöht werden.
7. Die Färbung
   1. Bereiten Sie Färbelösung: add 0,1375 Gramm Eosin Y Dinatriumsalz und 0,0275 g Acridinorange hemi (Zinkchlorid) -Salzes zu 50 ml 100% Ethanol. Rühre 2 Stunden. Filter mit einem Filterpapier. Lagerung bei Raumtemperatur und vermeiden Licht, indem sie mit Alufolie abdecken.
   2. Übertragen Probe zu der Färbungslösung für 1 Stunde.
   3. Ersetzen mit frischem Färbelösung und Flecken über Nacht.
8. Infiltration
   1. Bereiten Sie Infiltrationslösung: Kombinieren Sie 100 ml Lösung A von JB-4 Einbettungssatz, 1,25 g Katalysator C, 0,275 g Eosin Y Dinatriumsalz und 0,055 g Acridinorange Hemi (Zinkchlorid) Salz. Rühre 2 h (200 Upm) in einem Eisbehälter zu mischen, und dann mit dem Filterpapier gefiltert.
   2. Bewahren Sie die Infiltrationslösung bei 4 ° C und vermeiden Licht durch Abdecken mit Aluminiumfolie.
   3. Übertragen Sie die Embryonen Lösung Infiltrations: Färbelösung (1: 1), und Inkubation für mindestens 3 Stunden auf einer Wippe bei 4 ° C.
   4. Übertragen Sie die Embryonen Lösung Infiltrations und Inkubation für 3 hr auf einer Wippe in einem kalten Raum.
   5. in einem kalten Raum auf einem sanften Rocker für drei weitere Tage ersetzen einmal Infiltrationslösung jeden Tag, und lassen.

2. Embedding

1. Halten Sie die Lösung B und Infiltrationslösung auf Eis.
2. Machen Sie Embedding Solution (01.25 der Lösung B und Infiltrationslösung) unmittelbar vor dem Einbetten.
3. Richten Sie die Probe in einer Einbettform, dann gießen kalt Embedding-Lösung in die Einbettform sanft. Re-Orientierung mit einem Stift, wenn nötig.
4. Verwenden Sie einen Stift zu prüfen, ob die Embedding-Lösung verfestigt wird. Schieben Sie den Probenblock heraus und schneiden Sie es, wenn nötig.
5. Richten Sie die Probe und die separate Form mit einer Querorientierung zu erhalten.
6. Setzen Sie einen Blockhalter auf der Oberseite der Einbettform. gießen Sie vorsichtig Embedding-Lösung in die Form, bis die Form und der Blockhalter durch Einbetten Lösung eingetaucht sind.
7. Halten Sie die Probe in einem Sekundärbehälter und lassen Sie esauf Eis für 3 bis 4 Stunden in einem Abzug.
8. Speichern die verfestigten Proben in einem 4 ° C.
9. Ziehen Sie die Einbettform entfernt. Setzen Sie den Block unter dem Stereomikroskop mit schräger Beleuchtung Position der Probe in dem Block zu inspizieren. Auf der Blockfläche, die Probenmarkierung Gitterlinien um.
10. Schneiden Sie den Block zu entfernen, um Zugang Materialmenge Einbetten der markierten Gitterlinien als Referenzen.

3. Image Acquisition

1. Klemmen Sie den Probenblock zu dem Mikrotom und erhalten eine frische Schnittfläche. Set Schnittdicke (zB e9.5-10.5, 1,5 & mgr; m; e11.5-12.5, 2,0 & mgr; m; e13.5-15.5, 2,5 & mgr; m; E16.5-älter, 3 & mgr; m). Halten Sie die Probe / Block an der Ausgangsposition von Mikrotom.
2. Montieren Sie den Stereo-Zoom-Mikroskop horizontal um den Block Oberfläche der Probe gegenüber.
3. Schalten Sie den Computer und Mikroskop, und starten Sie die Bildaufnahme-Software.
4. Visualisieren und konzentrieren sich die Optik auf den Block-faceunter der "Live-Ansicht" Modus der Imaging-Software.
5. Richten Mikroskop und Mikrotom, wenn nötig, so dass die Blockfläche in der Mitte des Suchers ist.
6. Stellen Sie den Zoom, so dass der gesamte Block-Gesicht im Sucher ist.
7. Wählen grün fluoreszierendes Protein (GFP) -Filter (Anregung 470 ± 20 nm, dichroitische 495 nm, Emission 525 ± 25 nm) und neu auszurichten, wenn nötig.
8. Messen Sie und stellen Sie die Belichtungszeit manuell (zB 80-400 Mini sec).
9. Erwerben Sie Bilder des block Gesicht nach jedem frischen Schnitt und Speichern von Bildern automatisch, wenn möglich.
10. Zeichnen Sie wichtige Parameter wie Auflösung, Schnittdicke und Zoom.
11. Nachdem die gesamte Probe, Export Finishing und alle Bilddateien in das JPEG-Format, wenn notwendig, zu konvertieren.
12. Invert alle Originalbilder eine Bildverarbeitungssoftware, und die Helligkeit und den Kontrast.
13. Speichern Sie alle bearbeiteten Bilder in einem separaten Ordner.

4. 3DVisualisierung

1. Laden Sie alle bearbeiteten Bilder zu einem 3D-Visualisierungssoftware gemäß den Anweisungen.
2. Eingangsauflösung und Schnittdicke um alle Bilder zu volumetrischen Daten zu konvertieren (dh Voxel - Größe) und die 3D - Datei zu speichern.
3. Richten Sie alle Bilder den automatischen Modus. Passen Sie manuell einzelne Bilder, wenn nötig.
4. Speichern Sie das ausgerichtetes Bild zu einem neuen Dateinamen.
5. Analysieren morphometrischen Eigenschaften der Probe die 3D-Visualisierungssoftware.

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Ergebnisse

Wir haben hohe Qualität HREM Bilder von Mäuseembryonen berichtet zwischen E9.5 und E13.5 ^8. Bildqualität der spät statt Embryonen jedoch signifikant wegen der begrenzten Gewebepenetration des fluoreszierenden Farbstoffes Eosin kompromittiert. Um die Färbung die Effizienz zu steigern, haben wir mehrere Vorbehandlungsmethoden getestet, die auf Fluoreszenz - kompatibel sind Bildgebung ^11. Insbesondere wurden die E15.5 Maus - Embryonen entweder mit A2 ¹²...

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Diskussion

Hier präsentieren wir eine modifizierte Protokoll Routinelaborgeräte mit seriellen HREM Bilder zu erwerben, die für die schnelle 3D-Visualisierung und morphometrische Analyse komplexer Strukturen kompatibel sind. Da die hochauflösenden Bilder direkt von der Blockfläche statt einzelner Abschnitte genommen werden, werden die feinen morphologischen Merkmale erhalten und schnell digital in einem 3D-Visualisierungsprogramm rekonstruiert.

3D-Bildgebung bietet signifikante Vorteile bei der Vis...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	The Jackson Laboratory	C57BL6
Ethyl Alcohol	Pharmco-Aaper	111000200	200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade
Formalin	Sigma	HT501128-4L
Urea	Sigma	U5128	Clearing Solution
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	Clearing Solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Invitrogen	15525-017	Clearing Solution
Eosin Y Disodium Salt	Fisher scientific	BP241925	Infiltration Solution
Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt	Sigma	A6014	Infiltration Solution
Whatman paper	GE	3030-153
JB-4 Embedding Kit - Solution A	Polysciences, Inc.	0226A-800	Infiltration Solution
JB-4 Embedding Kit - Solution B	Polysciences, Inc.	0226B-30	Embedding Solution
JB-4 Embedding Kit - Catalyst	Polysciences, Inc.	02618-12	Infiltration Solution
Embedding Molds	Polysciences, Inc.	23185-1	16 x 8 mm
Peel-A-Way Sharp Embedding Molds	Polysciences, Inc.	18986-1	22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm
JB-4 Plastic Block Holders	Polysciences, Inc.	15899
Disposable Graduated Transfer Pipes	VWR	414004-014
Petrl Dish	VWR	25384-088	Embryo dissection
Forceps Inox Tip	ROBOZ	RS-5015	Embryo dissection
Graefe Tissue Forcep	ROBOZ	RS-5153	Embryo dissection
Delicate Operating Scissor	ROBOZ	RS-6700	Embryo dissection
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes	Falcon	352059
50 ml Polypropylene Conical Tubes	Falcon	352098
Ice Bucket	Magic Touch Iceware International Corp.	R19-343
100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats	VWR	89106-766
330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats	VWR	89106-770
Sodium Chloride	MP Biomedicals	102892	PBS Solution
Potassium Chloride	Sigma	P0662	PBS Solution
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5405	PBS Solution
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	PBS Solution
Digital Camera	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Microtome	Leica	RM2265
Illuminator	Carl Zeiss	HXP 200C
Fluorescence Stereo Zoom Microscope	Carl Zeiss	Axio Zoom.V16
Stereo Microscope	Olympus	SZX16
Fiber Optic Light Source	Leica	KL 1500 LCD
Disposable Microtome Blade	VWR	95057-832
Single Edge Dispenser	Personna	62-0330-0000
ZEN	Carl Zeiss	pro 2012
Photoshop	Adobe	CS6 v13.0
Amira 3D Software	Visage Imaging	5.4
Computer	Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory
Rocking Platform Shakers	VWR	40000-304
Standard Hot Plate Stirrer	VWR	12365-382
Analytical Balance	Mettler Toledo	AB54-S