Floresans tabanlı Nöraminidaz İnhibisyonu Tahlili antivirallerin nöraminidaz inhibitörü Class Nezle Virüslerinden eğilimi değerlendirilebilir

Özet

Biz antivirallerin nöraminidaz inhibitörü sınıfına influenza A ve B virüsleri duyarlılığını değerlendirmek için bir fenotipik flüoresan bazlı nöraminidaz inhibisyonu deneyi kullanılmasını tarif eder.

Özet

nöraminidaz (NA) önleyicisi, dolaşımdaki suşlara karşı etkili olan grip tedavisi ve profilaksisi için onaylanmış antiviraller sadece sınıfıdır. mevsimsel grip tedavisinde kullanımlarına ek olarak, NA inhibitörleri bir pandemi durumunda kullanılmak üzere bir dizi ülke tarafından biriktirildi. Antiviral bu sınıfa grip virüsleri dolaşan duyarlılığını izlemek için önemlidir. Orada NA inhibitörlerine influenza virüslerinin duyarlılığını değerlendirmek için kullanılabilir deneyleri farklı türleri vardır, ancak bir floresan substrat veya kemilüminesan substrat kullanılarak enzim engelleme tahlilleri en yaygın olarak kullanılan ve tercih edilir. Bu protokol, NA inhibitörlerine influenza virüs duyarlılığı değerlendirmek için bir floresan bazlı tahlilin kullanımını tarif eder. Munana ((4-metilumbelliferil) -α-D-N -acetylneuraminic asit - Deney 2 'yaran NA enzim dayanır) Floresan ürünü 4-metilumbelliferon (4-MU) serbest bırakmak için alt-tabaka. Bu nedenle, influenza virüsü üzerine düzenlenen an NA inhibitörü önleyici etkisi bir _IC50 değeri olarak verilir NA aktivitesinin% 50'sini azaltmak için gerekli olan NA önleyici konsantrasyonu, göre belirlenir.

Giriş

Hemaglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA), grip A ve B virüsleri, iki ana yüzeyi glikoproteinleridir. NA, hücre yüzeyi ¹ galaktoz sialik asit bölünmesiyle virüsü serbest iken, HA, hücre yüzeyi glikoproteinleri ya da glikolipidler sialik asit-galaktoz bağlanır. UA inhibitörleri rasyonel ve böylece virüs progenisinin salınmasını ve yayılmasını önlemek, UA, enzimatik olarak aktif siteye sıkı bir şekilde bağlamak için tasarlanmıştır grip antiviraller sınıfıdır. Oseltamivir ve zanamivir tedavisi ve grip profilaksisi için dünya çapında birçok ülkede onaylanmıştır iki NA inhibitörleri. Son yıllarda, iki ek NA inhibitörleri, peramivir ve laninamivir, ülkelerin sınırlı sayıda kullanım için onaylanmıştır. NA inhibitörlerine karşı duyarlılık ve direnç kazandıran mutasyonun belirlenmesi için grip virüsleri taranması belirlenmesi ve etkiliğin izlenmesinde önemlidirantiviral bu sınıfın eness.

Son 16 yıl içinde, flüoresan bazlı NA engelleme deneyi, grip virüsleri, dolaşımdaki arasında antiviral duyarlılık değişen eğilimini izlemek için Influenza, Melbourne (Melbourne WHOCCRRI) ile Referans ve Araştırma Merkezi WHO rutin gerçekleştirilmiştir. Yıllık olarak yaklaşık 2.000 grip virüsleri antiviral duyarlılık için test edilir. 2007-2008 Kuzey Yarıküre influenza mevsiminde, önceki mevsim A (H1N1) virüs sayısında bir artış vardı, ancak en fazla grip mevsimlerde, virüslerin>% 98, dört NA inhibitörü ^{2, 3, 4} yatkındır o oseltamivir ⁵ düşük yatkınlık almıştı. 2008 yılı sonuna kadar dünyanın geri kalanına yayıldı NA amino asit ikamesi H275Y içerdiği virüs grubu, oseltamivir inappropri yapmaBu virüsün tedavisi için küresel yedi. Şu anda, grip B, influenza A (H3N2), ve grip A dolaşan büyük çoğunluğu (H1N1) pdm09 suşları oseltamivire hassas olsalar da, her ne kadar oseltamivir düşük kazandıran NA amino asit ikamesi H275Y ihtiva eden A (H1N1) pdm09 varyantlarının topluluğu kümeleri ve peramivir duyarlılık, dünyanın ^{6, 7} çeşitli yerlerinde bildirilmiştir.

Çünkü yeterince yüksek bir virüs titresi için ihtiyaç, (hayvan nazal yıkama da dahil olmak üzere), klinik numuneler, hücre kültürü içinde geçirilir veya antiviral duyarlılık testi öncesinde tavuk yumurtası embriyolu gerekir. Bu makalede açıklanan NA engelleme deneyi, üç bölüme ayrılabilir:

Belirli bir florometrede floresan ürünü 4-metilumbelliferonun (4-MU) doğrusal aralığının belirlenmesi
Nedeniyle Fluorometreler arasındaki içsel farklılıklar nedeniyle, tO floresan son ürünün, 4-MU ve nispi floresan ünitesi (RFU) doğrusal aralık oluşturulması gerekmektedir. 4-MU için lineer aralığı bir kez kurulduğunda, en uygun hedef sinyal influenza virüsleri konsantrasyonu, NA aktivitesi deneyinde ayarlanır hangi seçilir. Belirli flüorometrede için Tamamlandığında, bu tekrarlanması gerekmez.

virüslerin NA aktivitesini belirleme
Seri virüsleri seyreltildi (4Metilumbelliferil) -α-D-N -acetylneuraminic asit (Munana) substratı - yoktur aktivite deneyi 2 'eklenmesini içerir basit bir testtir. NA ile Munana parçalanmasından elde edilen floresan son ürün 4-MU miktarı, bir florometre kullanılarak ölçülür. NA engelleme tahlilinde kullanılacak uygun virüs seyreltme virüsü seyreltme karşı floresans birimleri çizilerek seçilir. üretilen sigmoid eğriden, doğrusal kesitin orta noktası uygun olmalıdırflorometre 4-MU lineer aralığı bölüm 1 'de tayin ve bölüm 3'te kullanılmak üzere virüslerin uygun bir konsantrasyonunu bilgilendirir.

NA engelleme analizi kullanılarak NA inhibitörlerine değerlendirilmesi virüs duyarlılığı
Belirli bir NA inhibitörü virüslerin duyarlılığını değerlendirmek için, bölüm 2'de belirlenen seyreltide virüs NA inhibitörü bir konsantrasyon aralığında ile inkübe edilir. Munana ile daha sonraki bir inkübasyonun ardından, inhibe edilmemiş virüs tarafından üretilen 4-MU florometre ile RFU ölçülür. Bir virüsün NA enzim aktivitesi NA inhibitörün inhibe edici etkisi, bir _IC50 değeri olarak verilir NA aktivitesinin% 50'sini azaltmak için gerekli olan NA önleyici konsantrasyonuna göre hesaplanır.

Protokol

1. Belirlenmesi bir Fluorometer'de Floresan Ürün 4-MU Lineer Aralığı

1. mutlak etanol, 5 ml 4-MU 11.3 mg eritilmesi ile 6.4 mM 4-MU stok çözeltisi, 10 mL hazırlayın. (Ağırlık / hacim) stok çözeltisi, 10 mL yapmak için% 0.9 NaCl 5 mL ekleyin. 9 mL 1x deney tamponu (33.3 mM 2- (N-morfolino) etansülfonik asit (MES) ve 4 mM _CaCl2, pH 6.5) içinde 6.4 mM 4-MU 1 mL seyreltilerek çalışma çözeltisi 640 uM hazırlayın.
   Not: MES, 13 g damıtık suyun 8 mL 1 M CaCb ₂ 992 ml ilave edilerek 2 x deney tamponu hazırlayın. NaOH, 10 M ile pH 6,5'e ayarlanır. gözenek boyutu 0.2 um steril selüloz asetat filtre kullanılarak tampon filtre. Dikkat! Sodyum hidroksit, kostik ve deriye ve gözlere kimyasal yanıklara neden olabilir. O tam kişisel koruyucu ekipman yıpranmış olduğundan emin olun.
2. 4-MU konsantrasyonda (yani, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM, 160 # bir dizi 5 mL hazırlanması181; M ve 1 x deney tamponu kullanılarak 640 uM 4-MU bir, iki kat seri seyreltme ile 320 uM).
3. 4-MU (yani, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM, 160 uM, 320 uM ve 640 uM), berrak içerisine (seyreltme başına iki oyuk), 96- her seri seyreltme, 50 uL dağıtın gözlü düz tabanlı levhada ve (arka plan sinyallerini ölçmek için boşlukları olarak hizmet eden) geri kalan kuyular içine 1 x deney tamponu 50 uL.
   Not: reaksiyon hacmi içinde 4-MU son konsantrasyonları (50 uL 4-MU + 50 uL 300 uM Munana), 160 uM ve 320 uM 2.5 uM, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 40 uM, 80 uM olan .
4. damıtılmış suyun 20 mL Munana 25 mg sulandırılması ile 2.5 mM MUNANA stok çözelti hazırlayın. 300 uM Munana çalışma çözeltisi (bir plaka için yeterli hacmi) elde etmek üzere 5.28 mL 1x deney tamponu ile 2.5 mM MUNANA 0.72 mL karıştırın. 300 uM Munana workin içeren tüp Kapakhemen kullanılan sürece g alüminyum folyo ile çözeltisi ve buz üzerinde tutun. herhangi bir artık malzeme atılır.
   Not: 2.5 mM MUNANA stok çözeltisi, 1 ay boyunca -20 ° C 'de muhafaza edilebilir ve bir donma / erime döngüsüne içinde kullanılmalıdır. 4-MU ve Munana çözeltiler ışığa duyarlı olan ve uzun süreli ışığa maruz kalmaktan korunmalıdır.
5. hafifçe karıştırmak için dokunun her kuyuya 300 uM Munana 50 mcL ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Buharlaşmayı önlemek için bir plaka kapatıcı ile örtün plaka.
   NOT: Bu adım, NA engelleme tahlilinde eşiğe hesaba etmektir.
6. 0.824 M NaOH 2.225 mL (bir plaka için yeterli hacim) ile mutlak etanol 11 mL karıştırılarak durdurma çözeltisi hazırlayın.
7. Reaksiyonu durdurmak ve hafifçe karıştırmak için dokunun her stop solüsyonu 100 mcL ekleyin.
8. PE olarak, 355 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ayarı ve 460 nm'lik bir emisyon dalga boyu ayarlı bir florometre kullanılarak plaka okumaÜreticinin talimatlarını r.
9. bir 4-MU içeren bütün yuvalara floresans sinyalleri kullanan ortalama arka zemin sinyali hesaplayın. 4-MU ihtiva eden yuvaların her biri bu ortalama arka zemin sinyali çıkarma ve her 4-MU konsantrasyonu için ortalama sinyal (RFU) hesaplar. Şekil 1a'da gösterilen 4-MU konsantrasyonu (uM) karşı RFU bir standart eğri çizilir; Eğrinin yakından lineer kesiti Şekil 1b 'de gösterilmiştir.
10. doğrusal aralığını ve optimum hedef sinyalini belirlemek için 4-MU konsantrasyonu (uM) karşı RFU arsa Görselleştirin; lineer aralığı olduğu arsa üzerinde 4-MU artan konsantrasyonları ile orantılı olarak floresans sinyali arttıkça, en uygun hedef sinyal doğrusal aralığı içindeki bir rasgele 4-MU konsantrasyonu ise.
    NOT: doğrusal aralık ve optimal hedef sinyal florimetre özeldir. Örneğin, Melbourne WHOCCRRI de florimetre 2 doğrusal bir aralığı vardır0,5-40 uM 4-MU ve ~ 1.500 RFU tekabül ~ 30 uM 4-MU, optimal hedef sinyal.

2. Virüs NA Etkinliğinin Belirlenmesi

NOT: Grip virüsleri Madin-Köpek Böbrek (MDCK) hücreleri veya embriyo halindeki tavuk yumurtalarının ^8'de yeterli titrelerine için kültürlenir.

1. % 0.1 TFA içeren 1. sütun içine seyreltilmemiş kültür influenza virüslerinin oyuk başına 120 uL ve 1 x deney tamponu 60 uL dağıtın NP-40, 96 oyuklu U tabanlı bir plakanın geriye kalan 11 sütun halinde.
2. Seri olarak plaka boyunca virüslerin, iki kat seyreltme yerine (örneğin, sütun 2 sütun 1 60 uL transferi ve benzeri, sütun 11 kadar) sadece 1 x deney tamponu içeren bir boş olarak kolon 12 bırakarak bir çok kanallı pipet kullanarak.
3. berrak, 96-çukurlu, düz-tabanlı bir plakaya oyuklara (seyreltilmiş virüs ve boşluklar) her biri 50 uL aktarın.
   NOT: Bu c gerekli değildirMalzemeler 1. sütun üzerine kolon 12'den transfer edilmesi halinde hange pipet uçları.
4. oyuk başına (1.4 adım göre hazırlanmıştır), 300 uM Munana 50 uL eklenir ve hafifçe karıştırın plaka dokunun. 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe plakası. Buharlaşmayı önlemek için bir plaka kapatıcı ile örtün plaka.
5. reaksiyonun sona erdirilmesi ve yavaşça plaka karıştırmak için dokunun göz başına (adım 1.6 uygun olarak hazırlandı) durdurma çözeltisi, 100 uL ekleyin.
6. Bir fluorometreyle plakasını okuyun.
   1. 355 nm'lik bir uyan dalga boyu ayarı ve 460 nm emisyon dalga boyu ayarını kullanın.
7. 12. kolonunda floresans değeri göre ortalama arka zemin sinyali belirlemek ve her bir ortalama arka plan sinyali çıkarılır. Virüs dilüsyonları karşı RFU grafiğini çiziniz.
   Not: WHOCCRRI Melbourne 100 uM Munana için arka plan değerleri 50 ve 120 RFU arasında, tipik olarak, ancak bu florimetre bei bağlı olarak farklılıkng kullanılır.
8. Her bir virüs (Şekil 2) için eğrinin doğrusal bölümünün orta-noktasını belirlemek için virüs seyreltmeleri karşı RFU arsa gör. referans noktası olarak (aşama 1 'de belirlenen) en uygun hedef sinyali kullan.
   Not: Bu bölüm 1 'de tayin florometre 4-MU lineer aralığı uygun olmalıdır ve virüslerin uygun bir konsantrasyon bölüm 3'te kullanılmak üzere sağlar.

3. NA önleme deneyi kullanılarak NA İnhibitörlerine Virüs duyarlılık değerlendirilmesi

1. 300 uM konsantrasyonlarda NA inhibitörlerinin ana stoklarının hazırlanması.
   1. 50 ml 2 x deney tamponu (66.6 mM MES ve 8 mM _CaCl2, pH 6.5) zanamivir 5.0 mg eritilmesi ile 300 uM zanamivir (molekül ağırlığı, molekül ağırlığı = 332,32 g / Mol) hazırlayın.
   2. 2 x deney tamponu, 50 mL 5.8 mg çözülmesiyle (MW = 386,44 g / mol D-tartrat) 300 uM oseltamivir karboksilat hazırlayın.
   3. hazırlamak300 uM peramivir trihidrat (MW = 382,45 g / Mol) 2 x deney tamponu, 50 mL 5.7 mg çözülmesiyle.
   4. 2 x deney tamponu, 50 mL 5.2 mg çözülmesiyle 300 uM laninamivir (MW = 346,34 g / Mol) hazırlayın.
      Not: NA inhibitörü ana stoklar 12 ay boyunca -20 ° C 'de muhafaza edilebilir. Doğru ağırlıkları ve hacimleri, yeniden kullanılır sağlamak NA inhibitörü MW edin. Oseltamivir karboksilat ön-ilaç, oseltamivir fosfat aktif bileşiktir. Bu nedenle, sadece oseltamivir karboksilat NA engelleme tahlilinde kullanılmalıdır.
2. master stoklar kaynaktan, 0.03 nM, 0.3 nM, 3 nM, 30 nM, 300 nM, 3,000 nM konsantrasyonlarda 50 ml lik santrifüj tüpleri içinde NA inhibitörü olarak on kat seri seyreltmeler stokları çalışma hazırlanması ve 2x deneyde 30.000 nM tampon (66.6 mM MES, ve 8 mM _CaCl2, pH 6.5); Bu çoklu tahliller arasında kullanım içindir.
   Not: Reaksiyon volum NA inhibitörü nihai konsantrasyonlarıE (virüs seyreltme 300 uM Munana + 50 uL NA inhibitörü + 50 uL 50 uL), sırasıyla 0.01 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1,000 nM ve 10,000 nM bulunmaktadır. nihai konsantrasyon durdurma çözeltisi, 100 uL içermez. 2-8 ° C sıcaklıkta bütün NA inhibitörleri dilüsyonları saklayın. Son kullanma tarihi ana stoklarının aynıdır.
3. 96 derin oyuklu blokta% 0.1 NP-40 yüzey aktif madde ihtiva eden 1 x deney tamponu içinde virüs seyreltim dizileri hazırla. Dört NA inhibitörlerini test etmek virüs başına 2 mL toplam hacim kullanma bölüm 2. türetilen NA etkinlik tahlili sonuçlarına göre virüs seyreltmeleri kullanın.
   NOT: 96 derin oyuklu bloğunda virüs başına iki kuyu (oyuk başına 1 ml) hazırlayın. VİRÜS 1, 2 ve 3 için virüs seyreltmeleri örnekleri Tablo 1 'de gösterilmiştir.
4. 8, derin gözlü rezervuara (adım 3.2 uygun olarak hazırlandı) NA inhibitörlerinin gerekli hacmi koyun. Oradan, değişen seyreltiklerinde 50 uL NA inhibitörlerinin dağıtmak 0 nM (2x deney bUffer sadece) berrak, 96-çukurlu, düz-tabanlı plaka içindeki H'ye kadar olan sıralara A 30,000 nM.
   Not: levha düzeni, Şekil 3'te gösterilmektedir.
5. İyice karıştırın ve 45 dakika için oda sıcaklığında inkübe plaka dokunun yalnızca sütun 12. sütunlar 1-11 ve 1 x deney tamponu oyuk başına 50 uL oyuk başına seyreltilmiş test virüslerinin 50 uL ekleyin. Buharlaşmayı önlemek için bir plaka kapatıcı ile örtün plaka.
6. oyuk başına (1.4 adım göre hazırlanmıştır), 300 uM Munana 50 uL eklenir ve hafifçe karıştırın plaka dokunun. 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe plakası. Buharlaşmayı önlemek için bir plaka kapatıcı ile örtün plaka.
7. karıştırmak için plaka dokunun de hafifçe her birine (adım 1.6 uygun olarak hazırlandı) durdurma çözeltisi, 100 uL ekleyin.
8. Bir fluorometreyle plakasını okuyun.
   1. Daha önce tarif edildiği gibi, 355 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ve 460 nm'lik bir emisyon dalga boyunu kullanarak.

4. HesaplamaIC ₅₀ Değerler

Not: JASPR v1.2 _IC50 değerlerinin hesaplanmasını sağlar eğri uydurma yazılımı. yazılım CDC, Atlanta, ABD Grip Bölümü tarafından geliştirildi. Yazılım denklem kullanır: H = _Vmaks x (1 - ([I] [l])) / _(K +), V _max metabolizması maksimum hızı olduğu, [I], V inhibitör konsantrasyonudur olan yanıtı inhibe edilen, ve _K inhibisyon eğrisi için _IC50.

1. Kopyalama ve 12 kolon plaka biçiminde (96-gözlü) 'de bir elektronik tabloya florometre tarafından üretilen ham verileri yapıştırın hücre A1 ile başlanarak hazırlandı.
   NOT: sonraki her plakadan Ham veri bir sıra boş sendeleyerek edilmelidir. buradaki her bir virüs, dört NA inhibitörü karşı test edilmişse, (her bir plaka arasında boş bir sıra ile) dört bir kümesindeki ham verileri yapıştırın.
2. uydurma yazılım ve cl açın"Deney" sekmesine Ick. "Alternatif 2-ilaç Flor 11 Örnekleri" ı seçin.
3. "Seçenekler" sekmesini tıklayın ve kene "Grafikler oluşturun."
4. "Seçenekler" tekrar tıklayın ve "Yeni Anahtar" sekmesine tıklayın. Ham veriler tablo dosyası ile aynı klasörde "inhibition_key" .csv dosyası olarak kaydedin.
5. inhibition_key dosyasında, ID altındaki tüm örnek adlarını listeler. Her örnek adı benzersiz olmalıdır.
6. Dört NA inhibitörleri test edilmiştir ise, Oseltamivir altında iki ek satır için boşluk eklemek ve "peramivir" ve tip "Laninamivir." inhibition_key dosyaya yapılan değişiklikleri kaydedin.
7. "Jaspr v 1.2-İnhibisyon Eğri uydurma" penceresi dönün ve olarak "Deney Dosya" ve inhibition_key olarak ham veri dosyasını seçin "Anahtar Dosyası." analizini çalıştırın. .csv ve .pdf formatlarında sonuçları kaydedin.
   NOT: yazılım otomatik bir inhibisyon eğrisini çizmek olacaktır (RFU agaiNST NA inhibitörü konsantrasyonları), Şekil 4'te gösterildiği gibi. Bu program aynı zamanda tek bir NA inhibitörü (Şekil 4) karşı her bir virüs için _IC50 değerlerini hesaplar. Buna ek olarak, JASPR _IC50 değerleri ve tablo biçiminde sinyal-arka plan (S / B) oranı sunmaktadır. Arka plan değerleri kullanılır florometrede bağlı laboratuardan laboratuara farklılık gösterebilir. Melbourne WHOCCRRI anda, arka plan 50 ila 120 RFU 100 uM Munana aralığı için değer verir. 10'dan daha az bir oran, özellikle çok düşük bir NA aktiviteye sahip mutant virüs, yine de kabul edilebilir olmasına rağmen güvenilir bir _IC50 değeri, ≥10 bir S / B oranı tercih edilir.
8. _IC50 değerleri ve yazılımı ile üretilen eğri şekiller kontrol edin. Bütün veri noktaları, ilgili düşebilir veya eğrisine yakın olmalıdır; Eğer başaramazlarsa, NA önleme deneyi tekrarlayın.
   NOT: olağanüstü yüksek IC ₅₀ değerlerini gösteren virüsler için tahlil tekrarı olmalıed sonucu teyit etmek.

Sonuçlar

Grip Antiviral Duyarlılıkları ⁹ Gözetimi üzerine WHO Çalışma Grubu standardize raporlama kurallarına kullanarak, NA inhibitörlerine grip virüslerinin duyarlılık şartlarını normale inhibisyon (NI), azaltılmış engelleme (RI) ve yüksek oranda azaltılmış inhibisyon kullanılarak rapor edilir (HRI) . NI virüsleri ₅₀ değerleri en az 10 kat daha influenza A virüs (veya grip B virüsleri, 5-kat daha az) için _IC50 orta referans ile karşılaştırıldığında IC sahip olanlardır. RI virüsleri 10- ve influenza A virüs (veya 5- ve grip B için 50-kat) için _IC50 orta referans yaklaşık 100 kat arasında _IC50 değerlerine sahip olanlardır. HRI virüsleri 100 kat ₅₀ değerleri, influenza A virüs (veya grip B virüsleri 50 kat üzerinde) _IC50 orta referansla yukarıda IC sahip olanlardır; Tablo 2 ye bakınız.

IC medyan referans A (H1N1) pdm09, A (H3N2) ve B Yamagata / B Victoria virüsleri için ₅₀ değerleri _IC50 değerleri küçük değişiklikleri yansıtacak şekilde hesaplanmış ve Melbourne WHOCCRRI de yıllık olarak güncellenir NA inhibitörlerine influenza suşlarına dolaşım (Tablo 3). İnfluenza A (H1N1) medyan _IC50 değerleri pdm09 virüsleri dört NA inhibitörleri arasında hemen hemen aynıdır, ancak orta zanamivir ve laninamivir IC A (H3N2) virüs ₅₀ değerleri oseltamivir kıyasla 4 kat daha yüksektir 2- ve peramivir _IC50 değerleri (Tablo 3). İnfluenza B virüsleri için orta oseltamivir _IC50 değeri, genel olarak 5 ila zanamivir peramivir ve laninamivir _IC50 değerleri (Tablo 3) daha yüksek 10-kat fazladır.

NA engelleme deneyi genetik değişiklikler Associ hakkında bilgi sağlamaz bir fenotip deneyidirUR veya İHK yol açabileceği. Nedenle, genetik analiz UR veya İHK ile virüslerin tespiti aşağıdaki yapılır önemlidir. Melbourne WHOCCRRI anda, varyantların NA geni Sanger sıralama ve piro-dizileme kullanılarak analiz edilir. R 've HRI varyantları ile virüslerin NA geninin bulunabilir amino asit ikamelerinin temsili bir listesi, Tablo 4'te sunulmuştur. NAI duyarlılık değiştirebilir amino asit ikamelerinin daha geniş bir listesi de WHO websitesini ¹⁰ mevcuttur.

Şekil 1: 4-MU konsantrasyonuna karşı RFU. 4-MU konsantrasyonu (uM) karşı RFU (a) standart eğrisi. noktalı kutu florometre 4-MU doğrusal aralığını gösterir. doğrusal aralığı üzerinde floresan sinyalleri, doymuş ve bu nedenle, herhangi bir s edilebilirfloresan içinde alışveriş merkezi değişiklikler florometreyle tespit edilmeyebilir. (B) tanımlanması için Şekil 1a, standart eğrinin yakın çekim doğrusal bölüm "en uygun hedef sinyali". Melbourne WHOCCRRI de florimetre 2,5-40 uM 4-MU bir doğrusal aralığı ve ~ 1.500 RFU tekabül ~ 30 uM 4-MU optimal hedef sinyal vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 2: influenza virüslerinin NA aktivitesi grafikler Örnek. 50.61 RFU ortalama arka plan değeri NA aktivite eğrisi üzerinde, her seyreltme noktasından çıkarılır edilmiştir. Oklar her bir virüs için NA engelleme tahlilinde kullanılacak uygun virüs seyreltme göstermektedir. daha kolay hazırlık içinVirüs dilüsyonları Preparasyonu, tek VİRÜSÜ 3 yerine 1/96 seyreltme için 1/100 seyreltme gerçekleştirmek tercih edebilir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 3: Mevcut inhibisyon deneyinin kurulumu için plaka düzeni. Her plaka bir virüs sadece 1 x deney tamponu (AB), UA inhibitörü, Munana ihtiva eden bir negatif kontrol olarak görev yapan son sütunu, içerir ve durdurma çözeltisi. NOT: JASPR _IC50 değerlerinin hesaplanmasında kullanılan ortalama boş sinyali belirlemek için her bir plakanın 12. kolonunda okumaları kullanır. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 4: A (H1N1) pdm09 virüsü A / Perth / 82/2015 bir inhibisyon eğrisi ve _IC50 değeri örneği. JASPR yazılım eğrisi içinde her bir nokta bir uyum için, UA inhibitörünün artan bir konsantrasyonu ile (nM) karşı floresan (RFU) ve inhibisyon eğrisini göstermektedir. NA önleyici konsantrasyonu, virüs NA aktivitesinin% 50'sini azaltmak için inhibisyon eğrisine göre, _IC50 değeri belirlenir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Virüs	Virüs seyreltilmesi gerekli	1x değerlendirme tampon maddesi hacmi (uL)	Yüzey aktif madde-Amp-NP-40 (% 10) (ml)	Virüs hacmi (ml)
1	20/01	940	10	50
2	1/40	965	10	25
3	1/100	890	10	10

Tablo 1: NA engelleme tahlilinde VİRÜS 1, 2 virüs seyreltmeleri hazırlanması ve 3.

Virüs tipi / alt tip / soy	Normal engelleme	Azaltılmış engelleme	Son derece düşük inhibisyon
	(NI)	(Rİ)	(HRI)
A (H1N1) pdm09	<10 kat	10-100 kat	> 100 misli
A (H3N2)	&60.; 10 kat	10-100 kat	> 100 misli
B Yamagata ve B Victoria	<5 kat	5-50 kat	> 50 kat

Tablo 2: WHO Antiviral Çalışma Grubu NA inhibitörlerine grip virüsü duyarlılık sınıflandırılması için kurallar önerilir.

Virüs tipi / alt tip / soy	N-	Zanamivirin	oseltamivir	peramivir	Laninamivir
		Medyan (aralık) nM IC50	Medyan (aralık) nM IC50	Medyan (aralık) nM IC50	Medyan (aralık) nM IC50
A (H1N1) pdm09	1326	0.42 (0,1-3,43)	0.36 (0,01-3,48)	0.19 (0,07-1,60)	0.55 (0,05-2,29)
A (H3N2)	1654	0.9 (0,11-4,0)	0.38 (0,01-3,65)	0.33 (0,12-3,06)	1.38 (0,01-9,38)
B Yamagata ve B Victoria	1115	2,2 (1,24-10,72)	15,12 (2.39-70.75)	1.36 (0,57-6,67)	2.89 (1,62-9,15)

Tablo 3: Normal inhibisyon medyan _IC50 ve _IC50 aralık 2015 (NI) virüsleri WHO CCRRI Melbourne, elde edilen.

Amino asit ikamesi	Tür / alt tip / soy	IC50 kat-değişimi komedyan IC50 değerleri referans mpared.
		Zanamivirin	oseltamivir	peramivir	Laninamivir
H275Y	A (H1N1) pdm09	1	557 (HRI)	123 (HRI)	2
E119V	A (H3N2)	1	63 (RI)	1	1
H134Y	B Victoria	1	4	76 (HRI)	2
N151T	B Victoria	4	4	42 (HRI)	1
G104E	B Victoria	1.220 (HRI)	87 (HRI)	17.724 (HRI)	701 (HRI)
E105K	B Victoria	3	5 (RI)	59 (HRI)	2
I222T	B Victoria	2	7 (RI)	8 (RI)	3
H273Y	B Yamagata	1	230 (HRI)	377 (HRI)	2
D197N	B Yamagata	4	7 (RI)	32 (RI)	3

Tablo 4: düşük inhibisyon (RI) veya NA inhibitörlerine oldukça düşük inhibisyon (HRI) bağlanmış bir amino asit ikamelerinin temsili listesi.

Sorun	Olası nedenler)	Çözüm (ler)
Hayır veya düşük NA etkinliği	Virüs, bu ya da düşük bir virüs verimi.	Klinik örnek hücre çizgileri kültürlenebilir (yani Madin Darby Köpek Böbrek hücreleri) veya embriyo halindeki tavuk yumurtalarının içinde olmalıdırNA engelleme tahlilinde kullanım için daha yüksek bir virüs yükü.
	Bazı mutant virüsler yüksek virüs yükünde rağmen son derece düşük NA aktiviteye sahiptir.	Test için düzgün virüs konsantrasyonunu kullanın. Düşük bir pH tamponu (örneğin pH 5.3) kullanılabilir. Verileri karşılaştırırken Ancak, dikkatli alınmalıdır.
Resim veya NA engelleme tahlilinde düşük NA aktivitesi	Hiçbir virüs eklendi.	virüs yeniden seyreltin. virüs emin direkt olarak 1 x deney tamponu ilave edilir.
	Yanlış virüs seyreltme kullanılmıştır.	NA aktivite deneyi tekrarlayın.
	Yetersiz inkübasyon süresi.	İnkübasyon süresi sağlamak izlemektedir.
Veri noktaları, IC50 eğri dışında kalan	daha yüksek bir konsantrasyonda NA inhibitörü çapraz kirlenme.	ipuçları NA inhibi ile temas halinde değildir emin oluntor 96 oyuklu bir plaka içerisinde seyreltilmiş virüs püskürtüldüğü zaman.
		8 derin kuyu deposu kullanılmışsa, atılır ve yeni bir 8 derin kuyu rezervuara inhibitör konsantrasyonu NA yeniden dağıtmak.
	NA inhibitörü veya Munana veya seyreltilmiş virüs hacmi her bir kuyunun içine eşit eklenmedi.	bir kalibre edilmiş çok kanallı pipet ile tahlil tekrarlayın. her bir reaktifin eşit hacimde her bir kuyunun içine tevzi emin olun.
Olağandışı yüksek IC50 değerleri	virüs çok yüksek konsantrasyonu ilave edildi.	UA aktivite deneyi ve NA engelleme deneyi tekrarlayın.
	Deney örneği grip A ve grip B'ye karışımlarını ihtiva	Virüs karışımlarının varlığı tespit etmek real-time PCR gerçekleştirin.
	numunedeki Bakteriyel kontaminasyon	antibiyotik varlığında ile steril bir durumda kültür virüsü.
Yüksek eşiğe sinyali	Munana alt-tabaka zaman içinde bozulabilir.	Munana alt-tabakanın yeni toplu kullanın.
	komşu kuyu floresans saptama.	siyah 96-gözlü düz dipli plakalar kullanın

Tablo 5: NA engelleme tahlilinde potansiyel sorunlar için sorun giderme.

Tartışmalar

NA inhibitörlerine grip virüsü duyarlılık küresel izleme anda flüoresan veya kimyasal olarak ışık veren NA engelleme deneyleri ^{11, 12} kullanarak Bir çok laboratuarda ile yürütülmektedir. floresan deneyi daha yaygın kimyasal parlaklık deneyinde daha kullanılır. Her iki testte de sağlam ve tekrarlanabilir olmasına rağmen, flüoresan bazlı deneyde elde edilen _IC50 değerleri ¹³ zor iki deneyden elde edilen verilerin doğrudan bir karşılaştırma yapmak, kimyasal ışıldama bazlı deneyde genellikle daha yüksektir. Hatta aynı protokol kullanılarak, bir laboratuardan elde edilen veri bir arasında değişebilir. Çünkü laboratuarlar arasında bu varyasyonların, WHO Çalışma Grubu Grip Antiviral DUYARLILIKLARININ Gözetim üzerinde laboratuvarlar arası karşılaştırmalar yardımcı olacak bir kılavuz üretti. Daha ziyade, bu kılavuz araç kullanımı mutlak _IC50 değerleri karşılaştırarak dahamedyan her bir laboratuarda test NI influenza virüslerinin _IC50 IC ₅₀ kat farka dayalı olarak sa karşılaştırması. Beş işbirliği merkezlerinden verileri karşılaştırmak yeteneği küresel Antiinfluenza duyarlılık verileri ^{2, 3, 4} yıllık yayın ile sonuçlanmıştır. Kamu malı grip duyarlılık verilerin büyük miktarda mevcudiyeti araştırmacılar kendi laboratuarlarında üretilen bu olanlar çalışmalardan _IC50 verileri karşılaştırmak için izin verir.

benzer bir kavram kabul Diğer NA engelleme analizleri de ticari olarak mevcuttur. Hazır kullanımlı reaktifleri içerir Bu ticari takımlar (NA dahil değildir inhibitörleri) eşit tekrarlanabilir. reaktiflerinin çoğu, in-house yapılabilir Ancak, in-house NA engelleme tahlil, ticari kitler büyük ölçüde daha ucuz olanDaha büyük miktarlarda ve daha önce tayinin büyük maliyeti oluşur Munana substrat, şimdi rekabetçi fiyatlarla çeşitli kaynaklardan satın alınabilir. ilaç başına bir grip izolatı test maliyetinin yaklaşık $ 1 (ABD) 'dir. Melbourne WHOCCRRI da gelişmeler tahlilin sıvı işleme bileşenleri için bir robot platformun dahil edilmesinin ardından in-house NA engelleme deneyi yapılmıştır. Yanı sıra virüs seyreltmeleri elle preparattan, prosedürlerin çoğu, sıvı işleme robotunu kullanılarak gerçekleştirilir. Bu el işçiliğini en aza indirmek, ama aynı zamanda bir günde çalıştırılabilir tahliller sayısını artırır kalmaz.

NA engelleme deneyi son derece sağlam olmakla birlikte, ek dikkatle tamamlanması gereken kritik adımlar bir dizi vardır. İlk olarak, inhibisyon eğrileri ve _IC50 değerleri kayabilir NA inhibitörü konsantrasyonlarında herhangi bir düzensizlik; Dolayısıyla, dikkatli dikkat edilmelidirNA inhibitörü konsantrasyonları hazırlanırken ödenir. İkinci olarak, doğru pipetleme ve hassas inkübasyon süreleri deneyleri tutarlı sonuçlar korunması için önemlidir; Bu kalibre pipetler ve zamanlayıcılar kullanılarak elde edilebilir. Her deneyde kontrol virüsleri dahil edilmesi de tahlilinden tahlile ve uzun süreler boyunca tahlil performansı izlenmesini sağlar. mevsimsel grip virüsleri NA enzim aktivitesi pH değeri 6.5 olan en uygunudur, çünkü Üçüncü olarak, deney tamponu doğru pH değeri önemlidir. Bazı raporlar, düşük değerli pH koşulları kullanılması, R292K mutasyon ^{14, 15} ihtiva eden bir (H7N9) varyant influenza varyantları belirlenmesini geliştirdiğini bulmuşlardır. Bununla birlikte, deney tamponu pH modifikasyon _IC50 değerleri kayacak ve bu lâboratuarlarda ve laboratuarlar arasında veri karşılaştırmasını güçleştirebilir. Diğer modifikasyonlar ve p olabilir sorunerformed Tablo 5'te listelenmiştir.

NA inhibitörleri şu anda grip virüsleri dolaşan karşı etkilidir onaylanmış antiviral sadece sınıfıdır. diğer antiviral sınıflar klinik kullanıma hazır hale kadar, grip virüsleri dolaşan antiviral duyarlılık gözetim yalnız NA inhibitörleri üzerinde durulacaktır. Çünkü basitlik ve sonuçların tekrar edilebilirlik, UA inhibisyon deneyinin kullanımı devam edecek NA inhibitörlerine grip virüsü duyarlılığını değerlendirmek için.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Influenza A and B viruses		Cultured in MDCK cells or 9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) eggs
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells	ATCC	PTA-6500
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA)	Biosynth AG	M-5507
2-(4-methylumbelliferyl)-a-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA)	Sigma	M8639
4-Methylumbelliferone (4-MU)	Sigma	M1381-25G
2-[N-morpholino]ethanesulphonic acid (MES hydrate) (free acid)	Sigma	M8250-250G
Calcium Chloride (Ca Cl2)	APS AJAX Finechem	127-500G
Surfactant-Amps-NP-40 (10% solution)	Thermo Fisher Scientific	PIE28324
Sodium Hydroxide (NaOH)	APS AJAX Finechem	482-2.5KG
Absolute Ethanol	APS AJAX Finechem	214-2.5L GL
96-well clear flat-bottom plates	NUNC	456537
96-well U-bottom plates	Greiner Bio-one	4650101
8 channel deep well block	Pacific Laboratory Products	RES-MW8-HP
96-well deep plates, 2.0 mL square wells	Pacific Laboratory Products	P-2ML-SQ-C
Plate sealers	Thermo Fisher Scientific	236366
Bottle-top vacuum filter system (cellulose membrane (nitrate), pore size 0.2 μm, membrane area 33.2 cm2, filter capacity 500 mL)	Sigma-Aldrich	CLS430758-12EA
Single-channel pipettes (1 µL - 1,000 µL)	Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius)
Multi-channel pipettes	Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius)	8 or 12 channel electronic and manual pipette (5 - 1250 µL volume)
Pipette tips (1 µL - 1,250 µL)	Variety of suppliers (eg. Eppendorf, Sartorius)
Disposable pipettes (10 mL and 25 mL)	Greiner Bio-one	P7740-200EA and P7865-200EA
Pipette controller	Eppendorf	4430000018
Centrifuge tubes 50 mL	BD Bioscience	352070
Racked tubes	Scientific Specialties, Inc.	1750-00
Fluorometer with excitation wavelength setting of 355 nm and an emission wavelength setting of 460 nm	TermoFisher Scientific	ASCENT FL 374
Ascent software	TermoFisher Scientific	5185410CD
Incubator set at 37 °C	Lab Supply	Biocell 1000
Zanamivir	GlaxoSmithKline	Request directly from the company
Oseltamivir carboxylate	Roche
Peramivir (BCX-1812)	BioCryst
Laninamivir (R-125489)	Daiichi-Sankyo
JASPR v1.2	Influenza Division at the CDC Atlanta, USA	freely available upon request (fluantiviral@cdc.gov)