Biyofilm Kaldırma azotla temizleme karbon dioksiti aerosollerle

Özet

Biofilms on surfaces can be effectively and rapidly removed by using a periodic jet of carbon dioxide aerosols without a nitrogen purge.

Özet

Biofilms can cause serious concerns in many applications. Not only can they cause economic losses, but they can also present a public health hazard. Therefore, it is highly desirable to remove biofilms from surfaces. Many studies on CO₂ aerosol cleaning have employed nitrogen purges to increase biofilm removal efficiency by reducing the moisture condensation generated during the cleaning. However, in this study, periodic jets of CO₂ aerosols without nitrogen purges were used to remove Pseudomonas putida biofilms from polished stainless steel surfaces. CO₂ aerosols are mixtures of solid and gaseous CO₂ and are generated when high-pressure CO₂ gas is adiabatically expanded through a nozzle. These high-speed aerosols were applied to a biofilm that had been grown for 24 hr. The removal efficiency ranged from 90.36% to 98.29% and was evaluated by measuring the fluorescence intensity of the biofilm as the treatment time was varied from 16 sec to 88 sec. We also performed experiments to compare the removal efficiencies with and without nitrogen purges; the measured biofilm removal efficiencies were not significantly different from each other (t-test, p > 0.55). Therefore, this technique can be used to clean various bio-contaminated surfaces within one minute.

Giriş

Biofilms are complex bacterial community structures in which bacterial cells are embedded within self-produced matrices of extracellular polymeric substances, held together, and protected from the external environment. Biofilms can present a public health risk and cause economic losses because they can form on various surfaces, including medical implant materials and devices, food processing equipment, and heat exchangers. In fact, biofilms have been found to be associated with 65% of all bacterial infectious diseases in humans, according to the Centers for Disease Control and Prevention¹.

Autoclaves and disinfectants such as chlorine have generally been used for the inactivation of biofilms. However, the use of an autoclave is limited for surfaces that can neither withstand high temperature steam nor be placed into the autoclave. Disinfectants are not suitable for surfaces sensitive to chemical treatment or prone to collecting toxic oxidation products². In addition, the biofilm should not only be inactivated, but also removed in order to prevent the attachment of new cells onto the surface, thereby forming a new biofilm³. However, it is difficult to remove biofilms using methods based on viscous fluid shear because the flow velocity near the surface is almost zero and the shear force usually cannot overcome the adhesive forces of micron- and submicron-sized substances. Moreover, the biofilm matrix is known to act as a physical and chemical barrier¹.

Many physical and mechanical techniques have been developed to remove biofilms from surfaces, including ultrasonic vibration¹, electric currents⁴, laser irradiation⁵, and high-pressure water sprays⁶. Each technique has its own pros and cons. Ultrasonic vibration and electric current can be used to control biofilm formation; however, they require a particular configuration and conductive surfaces, respectively, requiring additional shear stress^{1, 4}. Laser irradiation can be applied to a limited area and to hard surfaces; however, some live and dead cells remain on the surface⁵. High-pressure water sprays effectively remove biofilms; however, their high momentum can cause damage to soft substrates⁶.

Biofilm removal using CO₂ aerosols has been previously proposed. It has shown promising results, with high removal efficiencies within a short time^7-11. CO₂ aerosols are generated by adiabatic expansion of a high-pressure CO₂ gas through a nozzle, and they are applied to the surfaces contaminated with a biofilm. This cleaning technique utilizes the momentum transfer of solid CO₂ particles and the solvent action of the melted CO₂ liquids, followed by the aerodynamic shear force of the CO₂ gas¹². Compared with high-pressure N₂ gas jets, CO₂ aerosol jets at the same stagnation pressure are much more effective in removing E. coli biofilms⁷. Moreover, although the momentum of the solid CO₂ that is delivered to the bacteria is considerably high, the momentum of the total aerosol jet applied to the solid surface is substantially lower than that of water jets. Therefore, damage-free cleaning is possible using this CO₂ aerosol technique.

In this protocol, periodic jets of CO₂ aerosols without nitrogen purges were used to remove Pseudomonas putida biofilms from a polished stainless steel surface. In fact, nitrogen purges have been used in many CO₂ aerosol studies to increase the removal efficiency by reducing the moisture condensation generated during the cleaning, even though heating with a hot plate or infrared lamps and employing dry boxes have also been adopted¹². The surface biofilm formation and the optimized cleaning procedures are described below. The removal efficiency was evaluated by measuring the fluorescence intensity of the biofilm on the surface.

Protokol

Biyofilm Oluşumunun için Yüzeyin hazırlanması 1.

1. Mekanik kesici ile çipleri içine 304 1 mm kalınlığında paslanmaz çelik levhalar (10 × 10 mm ²⁾ kesin.
2. 10 dakika her biri için aseton, metanol ve deiyonize (Dİ) su ardışık olarak cips ultrasonik temizleme gerçekleştirin. Organik kirlenmeyi kaldırmak için, cam gibi maddelerden yapılmış bir çözücü dayanıklı kap kullanın.
3. 3-5 saniye DI akan su ile cips durulayın.
4. 3-5 saniye _N2 gaz akışını kullanarak cips kurutun.

Bakteriyel kültür 2. Hazırlık

1. Bir P al -80 ° C derin dondurucuda saklanan stokunun (nazikçe Prof. Sung Kuk Lee, unist, Güney Kore tarafından sağlanan) putida KT2440.
2. 1 dakika sonra oda sıcaklığında erimeye ve dondurulmuş stok çözeltisi üst tabaka çamur döner. stok solüsyonu erimiş tabaka haline bir döngü daldırın.
3. Bir Luria üzerine çizgi bakteri bu döngü kullanmak% 1.5 agar içeren -Bertani (LB) plaka.
4. Bakteri kolonileri büyümesi 30 ° C'de gece boyunca inkübasyona bırakılır.
5. taze döngüsünü kullanarak plaka tek bir koloni seçin.
6. tek bir bakteriyel koloniden ihtiva eden halka ile 50 ml konik bir tüp içinde LB suyu 10 ml inoküle.
7. 30 ° C'de 16 saat ve 160 rpm'de sallanan bir kuluçka makinesi içinde suyu inkübe edin.

Yüzey 3. Biyofilm Oluşumu

1. Her çip yüzeyi sterilize etmek için, 1-2 saniye her 5 kez cımbız ile hazırlanan cips her Pick up ve% 70 etanol bunları batırın. cips daldırma sırasında cımbız ile yapılan emin olun.
2. Geri kalan etanolü çıkarmak için otoklavlanmış DI su ve LB suyu sırayla her bir çip, 1-2 sn her biri için 5 kez, batırın.
3. 2 yongaları ve oyuk başına 5 mi LB suyu ile 6 oyuklu kültür plakaları, bu fiş yerleştirin.
4. LB suyu ulaştığı konsantrasyon kadar bakteri kültürü sulandırınız8 x 10 ⁸ hücre / ml (600 nm dalga boyunda optik yoğunluk: ~ 0.8).
5. Seyreltilmiş bir bakteri kültürü 50 ul her bir inoküle.
6. biyofilmlerin oluşturulması için 24 saat boyunca çalkalamadan 30 ° C'de inkübe edin.

4. CO ₂ Aerosol Temizleme

1. 10 mM amonyum asetat tamponunda biyofilm oluşan fiş Dip (uçucu) 5 kat gevşek bağlı planktonik bakterilerin çıkması için.
2. Hava hafif akan bir biyo-güvenlik kabini, bu yongaları kurutun.
3. Hemen kurutulduktan sonra, jet ekseni boyunca CO ₂ memeden 20 mm yükleme yerinde, bir çip koyun. 40 ° açı jet ekseni yatırın.
4. Gaz basınç regülatörleri kullanılarak, sırasıyla 5.3 MPa ve 0,7 MPa, CO ₂ ve N ₂ gazı durgunluk basınçları ayarlayın.
5. çip orta kesiminde üzerine aerosol jet uygulayın. ₂ olmalıdır katı CO dahil beyaz aerosollergörülebilir. 5 saniye CO ₂ için solenoid valf "konulu" çevirin ve ardından 3 saniye "kapalı" açın: periyodik elle kontrol anahtarı kullanarak (döngü 8 sn). Azot temizleme kullanılması gerekiyorsa, _N2 sürekli bir kaynağı için selenoid vana açın.
6. 16, 40 CO ₂ aerosoller cips davranın ve ile ve azot tasfiyeler olmadan 88 saniye. Negatif kontrol olarak tedavi olmadan fiş saklayın.

Kaldırma Verimliliği için 5. Analiz

1. Kontrol ve aerosol tedavi edilen yongaları üzerinde bakteri hücreleri boyamak için DI su: 1 iM yeşil floresan nükleik asit leke (480/500 nm uyarma / emisyon dalga boyu) hazırlayın.
2. boyama çözeltisi içinde cips yerleştirin.
3. 30 dakika boyunca 37 ° C'de ışıksız bir kuluçka makinesi içinde fiş inkübe edin.
4. inkübasyonu takiben, hafifçe aşırı floresan boya kaldırmak için distile su akan fiş ile durulayın.
5. cips wi kurutuninci _N2 gaz akışı.
6. Bir Epifloresans mikroskop, 40X objektif lens ve CCD kamera kullanarak her çip için görüş 5 rastgele alanlara (321 × 240 mikron ²⁾ mikroskopik görüntüleri floresan atın.
7. Böyle ImageJ gibi bir görüntü işleme yazılımı kullanarak her resim için floresan yoğunluğu elde edin. ImageJ, "Süreç" menüsünden "Çıkart Arkaplan" işlevini kullanın ve "Analiz" menüsünden "Set Ölçümleri" penceresinde "Entegre yoğunluğu" seçeneğini seçin. floresan yoğunluğu elde etmek için "Analiz" menüsünden "Ölçüm" yapın.
8. Aşağıdaki formüle göre biyofilm çıkarma verimliliğini hesaplama:% 100 x (kontrol fişleri I - muamele edilmiş fiş I) / I hesaplanan floresan yoğunluğu (kontrol fişleri I).
9. giderim verimleri ve standart sapmalar ortalama edinin. kullanmakHer iki durum için en az 4 cips.

Sonuçlar

_CO2 aerosoller P çıkarmak için kullanıldı putida SUS304 yüzeyler (Şekil 1) den Biyofilmlererde. yüzeylerin çoğu büyüme 24 saat sonra biyofilm ile kaplanmıştır. Biyofilm çoğu CO ₂ aerosoller (Şekil 2) kullanılarak çıkarıldı. Beklendiği gibi, Şekil 3 artmış _CO2 aerosol tedavi süresi olarak biyofilm giderme veriminde bir artış gösterir. 88 saniye tedavi süresi için, çıkarma verimi 97.74 v...

Tartışmalar

Previously, we conducted optimization studies on CO₂ gas pressure, jet angle, and distance to the solid surface in CO₂ aerosol cleaning⁷. Unlike our previous studies, in the present study, a nitrogen purge was not included in the aerosol (Figure 1). Moreover, 304 stainless steel was used in this protocol, since it is one of the most common stainless steels and is widely used in the food industry. The polished surface is beneficial for fluorescence analysis because of a un...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
304 stainless steel	Steelni (South Korea)		Polished and diced ones
Ultrasonic cleaner	Branson (USA)	5510E-DTH
Luria-Bertani (LB)	Becton, Dickinson and Company (USA)	244620	500 g
Agar	Becton, Dickinson and Company (USA)	214010	500 g
6-well culture plate	SPL Life Sciences (South Korea)	32006
Ammonium acetate buffer	Sigma-Aldrich (USA)	667404	10 mM
Dual gas unit	Applied Surface Technologies (USA)	K6-10DG	One nozzle for CO2 gas & 8 nozzles for N2 gas
SYTO9	Thermo Fissher Scientific (USA)	Invitrogen	Excitaion: 480 nm Emission: 500 nm
Epifluorescence microscope	Nikon (Japan)	Eclipse 80i
40X objective lens	Nikon (Japan)	Plan Fluor	NA: 0.75
CCD camera	Photometrics (USA)	Cool SNAP HQ2	Monochrome