Biofilm Enlèvement des Aérosols de dioxyde de carbone sans purge d'azote

Résumé

Biofilms on surfaces can be effectively and rapidly removed by using a periodic jet of carbon dioxide aerosols without a nitrogen purge.

Résumé

Biofilms can cause serious concerns in many applications. Not only can they cause economic losses, but they can also present a public health hazard. Therefore, it is highly desirable to remove biofilms from surfaces. Many studies on CO₂ aerosol cleaning have employed nitrogen purges to increase biofilm removal efficiency by reducing the moisture condensation generated during the cleaning. However, in this study, periodic jets of CO₂ aerosols without nitrogen purges were used to remove Pseudomonas putida biofilms from polished stainless steel surfaces. CO₂ aerosols are mixtures of solid and gaseous CO₂ and are generated when high-pressure CO₂ gas is adiabatically expanded through a nozzle. These high-speed aerosols were applied to a biofilm that had been grown for 24 hr. The removal efficiency ranged from 90.36% to 98.29% and was evaluated by measuring the fluorescence intensity of the biofilm as the treatment time was varied from 16 sec to 88 sec. We also performed experiments to compare the removal efficiencies with and without nitrogen purges; the measured biofilm removal efficiencies were not significantly different from each other (t-test, p > 0.55). Therefore, this technique can be used to clean various bio-contaminated surfaces within one minute.

Introduction

Biofilms are complex bacterial community structures in which bacterial cells are embedded within self-produced matrices of extracellular polymeric substances, held together, and protected from the external environment. Biofilms can present a public health risk and cause economic losses because they can form on various surfaces, including medical implant materials and devices, food processing equipment, and heat exchangers. In fact, biofilms have been found to be associated with 65% of all bacterial infectious diseases in humans, according to the Centers for Disease Control and Prevention¹.

Autoclaves and disinfectants such as chlorine have generally been used for the inactivation of biofilms. However, the use of an autoclave is limited for surfaces that can neither withstand high temperature steam nor be placed into the autoclave. Disinfectants are not suitable for surfaces sensitive to chemical treatment or prone to collecting toxic oxidation products². In addition, the biofilm should not only be inactivated, but also removed in order to prevent the attachment of new cells onto the surface, thereby forming a new biofilm³. However, it is difficult to remove biofilms using methods based on viscous fluid shear because the flow velocity near the surface is almost zero and the shear force usually cannot overcome the adhesive forces of micron- and submicron-sized substances. Moreover, the biofilm matrix is known to act as a physical and chemical barrier¹.

Many physical and mechanical techniques have been developed to remove biofilms from surfaces, including ultrasonic vibration¹, electric currents⁴, laser irradiation⁵, and high-pressure water sprays⁶. Each technique has its own pros and cons. Ultrasonic vibration and electric current can be used to control biofilm formation; however, they require a particular configuration and conductive surfaces, respectively, requiring additional shear stress^{1, 4}. Laser irradiation can be applied to a limited area and to hard surfaces; however, some live and dead cells remain on the surface⁵. High-pressure water sprays effectively remove biofilms; however, their high momentum can cause damage to soft substrates⁶.

Biofilm removal using CO₂ aerosols has been previously proposed. It has shown promising results, with high removal efficiencies within a short time^7-11. CO₂ aerosols are generated by adiabatic expansion of a high-pressure CO₂ gas through a nozzle, and they are applied to the surfaces contaminated with a biofilm. This cleaning technique utilizes the momentum transfer of solid CO₂ particles and the solvent action of the melted CO₂ liquids, followed by the aerodynamic shear force of the CO₂ gas¹². Compared with high-pressure N₂ gas jets, CO₂ aerosol jets at the same stagnation pressure are much more effective in removing E. coli biofilms⁷. Moreover, although the momentum of the solid CO₂ that is delivered to the bacteria is considerably high, the momentum of the total aerosol jet applied to the solid surface is substantially lower than that of water jets. Therefore, damage-free cleaning is possible using this CO₂ aerosol technique.

In this protocol, periodic jets of CO₂ aerosols without nitrogen purges were used to remove Pseudomonas putida biofilms from a polished stainless steel surface. In fact, nitrogen purges have been used in many CO₂ aerosol studies to increase the removal efficiency by reducing the moisture condensation generated during the cleaning, even though heating with a hot plate or infrared lamps and employing dry boxes have also been adopted¹². The surface biofilm formation and the optimized cleaning procedures are described below. The removal efficiency was evaluated by measuring the fluorescence intensity of the biofilm on the surface.

Protocole

1. Préparation de la surface pour la formation du biofilm

1. Couper 1 mm d'épaisseur , 304 plaques d'acier inoxydable en copeaux (10 x 10 mm ²⁾ avec un dispositif de coupe mécanique.
2. Effectuer le nettoyage par ultrasons des puces dans de l'acétone, du méthanol et déionisée (DI) de manière séquentielle de l'eau pendant 10 minutes à chaque fois. Utiliser un conteneur résistant aux solvants, composé de substances telles que le verre, pour éliminer la contamination organique.
3. Rincer les puces avec de l'eau DI courante pendant 3-5 sec.
4. Sécher les puces utilisant N ₂ flux de gaz pendant 3-5 sec.

2. Préparation de la culture bactérienne

1. Prenez un P. putida KT2440 (aimablement fourni par le professeur Sung Kuk Lee, UNIST, Corée du Sud) actions stockées dans un -80 ° C congélateur.
2. Décongeler à la température ambiante après 1 min, et la couche supérieure de la solution de stock congelé se transforme en neige fondante. Immergez une boucle dans la couche fondue de la solution de stock.
3. Utilisez cette boucle pour strie les bactéries sur un Luria-Bertani Plaque (LB) contenant 1,5% d'agar.
4. Incuber la plaque pendant une nuit à 30 ° C pour faire croître les colonies bactériennes.
5. Choisissez une seule colonie de la plaque en utilisant une boucle fraîche.
6. Inoculer 10 ml de bouillon LB dans un tube conique de 50 ml avec la boucle contenant la seule colonie bactérienne.
7. Incuber le bouillon dans un incubateur à agitation pendant 16 heures à 30 ° C et 160 rpm.

3. Formation biofilm sur la surface

1. Prenez chacune des puces préparées avec des pincettes et les tremper dans 70% d'éthanol 5 fois pendant 1-2 secondes chacune, pour stériliser la surface de chaque puce. Veiller à ce que les copeaux sont maintenus avec des pincettes pendant le trempage.
2. Tremper chaque puce dans l'eau DI autoclavée et bouillon LB séquentiellement, 5 fois pour 1-2 sec chacun, pour évacuer le reste de l'éthanol.
3. Placez ces puces dans des plaques de culture à 6 puits avec 2 puces et 5 ml de bouillon LB par puits.
4. Diluer la culture bactérienne jusqu'à ce que la concentration dans le bouillon atteint LB8 × 10 ⁸ cellules / ml (densité optique à 600 nm de longueur d' onde: ~ 0,8).
5. Inoculer chaque puits avec 50 ul de la culture bactérienne diluée.
6. Incuber les plaques à 30 ° C sans agitation pendant 24 heures pour la formation de biofilms.

Nettoyage 4. CO ₂ Aérosol

1. Tremper les copeaux de biofilm formé dans un tampon d'acétate d'ammonium 10 mM (volatils) 5 fois pour éliminer vaguement attachés et bactéries planctoniques.
2. Sécher ces puces dans une enceinte de sécurité biologique, où l'air circule légèrement.
3. Immédiatement après le séchage, placer une puce sur le lieu de chargement, qui est de 20 mm de la buse CO ₂ le long de l'axe du jet. Inclinez l'axe du jet à un angle de 40 °.
4. Régler la pression de stagnation du _CO2 et du _N2 gazeux à 5,3 MPa et 0,7 MPa, respectivement, en utilisant des régulateurs de pression des gaz.
5. Appliquer le jet d'aérosol sur la partie centrale de la puce. Aérosols blancs , y compris le CO ₂ solide devraitêtre visible. Tourner "sur" l'électrovanne pour le CO ₂ pendant 5 secondes, puis remettez- le "off" pendant 3 sec (cycle de : 8 sec) en utilisant périodiquement un interrupteur commandé manuellement. Si une purge d'azote doit être utilisé, allumer l'électrovanne pour une alimentation continue de _N2.
6. Traiter les copeaux avec du CO ₂ pour aérosols 16, 40 et 88 secondes , avec ou sans purge d'azote. Maintenir des puces sans traitement comme témoins négatifs.

5. Analyse de l'efficacité de suppression

1. Préparer 1 uM colorant d'acide nucléique fluorescence verte (excitation / émission de longueur d'onde: 480/500 nm) dans l'eau DI pour colorer les cellules bactériennes sur le contrôle et les puces d'aérosol traité.
2. Placer les morceaux dans la solution de coloration.
3. Incuber les puces dans un incubateur sans lumière à 37 ° C pendant 30 min.
4. Après l'incubation, rincer délicatement les morceaux avec de l'eau DI circulant pour éliminer un colorant fluorescent excessive.
5. Sécher les puces wie N ₂ flux de gaz.
6. Prenez fluorescence images microscopiques de 5 champs aléatoires de vue (321 × 240 um ²⁾ pour chaque puce en utilisant un microscope à épifluorescence, un objectif 40X, et une caméra CCD.
7. Obtenir l'intensité de fluorescence pour chaque image en utilisant un logiciel de traitement d'image tel que ImageJ. Dans ImageJ, utilisez la fonction "Background Soustraire" dans le menu "Process", et sélectionnez "densité intégrée" dans la fenêtre "Définir les mesures" dans le menu "Analyser". Faites la "mesure" dans le menu "Analyser" pour obtenir l'intensité de fluorescence.
8. Calculer l'efficacité d'élimination de biofilm selon la formule suivante: 100% × (I jetons de contrôle - I de puces traitées) / (I jetons de contrôle), où I est l'intensité de fluorescence calculée.
9. Obtenir la moyenne des rendements d'élimination et les écarts types. Utilisez aumoins 4 jetons pour chaque cas.

Résultats

CO ₂ aérosols ont été utilisés pour enlever le P. putida biofilms de SUS304 surfaces (figure 1). La plupart des surfaces étaient recouvertes de biofilm après 24 h de croissance. La majeure partie du biofilm a été éliminé en utilisant le CO ₂ aérosols (figure 2). Comme on s'y attendait, la figure 3 montre une augmentation de l'efficacité de l' élimination de biofilm que le CO ₂ temps de traitement d'a...

Discussion

Previously, we conducted optimization studies on CO₂ gas pressure, jet angle, and distance to the solid surface in CO₂ aerosol cleaning⁷. Unlike our previous studies, in the present study, a nitrogen purge was not included in the aerosol (Figure 1). Moreover, 304 stainless steel was used in this protocol, since it is one of the most common stainless steels and is widely used in the food industry. The polished surface is beneficial for fluorescence analysis because of a un...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
304 stainless steel	Steelni (South Korea)		Polished and diced ones
Ultrasonic cleaner	Branson (USA)	5510E-DTH
Luria-Bertani (LB)	Becton, Dickinson and Company (USA)	244620	500 g
Agar	Becton, Dickinson and Company (USA)	214010	500 g
6-well culture plate	SPL Life Sciences (South Korea)	32006
Ammonium acetate buffer	Sigma-Aldrich (USA)	667404	10 mM
Dual gas unit	Applied Surface Technologies (USA)	K6-10DG	One nozzle for CO2 gas & 8 nozzles for N2 gas
SYTO9	Thermo Fissher Scientific (USA)	Invitrogen	Excitaion: 480 nm Emission: 500 nm
Epifluorescence microscope	Nikon (Japan)	Eclipse 80i
40X objective lens	Nikon (Japan)	Plan Fluor	NA: 0.75
CCD camera	Photometrics (USA)	Cool SNAP HQ2	Monochrome