İşlevsel Genomik Tarama kullanılması Kanser Hücre Sfero Kültürleri Potansiyel Yeni İlaç Hedefleri Belirlemek İçin

Özet

Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.

Özet

Kanserde fonksiyonel sürücü olayların tanımlanması yeni ilaç hedefleri nesil keşif için kanser biyolojisi anlayışımızı sürdürmek için merkez ve vazgeçilmezdir. Bu kanser daha karmaşık modeller in vivo tümörogenez sürücü ve klinik çalışmalar klinik öncesi modellerde geçiş yapmak yeni tedavilerin etkinliğini artırmak katkıda bulunan faktörlerin tam takdir için gerekli olduğunu belirgin hale gelmektedir.

Burada siRNA fonksiyonel olan tarama işlemine tabi tutulabilir tip ve yeniden üretilebilir bir tümör parçacıklarının üretilmesi için bir yöntem sunulmuştur. Bu sferoidler klasik iki boyutlu kültüründe mevcut değildir katı tümörlerde bulunan birçok özellikleri gösterir. Bir çok yaygın olarak kullanılan bir meme kanseri hücre çizgileri bu protokol için uygun olduğunu göstermektedir. Ayrıca, proof-of-prensibi meme kanseri hücre hattı BT474 kullanan veri sağlamak, teyit onlarınfosfatidilinositol-4,5-bifosfat 3-kinaz (PIK3CA) epidermal büyüme faktörü reseptörü, HER2 ve mutasyon amplifikasyonu bağımlılık, tümör sferoidler olarak yetiştirilen. Son olarak, biz daha fazla araştırmak ve immünohistokimyasal kullanarak bu bağımlılıkları mekansal etkisini teyit edebiliyoruz.

Giriş

Solid tümörler başarıyla hastaları tedavi edememek önemli bir meydan okuma ile klinisyenlerin sunan önemli histolojik, genetik ve mikro-çevre içi tümör heterojenitesini, görüntüler. roman tanımlamak için kullanılan modellerin çoğunluğu tedavileri bu özelliklerin birçoğu dahil değil hedef. Gerçekten de, klinikte kullanılan mevcut hedeflenen tedavi, iki boyutlu (2D) kültür koşulları altında yetiştirilir kanser hücre hatları kullanan tarama yaklaşımı kullanılarak, son on yıl içinde geliştirilmiştir. Bu tür reseptör tirozin kinaz inhibitörleri gibi çeşitli başarıları, hakkında getirmiş olmasına rağmen, kanser daha karmaşık modeller tam in vivo tümörogenez sürücü ve geçiş yapmak yeni tedaviler sayısını artırmak katkıda bulunan faktörlerin takdir için gerekli olduğunu belirgin hale gelmektedir klinik çalışmalarda, önceden klinik modelleri. Ayrıca, şimdi de 2B kültür sistemlerinde yansıtmak için başarısız olduğunu takdirdavranışı ^1,2 vivo. Örneğin, zayıf vaskülarize tümörlerde mikro olan oksijen ve besin elde etmek için talep arz geçebilir olarak, yüksek ve düşük doğum bölgeleri geliştirir. Karbonik anhidraz IX (CAIX) olarak kurulan hipoksik belirteçleri tümör bölümlerinin imünohistokimyasal lekelenmesi ile tespit edilen tümör düşük oksijen (hipoksi) varlığı, meme kanseri daha kötü bir klinik sonuç ^3,4 Böylece içeren özellikler gibi korelasyon tarama modellerine hipoksi in vivo daha etkili olacak yeni ilaç hedefleri keşfetmek için kapasitemizi artırmak olabilir. Nitekim, hipoksi ihtiva başarıyla hedefleyen agresif tümörler klinik öncelik ^5'tir.

daha doğru bir şekilde tümörün mikro kanser hücreleri tarafından karşılaşılan koşullar elemanlarını özetlemek amacıyla geleneksel 2D siRNA tarama değiştiren, bir kaç genin tanımlanması inci yol açmıştırin vivo tümör büyümesi için önemli olduğu tespit edilmiştir. Bu düşük serum koşullarına ^6, hipoksik koşullarda ⁷ altında ve kombinasyon ⁸ gerçekleştirilen fonksiyonel genomik ekranlar yer alıyor. Düşük serum yetiştirilen Örneğin, 6-fosfofrukto-2-kinazı / Fruktoz-2,6-bisfosfataz 4 (PFKFB4), karbon giren glikolizi düzenlenmesinden sorumlu bir protein susturulması, metastaza türetilmiş prostat kanser hücre apoptoza neden olmuştur. Aynı koşullar altında, normal prostat hücre hatlarında PFKFB4 susturulması ise PFKFB4 bölgesinin tüketimi, tam olarak, prostat kanseri hücre kuşağının büyümesinin ⁶ ksenogrefleri ablasyon, hiçbir etkisi yoktu.

göğüs kanseri hücre çizgilerinin uzun bir panelinde, mono- karboksilaz taşıyıcı 4 (MCT4) susturulması, tercihen, düşük oksijen koşullarında hücre hattı büyüme azalmasına neden olmuştur. Bu güvenlik, meme kanseri hücre dizisi ortotrop xenogra in vivo olarak doğrulandıFTS. besin stres koşulları altında Belki de en çarpıcı, Asetil-CoA sentetazı 2 (ACSS2), asetil-CoA içine asetat dönüştürmekten sorumlu bir enzim susturma, indirgenmiş kanser hücre numarası (düşük oksijen ve serum), ancak, normal kültür koşulları altında çok az veya hiç etki ^8. ACSS2 ablasyonu besin gradyanlar tümör mikroçevresinin içinde ve bu bölgelerde ikamet hücreler tümör ilerlemesi ⁸ için gerekli olduğu izole yoktur düşündürmektedir meme ve prostat kanseri xenogreftler büyümesini etkiledi. Ayrıca, ACSS2 da tümörlerinde artış ACSS2 aktivitesi olmayan koşullarda büyümesini destekleyen temel mekanizma olabileceğine işaret etmektedir, glioblastoma ve hepatoselüler karsinom ^9,10 önemli olduğu bulunmuştur.

Toplu olarak, bu çalışmalar, in vivo olarak karşılaşılan koşullar yansıtan ve siRNA ekranlar performans g saptanmasına olanak kanıtlamakKanser yaşam için gerekli enes. Yanı sıra besin stres koşulları altında 2B ve kanserli hücrelerin büyümesi etki olarak bu çalışmalar, hedef gen tükenmesi tümör ksenograftlarının ^6,8 gözlenmiştir ne yansıtma, kanser hücre hattı sfero büyümesini inhibe etti. Böylece, kanser hücre hattı sferoidler ACSS2 susturulması duyarlılık kazandırmak tümör mikroçevresinde karşılaşılan durumların birkaç içerir. Gerçekten de, sferoidler besin gradyanlar (serum ve oksijen), pH değişiklikleri gösterir, üç boyutlu (3D) hücre-hücre teması hem de, hücre siklüs hapsine ve apoptozise hücre proliferatif sürat değişiklikler. Bu nekrotik bölgeler, kanser sferoidler varlığı ile tarif edilmektedir, özelliği geleneksel 2B kültür bulunamadı.

Kanser hücresi sferoidler önce küçük molekül inhibitörleri taranması için daha fazla biyolojik ilgili model olarak kullanılmıştır, ancak bu, sadece bileşik, etkinlik doğrulanması veya kaçakları repurposing sağlar adresunds başlangıçta diğer hastalıklar ¹¹ için tasarım. Mevcut sferoid tarama yöntemleri, yüksek içeriği şekilde bir yüksek verimlilik belirli bir gen tükenmesi analiz için izin yoktur. Burada, ilk kez tarif, kanser hücre hattı sferoidler küçük müdahale edici RNA (siRNA) teknolojisini kullanan spesifik gen bağımlılıkları ortaya çıkarılması için fonksiyonel genomik boru hattı. Biz insan meme kanserlerinde 200 en sık mutasyona uğramış genleri hedefleyen siRNA'lar ile ısmarlama kütüphane tasarlanmış ve BT474 meme kanseri küresellerde sfero büyüklüğü ve metabolik aktivitesi üzerine gen tükenmesi etkisi değerlendirildi. Biz sağlam ve tekrarlanabilir ERBB2 ve PIK3CA 3D kültürlerde susturma etkisini tespit başardık. Ayrıca, biz immünhistokimya kullanarak BT474 sferoidler mekansal mimarisi üzerine gen tükenmesi etkisini değerlendirmek olabilir.

Protokol

96-iyi siRNA Tabaklar 1. Hazırlık

Not: 96 oyuklu bir plakanın dış kenarları, böylece 60 ve 96 oyuklu her plakaya siRNA'lar miktarını sınırlamak, kuyu göre buharlaştırma daha yatkındır. Bu sınırlamak için düz orta veya PBS ile dış kuyularda doldurun. Buna ek olarak, isabet bir doğrulama ekranı plakası yanlılığı hafifletmek için tavsiye edilir.

1. Ultra-düşük bağlanma plakasının uygun kuyulara 500 ng / (üreticinin önerilerine göre) azalmış serum ortamında uL ve Aliquotların 10 mcL - 250 siRNA'lar sulandırmak. üç nüsha olarak tüm ekranları gerçekleştirin.
   NOT: transfeksiyon verimliliği değerlendirilebilir sağlamak için plaka tasarımı uygun olmayan hedefleme (negatif) ve (örneğin, UBB ve PLK1 olarak, pozitif) öldürme siRNA kontrolleri ekleyin. Hücreler transfeksiyon karışımı eklenir olarak siRNA çalışması için düşük bağlanma plakalarının kullanımı kritiktir. Biz ekarte edemez bazı üreticiler, ultra-düşük ekiPlakalar sfero büyüme üzerinde ince etkileri olabilir. Bu nedenle bu son kullanıcı tarafından test edilmelerini tavsiye ederiz.
2. -20 ° C'de yapışkan mühürler ve mağaza ile kapak plakaları.

Hücre Hattı 2. Ters Transfeksiyon

1. Ekranın gün, oda sıcaklığında plakalar defrost bir tezgah üstü santrifüj kullanılarak 1000 x g'de 5 dakika boyunca dönerler. her bir çok kanallı pipet kullanarak optimize transfeksiyon reaktifi ihtiva eden düşük serum ortamı 10 uL ekleyin. oluşturmak için siRNA ihtiva eden transfeksiyon komplekslerinden 15 dakika boyunca plakaları bırakın.
   Not: Bu çalışma, (% 10 fetal bovin serumu (FBS) ve antibiyotikler ile desteklenmiş yüksek glukoz DMEM içinde kültürlenir (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı)) fonksiyonel genomik tarama için göğüs kanseri hücre çizgisi, BT474 kullanılmaktadır.
2. taranabilir hücreleri (% 0.05 tripsin ve 0.53 mM EDTA) bu şişeden ayrılana kadar, hücre hattı Belir uygun hacmi kullanılarak nötralize tripsinizeBir tezgah üstü santrifüj ic orta ve 1.000 xg'de 5 dakika boyunca sıkma tripsin kaldırmak için. ortamın uygun bir hacmi ile hücrelerin tekrar ve bir hücre sayacı kullanılarak, doğru hücre sayısını belirlemek.
   NOT: Tipik haliyle, oyuk başına 5000 hücre Test edilen bir çok hücre çizgileri boyunca küremsi oluşturulması için yeterlidir. Doğru doğru boyutlu karşılaştırmaları için tek bir hücre süspansiyonu olarak hücreleri saymak için önemlidir.
3. Soğuk ortam (4 ° C), 180 uL başına 5.000 hücre hücreleri seyreltilir.
   Not: tekrar oluşturulmuş temel membran matris bileşenlerinin eklenmesi negatif transfeksiyon verimini etkileyecek ve kullanılmadığı önerilir. Hücre hattı optimizasyonu küremsi oluşturulması kapasitesine teyit etmek ve yok etme yararı ekranına önce yapılmalıdır.
4. bir hazneye hücre süspansiyonu aktarın pipet karıştırın ve siRNA (2.1) önceden hazırlanmış ihtiva eden 96 oyuklu ultra düşük bağlanma plakanın her oyuğuna 180 uL ekleyin.
5. CentrifugE 10 dakika boyunca önceden soğutulmuş 4 ° C'de santrifüj 1000 xg'de levha ve daha sonra 37 ° C doku kültürü inkübatöründe geri dönün.
6. NOT: Hücreler kuyuların dibinde bir mozaik olarak görünecektir. Gelecek 12 üzerinde - 24 saat hücreleri tek bir küre oluşturmak için bir araya toplar.
7. 24 saat sonra, hücreler, kuyunun merkezinde tek sfero formu dikkate alınmalıdır. büyümeyi teşvik etmek için her bir tam ortam, 100 uL ekleyin.
8. Üç gün sonra ortam doldurun. Yavaşça her bir ortamdaki, 100 uL çıkarın ve taze ortam 100 uL ilave edin.
9. 7. günde, nicel zaman küremsi büyüme izleyebilir, bir plaka okuyucusu üzerinde otomatik küremsi boyutunu ölçmek (bakınız Bölüm 3).
10. Daha sonra, bir ışık saçan hücre canlılığı boya (Bakınız Bölüm 4) kullanılarak hücre canlılığı belirler.

3. Otomatik Resim Alma

1. sitometresi 7. günde bir tezgah üstü, mikro-plaka görüntüleme plakaları tarayın.
   <, '96 Eh plaka 'uygun plaka türünü seçin ve bir deneme adı girin: li> Aşağıdaki seçin yazılımını açın. NOT: Herhangi bir ek bilgi de yazılım içine eklenebilir.
   1. 'Tumorsphere' uygulamasını seçin. sfero odakta ve optimal kontrast, böylece odağı değiştirin.
      NOT: 'Görüntü tabanlı odak' beklenen sfero boyutlarda olduğu gibi önemli değişiklikler önerilmektedir.
   2. tarama ve 'Start taraması' gerektiren kuyu seçin.
   3. plaka tarayıcı yazılımı kullanarak, nesne maske doğru sfero boyutunu temsil eder emin olun. Koloni çapı, sınır dilatasyon, minimum kalınlık ve hassas ayarlarını ayarlayarak bunu yapın, her bir hücre hattına özgü ^11,12 test etti.
      NOT: sfero alan daha sonra yazılım algoritması kullanılarak hesaplanır. Örneğin, doğru 'yüksek' bir karşı hassasiyetini ayarlamak yedi gün için yetiştirilen BT474 sferoidler alanı hesaplamak içind 200 uM minimum koloni çapı ayarlayın. Bu sfero alanın uygun bir steoid maskesi temsilcisine üretmek gerekir.
      NOT: Bu veriler daha sonra açıklamalı veri dosyası biçiminde de ihracat işlevini kullanarak, makineden ihraç edilebilir. Tarih plaka medyan normalize, kombine ve sfero alan üzerinde istatistiksel olarak anlamlı bir etkisi vardı siRNA'lar tespit edilmesi için analiz ya z-score veya kesinlikle standardize ortalama fark (SSMD) gereğidir.

4. Hücre Canlılık Belirlenmesi

1. sferoid alanı hesaplandıktan sonra, parlak bir canlılık hücre boya kullanılarak canlılık belirler. üreticinin talimatlarına göre reaktif hazırlayın.
2. Dikkatle her bir ortamdaki 100 uL kaldırmak ve canlılık boya 100 mcL ekleyin. 15 dakika boyunca plakalar daha sonra ışık yayma plaka okuyucusu kullanılarak tarama inkübe edin.
   NOT: Bu veriler daha sonra in, ihracat işlevini kullanarak, makineden ihraç edilebiliraçıklamalı veri dosyasının biçimi. Tarih plaka medyan normalize, kombine ve sfero canlılığı üzerinde istatistiksel olarak anlamlı bir etkisi vardı siRNA'lar tespit edilmesi için analiz ya z-score veya kesinlikle standardize ortalama fark (SSMD) gereğidir.

Sonuçlar

Ultra-düşük bağlanma 96 oyuklu plakalar küremsi deneyler hali hazırda daha tümörlerin in vivo bulunan fizyolojik koşulları tekrarlar bir ortamda potansiyel onkojeniklik için yüksek verimli bir fenotipik değerlendirme sağlar. Gerçekten de, kanser hücre çizgileri MCF10DCIS.com ve BT474 bir şekilde sıkı bir sferoid yapılar (Şekil 1A) ve sferoid bölümlerin immünohistolojik araştırması, hücresel ve nükleer morfolojisinde belirgin bir mekansal değişiklikler gösterdi. Zamanla, örneğin BT474 küremsi gibi küremsi nekrotik bölgeler, agresif tümörlerin (Şekil 1B) ortak bir özelliği geliştirmek. Bazı sferoidler gibi MDA-MB-231 hücre hattı olarak nekrotik çekirdeği, geliştirmek, ancak ters yarılan caspsase-3 ifadesi, apoptoz bir belirteç (Şekil 1C) ile ilişkilidir proliferatif işaretleyici Ki67, ekran işaretli varyasyonu yapmıyoruz. birden çok hücre çizgileri gerçekten Recep olan kurmaksiRNA aracılı gen susturma BT474 için tive, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 ve JIMT1 hücreleri ters yedi gün siRNA ile transfekte edilmiştir. Test edilen tüm hücre hatları (Şekil 1D) 'de elzem genin Ubikuitin B (UBB) önemli ölçüde küremsi canlılığının susturma ise transfeksiyon (sahte) bir reaktif veya kontrol siRNA'lar transfeksiyonu varlığı, sferoid ömrü üzerinde hiç bir etkisi olmamıştır.

Biz seçilmemiş en sık mutasyona uğramış genleri, ER +, HER2 + ve üçlü negatif meme kanserleri kapsayan bir insan siRNA kütüphane olarak tasarlanmış. Bu kütüphane gibi myc PIK3CA ve TP53 olan ve katılım karsinoj oluşturulmamıştır gibi bilinen fonksiyon genleri içerir. Ekran aynı zamanda çeşitli sivil hedefleme kontrol siRNA'lar içeren (Kontrol 1. Kontrol # 2) ve siRNA'lar kontrolleri (Tablo 1) öldürme olarak hareket gibi PLK1 ve UBB gibi temel genleri, hedef. Biz meme CAnC kullanmayı tercihbunlar hali hazırda tekrar oluşturulmuş temel membran ilavesi olmaksızın parçacıklarının oluşturulması olarak ER hücre çizgileri, BT474, beygir hücre çizgileri kurulmuş ve bilinen bir genomik mimari sahiptir. Örneğin, BT474 hücrelerinin, östrojen reseptörü (ER +) için pozitif TP53 (E285K) ve PIK3CA (K111N) ^13, insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HER2 +) ve liman mutasyonlar aşın.

Yukarıda belirtilen protokolünü kullanan biz etki geni tükenmesi siRNA ters transfeksiyon yedi gün (Şekil 1 E) sonra, küremsi boyut ve canlılığı üzerindeki izledi. İlginç bir şekilde, genlerin büyük bir çoğunluğunun sferoid alan veya canlılığı (Şekil 2A) üzerinde önemli bir etkiye sahip değildi. FOXO3, PIK3CA, erbB2 ve SF3B1 bir susturma sferoid boyutunda en önemli tekrarlanabilir azalma ile sonuçlandı. Bu azalma, aynı zamanda erbB2 ve SF3B1 susturma sonra küremsi canlılığı gözlendi. Umut verici bir biz confPIK3CA, ErbB2 ve SF3B1 parlak alan mikroskopi (Şekil 2B) kullanılarak küremsi boyutuna susturma etkisi irmed. Daha önce bir çok hücre soyu modellerinde önemli bir gen olarak SF3B1 tanımlanabilir ve siSF3B1 UBB ¹⁴ ek olarak iyi bir öldürücü kontrol eder. İlginçtir, e-Cadherin tüm 200 genlerin sadece susturulması steoid canlılığı (Şekil 2A) önemli bir artışa yol açmıştır. Sfero morfoloji İncelenmesi E-Cadherin susturma canlı hücreler de düşük ekin altındaki (Şekil 2B) dinlenme ile, sfero mimarisinin tam bir dökümünü yol açtığını gösterdi. sfero hacmi ekran verilerinin Manuel Soruşturma, bu durum set boyutu sınırlamaları üzerinde olmasını nesneye de gözlenmiştir ama alan ölçümü elendiği olduğunu gösterdi. Daha önce belirtildiği gibi, BT474 hücrelerinin reseptör tirosin kinaz, HER2 fazla sentezleyen ve bir onkojenik mutasyonu PIK3CA (K111N). Bu olmayan hedefleme kontroller ile transfeksiyon etkisi (Şekil 2C) vardı erbB2 ve PIK3CA bu susturulması, indirgenmiş küremsi canlılığı ile sonuçlanmıştır doğruladı.

Sonraki biz sfero histoloji üzerinde siRNA tükenmesi etkisini araştırdık. BT474 sferoidler ters olmayan hedefleme kontrol siRNA ve siRNA'lar PIK3CA, erbB2 ve UBB hedefleme ile transfekte edilmiştir. ErbB2 ve UBB bir susturma Ki67 siRNA (Şekil 2D) kontrol grubuna göre pro-proliferatif markörün bir azalma ile sonuçlanmıştır. pro-apoptotik markörün aktivasyon kaspaz-3, sadece apoptoz ile sonuçlanmamıştır HER2 ve PIK3CA tükenmesinin düşündürmektedir UBB susturma sonra gözlenen daha çok sitotoksik daha sitostatik idi ayrıldı. Gerçekten de, HER2 ve PIK3CA susturulması transfekte sferoidler kontrol ile karşılaştırıldığında hücre döngüsü tutuklama proteini p27 protein ifadesinde bir artışa neden etmedi.

ent "fo: keep-together.within sayfa =" 1 "> Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar BT474 hücreleri onkojenik HER2 ve PIK3CA 3D sferoidler olarak büyüdüğü zaman sinyal tarafından tahrik olduğunu göstermektedir Daha da önemlisi, bu sonuçlar, mümkün olduğunu göstermektedir. tasarım ve sağlam ve tekrarlanabilir kanser hücre hattı sferoidler genlerin yüzlerce ısmarlama siRNA tarama kütüphanesi uygulamak.

Şekil 1: 3 boyutlu Büyüme Hücre Hattı Optimizasyon. C. göğüs kanseri hücre çizgileri, MCF10DCIS.com ve BT474 7 gün, düşük bağlanma plakalarda kültürlenmiştir. Aydınlık Örnek görüntüler, bir ters mikroskop kullanılarak alınmıştır. Ölçek çubukları 100 mikron =. B. MCF10DCIS.com ve BT474 sferoidler 28 gün boyunca kültürlenmiştir. 4 gün - taze medya 100 uL her 3 doldurulan. Sferoidler% 3.8 formaldehit, e tespit edildimbedded, kesit ve hematoksilin ve eosin (H & E) ile boyandı. Temsilcisi görüntüleri düşük ve yüksek büyütmede gösterilmiştir. Ölçek çubukları sırasıyla 100 mm ve 33 mm temsil etmektedir. C, MDA-MB-231 sferoidler 21 gün boyunca kültürlenmiştir. 4 gün - taze medya 100 uL her 3 doldurulan. Sferoidler,% 3.8 formaldehit sabit gömülü, Ki67 ile kesitli ve lekeli ve kaspaz-3 bölündü. Temsilcisi görüntüler gösterilir. Ölçek çubukları 100 mikron =. D. BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 ve JIMT1 hücre çizgileri ters mock (yalnızca transfeksiyon reaktifi) ve kontrol siRNA'lar ve sürenin sonunda alıcı ile transfekte edildi, ultra düşük bağlanma Plakalar daha sonra küreler oluşturma döndürülmüştür. Taze ortam (100 uL) günde 1 ile 4, 7 gün sonra ilave edildi, hücre canlılığı nicelleştirilmiştir. Veriler 1. kontrol normalize üç kopya halinde gerçekleştirilmiş olan iki bağımsız biyolojik çoğaltır ± SD ortalamasını temsil etmektedir. İstatistiksel anlamlılık bir UNPA kullanılarak hesaplandıIRED Öğrenci t-testi (p <0.05). E. işlevsel kanseri hücre dizisi parçacıklarının gen bağımlılık sorgulamak için kullanılabilir ters transfeksiyon protokolü özetleyen bir akış diyagramıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2: BT474 küremsi Ortaya Onkogenik bağımlılıklar fonksiyonel genomik İncelenmesi. C. BT474 hücrelerinin ters üç kopya halinde 200 geni insan siGENOME siRNA kütüphanesi ile transfekte edilmiştir. Sferoid boyut ve canlılığı gözlendi. Ham veri değerleri plaka medyan normalize ve z skorları 1.7x daha fazla önemli outliers ¹⁵ medyan plaka standart sapma belirlemek için hesaplanmıştır idi. dış genleri Not ERBB2, SF3B1, PLK1 ve UBB böyle birnd e-cad. önemli ölçüde sfero alanı ve canlılığını artırılabilir veya azaltılabilir siRNA'lar kırmızı kontrol siRNA 's tasvir etmektedir, mavi ve kırmızı gölgeli. B. Hücreler ters olmayan hedefleme kontrolü, e-kaderin (E-CAD), PIK3CA, ErbB2 veya UBB siRNA ile transfekte edilmiş ve daha sonra sferoidler oluşturmak üzere bir ultra-düşük bağlanma plakasında döndürülmüştür. 7 gün sonra, Örnek sferoid ve görüntüler, bir ters mikroskop kullanılarak alınmıştır aydınlık. Ölçek çubukları 100 mikron =. Hücreler ters olmayan hedefleme kontrolü, PIK3CA, ErbB2 veya UBB siRNA ile transfekte edilmiş ve daha sonra sferoidler oluşturmak üzere bir ultra-düşük bağlanma plakasında döndürülmüştür. 7 gün sonra hücre canlılığı, nicelleştirilmiştir. Veriler 1. kontrol normalize üç kopya halinde gerçekleştirilmiş olan iki bağımsız biyolojik çoğaltır ± SD ortalamasını temsil etmektedir. İstatistiksel anlamlılık Eşleştirilmemiş Öğrenciler t-testi (p <0.05) kullanılarak hesaplanmıştır. D. 7 gün sonra, sferoidler, sabit gömülmüş, parçalarına ayrılmış ve lekeliH & E, Ki67, Cleaved Kaspaz-3 ve p27 için. Temsilcisi görüntüler gösterilir. Ölçek çubukları 100 mikron =. siControl küremsi H & E nedeniyle boyanma için seçilen işleme ve bireysel sağlam küremsi bir eserin daha küçük görünür unutmayın. Ancak bu Taranan görüntülerin ve hücre canlılığı sonuçları ile gözlenen değişikliklerden olumsuz etkisi yok. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	1 Sigara hedefleme	TP53	DST	KMT2C	İşlenmemiş 1	FCGBP	ARID1B	FBXM7	TTC40	2 Sigara hedefleme
	GATA3	TTN	MUC12	MUC4	AHNAK	HUWEI1	DNAH11	ITPR2	ABCA13	CREBBP
	MAP2K4	PIK3CA	F5	APOB	ANKRD30A	MUC17	DNAH17	LAMA2	ACE	CSMD2
	STARD9	USH2A	FAT3	LPR2	CSMD3	MYO18B	DNAH5	MDN1	ARHGAP5	DNAH9
	CXCR3	MUC16	RB1	PKHD1L1	DNAH2	SYNE2	DYNC1H1	PCLO	CACNA1B	ERBB2
	PLK1	SYNE1	Lyst	PTEN	SPTA1	İşlenmemiş 2	VHL	RYR1	Col6A3	UBB
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	1 Sigara hedefleme	Enam	RYR2	BRCA2	İşlenmemiş 1	FMN2	HECW1	LAMB4	Sİ	2 Sigara hedefleme
	FHOD3	MACF1	RYR3	C2ORF16	DMD	FRG1	HERC2	MYH11	STAB1	ZDBF2
	GOLGA6L2	NEB	SMG1	CACNA1E	DNA14	GCC2	HIVEP2	NIPBL	TANC1	ZNF536
	HMCN1	NF1	UBR5	CACNA1F	DYNC2H1	GON4L	HYDIN	PKD1L1	TF	ANK3
	HRNR	OBSCN	USP34	CYMA5	FAM208B	GPR112	ITSN2	RNF213	TPR	ASPM
	PLK1	PCDH15	XIRP2	COL7A1	FLG2	İşlenmemiş 2	VHL	SAGE1	UNC80	UBB
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	1 Sigara hedefleme	DCHS2	MUC5B	ZFHX4	İşlenmemiş 1	MYO9A	SPHKAP	CXORF22	NCOR1	VPS13D
	ATR	DMXL2	MXRA5	ANK2	KIAA1210	PRUNE2	TCHH	DANH6	NOTCH2	ANKRD12
	BIRC6	DNAH10	TENM1	ATM	lrp1	SCN10A	VPS13C	DNAH7	spen	C5ORF42
	CDH1	DNAH3	PEG3	DIDO1	MAP1A	SCN2A	IPTR3	ERBB3	SRRM2	CCDC88A
	CUBN	NOCK11	RELN	DNAH8	MED12	SHROOM2	CEP350	FAT4	SZT2	CHD4
	PLK1	EYS	SACS	KIAA1109	MED13	İşlenmemiş 2	VHL	KMT2A	VPS13A	UBB
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	Sigara hedefleme	QSER1	ARID1A	WDFY3	İşlenmemiş 1	SDK1	TEX15	LAMA1		2 Sigara hedefleme
	COL14A1	SHROOM3	Ldşftkrd	EFCAB5	SF3B1	CBFB	AHNAK2
	CSMD1	TBX3	KIAA0947	FOXA1	ITPR1	DDX3X	KIF4A
	MEFV	UBR4	MYCBP2	INPPL1	FLG	HECTD4	FAT2
	MGAM	Vcan	NBEAL1	MAP3K1	AKAP9	GPR98	FOXO3
	PLK1	ZNF462	SETX	NRP1	HERC1	İşlenmemiş 2	VHL			UBB

Tablo 1: Plaka Düzen ve İnsan siRNA Kütüphane De kıvrımlı. tablo ekranında kullanılan düşük bağlanma plakaları için siRNA havuzları ve düzeni her içeriğe sahip.

Tartışmalar

Kanser üç boyutlu modeller, giderek daha seçici bir şekilde kanser hücrelerini öldürmek için tasarlanmıştır bilinen ve yeni bileşiklerin etkisini değerlendirmek için kullanılmaktadırlar. Kanser hücresi sferoidler bu şekilde, 3D etkinliğe sahip bileşikler, in vivo koşullarında bir etkiye sahip olasılığı daha yüksek olan, in vivo olarak tümör karşılaşılanlardan daha benzer koşullar görüntüler yapılardır. Ancak, bu yöntemler kanser tedavisinde önemli etkiye sahip olabilir ilaç tasarımı konusu olmamıştır potansiyel yeni hedeflerin belirlenmesi için izin vermez.

Biz kanser hücre hattı küresellerde yedi güne kadar dayanıklı gen susturma için izin verilen bir siRNA işlevsel genomik yaklaşım geliştirdi. siRNA ekranı uygulanmadan önce optimizasyon gerektirebilir protokole birçok kritik adım vardır. büyük ölçekte yeniden üretilebilir uygulanabilir küreler oluşturma yeteneğini gereklidir. Ayrıca,ppropriate transfeksiyon koşulları dikkatli bir optimize edilmelidir. Biz uygun olmayan hedefleme ile birkaç farklı transfeksiyon reaktifleri trialing ve ekran denemeden önce kontrol öldürme öneririz. Biz MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 ve JIMT1 siRNA transfeksiyon için uygun olan, yani, BT474 olan çeşitli sık kullanılan göğüs kanseri hücre çizgileri, gösterebilmişlerdir. Ayrıca, proof-of-prensibi BT474 sferoidler meme kanseri 200 en sık mutasyona uğramış genleri tarama verileri sağlamak, HER2 yükseltilmesi ve PIK3CA onkojenik mutasyonun olan bağımlılıklarını doğruladı. İlginç bir şekilde, transkripsiyon faktör FOXO3 susturulması sferoid boyutunda bir azalmaya ancak canlılığı üzerinde önemli bir etki ile sonuçlanmıştır. FOXO3 onların çevre ¹⁶ daha kolaylıkla uyum sağlayan kanser hücrelerinin metabolik kapasitesini değiştirmek, hipoksiyaya tepki düzenlediği bilinmektedir. ATP bolluğu algıladığı gibi bu rol potansiyel hücre canlılığı okuma olumsuz etkileyebilir, Hücre metabolizmasının ana ürünlerinden biri.

Küremsi boyutunda bir azalma gözlenmesi destek olarak, HeLa FOXO3 bu susturulması tümör büyümesini engellediğini ve apoptosis ¹⁷ kaynaklı ksenograftlarının gösterilmiştir. Bazı genler yanlış pozitif sonuç verebilir kendi 3D mimarisi, korumak için kanser hücrelerinin kapasitesini etkileyebilir dikkat etmek önemlidir. Örneğin, E-kaderin demonte BT474 küremsi yapısının çözündü. Bu, daha önce e-Cadherin antikorlar ¹⁸ hedef kullanılarak rapor edilmişti. Herhangi bir tarama platformu olduğu gibi, potansiyel hedefler gözlenen etkinin tekrarlanabilirliği değerlendirmek için tekrar elenebilir edilmelidir. tekniği, siRNA aracılı gen demonte yani geçici doğası sınırlamalar vardır. susturma Sürekli daha uzun yedi gün siRNA ile elde değildi.

Bu yaklaşımın avantajı, çeşitli başka biyomunun ile birleştirilebilir olmasıdırtric boyalar sadece sfero hipoksi mekansal bilgi veren ya da apoptoz geçiren hücrelerin izlenmesi, örneğin, sfero canlılığını değerlendirmek olanlar. plaka okuyucu taramaları nispeten hızlı ve non-invaziv çünkü Ayrıca, sfero boyutuna siRNA'lar etkisi zamanla yerine sadece deneysel uç noktasında değerlendirilebilir. Nitekim, şu anda bizim tarama boru hattı olan bu caddeleri birkaç keşfediyoruz. yeni bağımlılıkları tespit etmek 3D kültürleri kullanan alternatif bir yaklaşım hedefleri veya proteinlerin, özellikle ailelerinin geniş bir yelpazesi, ya önleyen kimyasal kütüphanelerin kullanılmasıdır. Gerçekten de, Bitler ve diğ. yumurtalık berrak hücreli karsinom ¹⁹ ARID1A durumu ve EZH2 inhibitörleri arasında sentetik öldürücü etkileşimi tanımlamak için bu hedef yaklaşımı kullanılmıştır. CRISPR-Cas9 gen düzenleme teknolojisinin keşfinden da organoid kültürlerinde ve in vivo genetik ekranlar geliştirilmesi için izin vermektedir. Bununla birlikte, TOnun yaklaşımı uygun hayvan tesislerine sahip bağlıdır ve ²⁰ fahiş mal olabilir.

Sonuç olarak, biz bir protokol belirttiğimiz inanıyorum daha doğru modelleri yeni kanser hedefleri ya da kurulmuş hedeflerin sağlam doğrulama belirlenmesi için izin vivo tümör mikro özellikleri, oksijen ve besin gradyanlar. Ayrıca, protokol sferoidler oluşturur ve bu nedenle düzenli olarak yüksek verimli siRNA ekranlar için kanser araştırma eden kullanılabilen hücre çizgisinin her türlü uygulanabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lullaby	Oz Biosciences	LL70500	lipid-based transfection reagent
Viromer	Lipocalyx	VB-01LB-01	virus-like polymer transfection reagent
Ultra-low attachment plate	Corning	CLS7007	96 well plate
Foil plate seals	ThermoFisher	AB-0626
Luminescent cell viability dye	Promega	G7570	CellTitre-Glo
Pipette tips (200 μL)	Starlab	S1111-0806
Pipette tips (10 μL)	Starlab	S1111-3800
Pipette tips (1, 000 μL)	Starlab	S1122-1830
Serological pipettes (5 mL)	Sarstedt	86.1253.025
Serological pipettes (10 mL)	Sarstedt	86.1254.025
Serological pipettes (25 mL)	Sarstedt	86.1685.020
RPMI Media	GIBCO	11875-093
DMEM Media	GIBCO	11965-084
Opti-MEM	GIBCO	31985070
Feta bovine serum	GIBCO	16140063
siRNA	Dharmacon	Cherry picked library
Countess Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000
Cell counting chamber slides	ThermoFisher Scientific	C10312
Celigo S	Nexcelom	contact company
Victor X5	Perkin Elmer	contact company
Benchtop centrifuge	Various
Axiovert Inverted brightfield microscope	Zeiss	contact company
Tissue culture CO2; Incubator	Various
Mulitichannel pipette	Various