Sitoplazmik Odakları Memeli Stres Granülleri Olarak Sınıflandırma Yöntemleri

Özet

Stres Granülleri (SG), çeşitli streslere maruz kalan hücrelerde oluşan doku dışı yapısal sitoplazmik yapılardır. SG'ler mRNA'lar, RNA-bağlayıcı proteinler, küçük ribozomal altbirimler, translasyona bağlı faktörler ve çeşitli hücre sinyal proteinlerini içerir. Bu protokol, iyi niyetli SG'leri tespit etmek, karakterize etmek ve ölçmek için çeşitli deneysel yaklaşımlar kullanan bir iş akışını tanımlamaktadır.

Özet

Hücrelere genellikle ani çevresel değişikliklerle meydan okunur. Stres koşullarına maruz kalan hücrelerde oluşan stres granülleri (SG), hücre içi metabolizma ve sağkalımın çeşitli yönleriyle ilişkilendirilir. SG'ler, hücresel sinyal yollarını, transkripsiyon sonrası gen ifadesini ve stres tepki programlarını modüle eder. Bu mRNA içeren granüllerin oluşumu doğrudan hücresel translasyona bağlıdır. SG birleşimi, inhibe edilen translasyon başlatma tarafından tetiklenir ve SG ayrılması, translasyon aktivasyonu veya inhibe edilmiş translasyon uzamayla desteklenir. Bu ilişki SG kompozisyonu ile daha da vurgulanır. Çekirdek SG bileşenleri, başlatma öncesi kompleksler, mRNA ve seçilen RNA bağlayıcı Proteinler (RBP'ler) durdu. SG montajının amacı, translasyonel olarak duran oda temizleme mRNA'larını saptayarak hücresel enerjiyi muhafaza etmek ve strese duyarlı proteinlerin geliştirilmiş translasyonuna izin vermektir. Additi'deDurgun çeviri preinitiation kompleksleri gibi temel bileşenlere, SG'ler diğer proteinlerin ve sinyal moleküllerinin bolluğunu içerir. SG oluşumundaki bozukluklar hücresel stres uyarlamasını bozabilir ve böylece hücre ölümünü hızlandırabilir. SG'ler ve benzeri RNA içeren granüller nörodejeneratif bozukluklar ve kanser dahil bir dizi insan hastalığına bağlıdır ve son zamanlarda RNA granül alt tiplerinin sınıflandırılmasına ve tanımlanmasına ilgi uyandırmaktadır. Bu protokol, memeli SG'leri karakterize etmek ve ölçmek için yapılan tahlilleri açıklamaktadır.

Giriş

Hücreler, strese tepki vermek için birçok mekanizma kullanmaktadır. Bazı tepkiler, transkripsiyon sonrası seviyede gerçekleşir ve mRNA translasyonunu ve / veya stabilitesini düzenleyen ^{1 , 2'yi içerir} . Stres modüle mRNA translasyonel durma ve bozulma, en sık karakterize Stress Granules (SGs) ³ , özel nonmembranöz hücresel odakların oluşumu ile ilişkilidir. SG'ler, strese tepki veren translasyonel olarak tutuklanmış hücrelere ( örneğin, oksidasyon, ısı şoku, besin açlığı ve viral enfeksiyon) translasyon yapmayan mRNA'ları konsantre eden sitoplazmik odaklardır ⁴ . Sıralanmamış mRNA'lara ek olarak, SG'ler translasyon başlatma faktörleri, RNA-bağlayıcı proteinler ve çeşitli sinyal proteinleri içerir ⁵ . SG'ler, inhibe edilmiş protein translasyonu ve değiştirilmiş RNA metabolizmasının biyolojik belirteçleridir ve hücre sağkalımı ve apoptoz, sinyal yolağı ile ilişkilendirilmiştirS ve nükleer süreçler ⁵ .

SG'ler dinamik varlıklardır ve oluşumu hücresel çeviri durumu ile sıkı sıkıya bağlıdır ⁶ . Görünüşte sağlam görünmelerine rağmen, çoğu SG proteini bileşeni saniyede bir kalış süresi ile hızlı bir şekilde içeri ve dışarı götürülür. SG'ler dakikalar ila saatler sürmesine rağmen, bileşenlerinin çoğu hızlı akış halindedir. Çeviri başlangıcının engellenmesi ve bunun sonucunda translasyon polisomlarının çözülmesi SG'lerin oluşumunu teşvik eder; Dolayısıyla, SG'ler polisomları tercüme etmekle dengelidir. Bu polisome / SG dengesi, iyi niyetli SG'leri diğer stres kaynaklı odaklardan ayıran anahtartır ^{6 , 7} .

Çevirinin başlatılmasının durdurulması, mRNA, çeviri başlatma faktörleri (eIF) ve 40S ribozomal altbirimleri (ler) i içeren, çeviri-yetkili ön başlatma komplekslerinin dönüşümünü gerektirir O-ismi 48S kompleksleri), SG'ler ^{4 , 6'ya} kaynaşabilen translasyonel olarak durmuş komplekslere (48S * kompleksleri) dönüştürür. SG'ler, 48S kompleks oluşumunun akış aşağısındaki iki farklı adımda translasyonel durma ile desteklenir: kapak bağlayıcı eIF4F kompleksinin işlevleriyle ( örneğin eIF4A altbirimini hedef alan) müdahale veya translasyon başlatma faktörü eIF2'nin α altbiriminin fosforilasyonu, bunların biri tarafından aracılık edilir Veya dört eIF2 kinazın daha fazlasını içerir. Stabil 48S komplekslerinin ( yani, 40S ribozomal altbirimler ve seçilen translasyon başlatma faktörleri) varlığı SG ^{8 , 9'un bir} işaretidir.

SG'ler viral enfeksiyonlar, nörodejenerasyon, otoimmünite ve kanser gibi çeşitli patolojik durumlarla bağlantılı olmuştur ^{3 , 10 , 11 ,}Ss = "xref"> 12 ^{, 13} . Birkaç SG bileşeninin mutasyona uğramış formları , nöronların nöronal ölümde etkin rol oynayabilen hücre içi patolojik kapanımları sergilediği nörodejeneratif hastalıklarla ( örn. Amiyotropik lateral skleroz) ilişkilidir ¹³ . Bazı virüsler, SG oluşumunu engellemek ve viral replikasyonu artırmak için SG bileşenlerini kaçırır ¹⁴ . Son çalışmalar aynı zamanda SG'leri kansere ¹⁵ ve kanserli hücre sağkalımına kemo- ve radyoterapi tedavileri ^{10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} bağlar. Bu bulgular SG biyolojisine büyük ilgiyi uyandırırken, yayınlanan raporların birçoğu, iyi niyetli SG'lerin oluşumunu diğer stres kaynaklı odaklardan ayırmak için önemli kontrollerden yoksundur.

SG'ler başlangıçta, T-hücresi ntra-hücresel antijen 1 (TIA-1) ve Poli-A-bağlayıcı Protein (PABP) de dahil olmak üzere seçilen mRNA-bağlayıcı Proteinler (RBP'ler) oluşan doku dışı sitoplazmik odak olarak tanımlandı; Çeviri başlatma faktörleri; Poliadenile mRNA; Ve küçük ribozomal altbirimler ^{4 , 6 , 21 , 22} . Geleneksel olarak, bileşimleri immün boyama ve floresan etiketli proteinlerin ektopik ekspresyonu ^{23 , 24} gibi tekniklerle belirlenmiştir. Son derece dinamik doğalarından dolayı, SG proteinleri ve / veya mRNA'ların immüno-yerelleştirilmesi ^, SG'leri ^{23 , 24} tespit etmek için tanımlayıcı metodoloji olmaya devam etmektedir. Bugüne kadar, birçok RBP ve diğer proteinler (120'den fazla farklı protein) SG bileşenleri ¹¹ olarak tanımlanmaktadır. Birçok SG lokalize proteinler, hem strese bağlı hem de bağımsız bir şekilde lokalizasyonlarını değiştirir ve diğer hücre içi bölmelerde ve odaklarda birikebilir, doğru SG belirteçlerini seçmek ve SG'leri diğer stres kaynaklı streslerden ayırmak için işlevsel kriterleri kullanmak önemlidir odak. İyi niyetli SG'ler mRNA, çeviri başlatma faktörleri ve küçük ribozomal altbirimleri içerir ve translasyonla dinamik denge içindedir.

Bu basit iş akışı, stres kaynaklı odakların iyi niyetli SG'ler olup olmadığını belirlemek için tasarlanmıştır. Bu iş akışı, SG'leri incelemek için yaygın olarak kullanılan hücreler olan U2OS hücrelerini kullanan birkaç deneysel yaklaşımı içerir. Bu hücreler, büyük bir sitoplazmaya sahip oldukları için nispeten düz oldukları için idealdirler ve cam lamellerine kuvvetle bağlanırlar. SG'leri incelemek için başka hücre türleri de kullanılabilir, ancak zamanlama, ilaç konsantrasyonu ve SG-çekirdeklenme proteinlerinin bolluğu arasındaki farklılıkların kinetiği ve bileşimi değiştirebileceğinin farkında olmak önemlidirsition. Ek olarak, bazı hücreler, bazı SG markerlerinin noktasal lokalizasyonuna neden olan kabarık bir görünüm veren hücre yüzeyindeki blebleri oluşturarak paraformaldehit fiksasyonuna tepki verir; Dikkatli bir analiz yapılmaksızın bunlar SG olarak yanlış sınıflandırılabilir. Bu, stres kaynaklı odakların iyi niyetli SG'ler olarak tanımlanması için gerekli tüm ölçütlerin değerlendirilmesinin gerekliliğini vurgulamaktadır. SG 20'yi teşvik eden bir kanser terapisi olan Vinorelbin (VRB) ve sağlam ve iyi karakterize edilmiş bir SG indüktörü olan Sodyum Arsenit (SA) bu protokoldeki deneyler için stres olarak kullanılır.

Kanonik SG'ler, sitoplazmik odaklarda kolokalize olan çoklu SG işaretçileri (hem proteinler hem de mRNA'lar) içerir. Bu protokol sırasıyla protein markerlerinin ve poliadenile mRNA ^22'nin lokalizasyonunu saptamak için hem immünofloresans hem de floresan yerinde hibridizasyon (FISH) kullanır. Kısaca, dolaylı immünofloresan antikorları ( yani,e. Birincil antikorlar) belirli bir proteine ​​özeldir. Daha sonra, florokromlara bağlanan ikincil antikorlar (genellikle türe özgü) birincil antikoru tanır ve hedef protein lokalizasyonunu ortaya çıkarır. Floresan mikroskopi, hücre içindeki lokalize sinyali saptamak için kullanılır. Farklı türlerde üretilen antikorların kullanılması ve bunları farklı renkte sekonder antikorlar ile bulgulanması, çoklu antikorların kolokalizasyo- nunu saptamayı sağlar ve protein hedeflerinin aynı yerde bulunduğu- nu gösterir ²³ . İyi niyetli SG'lerde yerelleştirilmek üzere doğrulanmış belirteçleri seçmek önemlidir.

BALIK, belirli bir RNA veya DNA sekansı ²⁵ ile baz çiftleşen etiketli bir prob kullanır. MRNA'yı tespit etmek için, bu protokol, mRNA'nın poliA kuyruğuna melezleşen (veya baz çiftleri) biyotinlenmiş bir oligo (dT) ₄₀ probu kullanır ( yani, poliA FISH). Streptavidin, biyotin için yüksek bir afiniteye sahip olduğu için, biyotinlenmiş prob, flüoresanla konjüge edilmiş streptavidin kullanılarak tespit edilir. SG'leri değerlendirirken, iyi niyetli SG'lerde olduğu gibi poliA FISH ile bir immünofloresansın bir SG işaretleyicisi tespit etmesi önemlidir, iki sinyal de aynı yerde bulunur.

Bu protokolü kullanarak, kolokalizasyonu birden fazla yolla değerlendirilir. Çok kanallı ( yani RGB: kırmızı, yeşil ve mavi) görüntüde, kolokalizasyon, örtüşen sinyalin rengini değiştirecektir ( örn., Birleştirilmiş kırmızı ve yeşil sarı görünür) ²³ . Ek olarak, kolokalizasyon, çizgi tarama analizi kullanılarak grafiksel olarak nicelenir ve burada her bir renk yoğunluğu verilen bir çizgi ^{8 , 20'de} ölçülür. Bu protokol, ImageJ ²⁶ kullanan iki satır tarama analiz yöntemlerini tanımlamaktadır. Bir prosedür elle yapılmış ve tüm süreç boyunca devam etmektedir.Le, diğeri makroyu veya manuel adımları otomatikleştiren basit bir programı kullanır. Makro prosedürü anlamak için manuel programı incelemek önemlidir.

SG'ler, translasyonun bastırıldığı hücrelerde oluşur; Bu nedenle, SG'li hücreler, tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla azalmış küresel translasyon seviyeleri göstermelidir. Deneysel olarak ribopuromisilasyon kullanılır. Puromisin, fiksasyondan önce kısa bir süre boyunca hücrelere eklenir ve puromisin aktif olarak şekillenen polipeptidlere dahil olur ve böylece sonlanma ^{27 , 28 olur} . Yeniden başlatmayı önlemek için emetine uygulanması gerekir ²⁹ . Puromisin daha sonra anti-puromisin antikoru kullanılarak tespit edilebilmekte ve aktif translasyonun anlık görüntüsü verilmektedir. Bu yöntem hızlı olduğu için, belirli bir amino asitten yoksun (ve potansiyel olarak hücreleri ön gerilimine sokan) bir besiyeri ile öncesi aç bırakmayı gerektirmeyen veProtein translasyonunun subselüler lokalizasyonu. SG'leri içeren hücrelerin komşu hücrelere ³¹ kıyasla çok daha düşük translasyon sergilediğini göstermek için "tıklama-it" kimyası ³⁰ ile birleştirilmiş metionin analog L-azidohomoalain (AHA) gibi tadil edilmiş amino asit analoglarını kullanan diğer yöntemler kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu teknik metionin açlığın- dan sonra 15-30 dakika süreyle nabız etiketlemesi gerektirir. Metilin açlığı ilave bir stres oluştururken, uzun etiketleme zamanı ( yani 15-30 dakika), devam etmekte olan tercümenin kümülatif olarak ölçülmesine ve aynı zamanda yeni sentezlenmiş proteinlerin sentez alanlarından son hedeflerine hücre. Buna karşılık, ribopuromisilasyon çok daha hızlıdır ve glikoz açlığı ile SG'leri indüklemek için kullanılan glikozsuz ortam gibi herhangi bir ortamla uyumludur.

Kanonik SG'ler dinamik dengedeAktif olarak polisomları çevirirken. Bu deneysel olarak polisomları stabilize eden veya bozucu ilaçlarla örneklerle tedavi ederek değerlendirilebilir, böylece SG'ler ile polisomlar arasındaki dengeyi de yükseltir ²³ . Sikloheksimid (veya benzer şekilde davranan emetin) ribozomları mRNA üzerine "dondurarak" uzamayı engeller, böylece SG'leri oluşturabilen mevcut polisomal olmayan mRNP'lerin havuzunu düşürür. Deneysel olarak, bu iki şekilde kullanılabilir: SG oluşumunu önlemek için stres öncesi sikloheksimid (veya emetin) ekleyerek veya SG'ler oluştuktan sonra sikloheksimit (veya emetin) ekleyerek, gerilme maddesini çıkarmadan, SG'nin bozulmasına neden olan durmuş gibi Preinitiasyon kompleksleri yavaş yavaş polisom fraksiyonuna kabul edilir. Buna karşılık, puromisin, prematüre terminasyona neden olur ve polisome ayrışmasını teşvik eder ve SG'lere montaj yapabilen başlatıcı mRNA'ların havuzunu arttırır. Deneysel olarak, puromisin tedavisi, SG sayısını arttırır veya thresholü düşürürD olarak derecelendirilmiş stres veya ilaç dozajına tepki olarak form verdiklerini göstermektedir. Puromisin'in etkisini değerlendirirken, puromisin'in ilacın etkisini arttırması ve SG'leri gösteren hücrelerin yüzdesini arttırması beklendiğinden ilâçın maksimal bir alt seviyesinin kullanılması önemlidir; ilaç görülmezse bu gerçekleşemez / Stres başlangıçta hücrelerin% 100'ünde SG oluşturur. Bu, SG'leri parçalara ayıran ve hücrelerin ~% 95'inde başlangıçta SG'leri görüntülediğinde, mümkün olan en büyük düşüşün gözlenebileceği ve doğru şekilde nicelleştirilebileceği siklooksit tedavisi ile çelişir.

Bu protokol memelilerdeki SG'leri incelemek için bir çerçeve sağlar. Yöntemler şunları içerir: (1) varsayılan SG'lerdeki klasik SG ile ilişkili belirteçler eIF4G, eIF3b ve Ras GTPaz aktive edici protein bağlama proteini 1 (G3BP1) arasındaki kolokalizasyonu değerlendirmek için immünofloresan boyama ve ImageJ analizi; (2) oligo (dT) floresan in situ hibridizasyon (polyA FISH) poliadenile mRNA tespit etmek için; (3) stres kaynaklı odakların polisomlarla dinamik denge içerisinde olup olmadığını belirlemek için sikloheksid ve puromisin tedavisi; Ve (4) varsayılan SG'leri içeren hücrelerin translasyonel durumunu değerlendirmek için ribopuromisilasyon. Birlikte, bu tahliller, stres kaynaklı odakların iyi niyetli SG'ler olarak sınıflandırılabileceğini belirleyebilir.

Protokol

1. Hücre Hazırlama

1. Şekil 1A'da belirtildiği gibi otoklavlanmış lamelleri, 24 delikli bir plakanın 12 kuyucuğuna ekleyin; Bu, her lamelleri almak için bir vakuma tutturulmuş steril bir Pasteur pipeti kullanılarak yapılabilir. Lamerlerin kuyuya düşmesine izin vermek için emmeyi serbest bırakmak için nazikçe kuyunun kenarındaki lamelleri hafifçe vurun.
2. Plaka 1 x 10 ⁵ U-2 OS (U2OS) osteosarkom hücreleri, 500 ul'lik bir orta hacimde oyuk başına. Hücrelerin eşit olarak dağıldığından emin olmak için plakayı yana çevirin ve yukarı ve aşağı doğru birkaç kez hareket ettirin.
3. Lamelleri kuyunun en alt kısmında ve lamel altında kabarcıklar olmadığından emin olmak için nazikçe lamelleri aşağı doğru temiz bir P1000 ucu ile bastırın.

2. Stresli Hücreler

1. Ertesi gün, hücrelerin lamellerin her tarafında eşit olarak dağılmış ve eşit şekilde birleştiğinden emin olmak için plakayı görsel olarak kontrol edin;Erkekler sonuçların tekrarlanabilirliğini olumsuz yönde etkileyebilir. Ters çevrilmiş doku kültürü mikroskopu üzerinde 10X'lik bir hedef kullanın.
2. Ortamı 37 ° C'ye ısıtın. Sırasıyla soğuk şok veya ısı şokuya neden olduğundan, hücrelere soğuk veya sıcak ortam uygulamanızdan kaçının.
3. İlacı önceden ısıtılmış ortamda seyreltin. Her bir farklı ilaç konsantrasyonu için, 500 uL ortam içeren 2 göz hazırlayın. Pipetleme yaparken kaybedilmesine izin vermek için ek 500 mcL hazırlayın. Alkol 4 tüp, her biri 1.5 mL içerir.
   1. Sodyum arsenit için: 500 uL içeren her oyuğa, 1.5 mcL 100 mM sodyum arsenit (nihai konsantrasyon: 100 uM) ekleyin veya 100 mM sodyum arsenit (son konsantrasyon: 50 uM) 0.75 μL ekleyin.
   2. Vinorelbin için: 500 uL içeren her oyuğa 22.5 μL 10 mM vinorelbin (nihai konsantrasyon: 150 uM) ekleyin veya 18.75 μL 10 mM vinorelbin (nihai konsantrasyon: 100 uM) ekleyin.
      NOT: Sodyum arsenit Iyi karakterize edilmiş ve sıkça kullanılan bir stres granül uyarıcısıdır ve bu nedenle klasik olarak pozitif bir kontrol olarak kullanılır.
4. Ortamları B1 - 4 ve C1 - 4 kuyularından çıkarın ve atın. İlaçları medyaya ekleyin ve 60 dakika bekleyin (Şekil 1A).
   1. Kuyu B1 ve B2'ye 100 uM sodyum arsenit ile 500 uL orta madde ekleyin. B3 ve B4 kuyularına 50 uM sodyum arsenit ile 500 uL orta madde ekleyin.
   2. Kuyu C1 ve C2'ye 150 uM vinorelbinli 500 uL orta madde ekleyin. Kuyu C3 ve C4'e 125 uM vinorelbinli 500 uL orta madde ekleyin.
5. Fiksasyondan 30 dakika önce kolon 2'deki oyukları 5 μL sikloheksimid (1 mg / mL stok) ve kolon 4'deki oyukları 2 uL puromisin (1.25 mg / mL stok) ile muamele edin. 37 ° C inkübatörde plakayı yerleştirmeden önce karıştırmak için plakayı hafifçe sallayın.

3. Hücre fiksasyonu ve immünofloresans

Nt "> NOT: Deneyden önce metanolün -20 ° C'ye soğutulduğundan emin olun Fosfatla tamponlanmış Tuzlu Su (PBS),% 5 Normal At Serumu (NHS) ve% 4 paraformaldehid (PFA ) PBS içinde.

1. Ortamı atın ve lamelleri içeren kuyuları PBS ile yıkayın. Kullanılan ilaçlara bağlı olarak, ilaç içeren medyayı uygun bir şekilde atmak önemli olabilir; Belirli talimatlar için yerel çevre güvenlik ofisine başvurun. Etkin bir şekilde yıkamak için, sıkıştırılmış bir şişeyi PBS ile doldurun, sıkı bir akış olmadan nazik bir akış sağlamak için ucu kesin ve orijinal PBS'yi aspire ettikten sonra her kuyuya PBS eklemek için kullanın.
2. Nazik ajitasyon altında oda sıcaklığında 15 dakika boyunca ~ 250 mcL% 4 PFA kullanarak hücreleri düzeltin. PFA ile lamelin üstünü tamamen örtün; 250 μL yeterli olmalı, ancak değilse daha fazla ekleyin. Bazı hücreler (veya hücrelerin stres tedavileri) bağlanmayı değiştirebileceğinden daima lamellerin üzerine doğrudan pipet koymaktan kaçının.Pipetleme gücü hücreleri uzaklaştırır.
3. PFA'yı çıkarın ve doğru şekilde atın. Paraformaldehidi uygun bir şekilde nasıl atacağınız hakkında ayrıntılı bilgi için yerel çevre güvenlik ofisine başvurun.
4. ~ 250 μL metanol (-20 ° C) ekleyin ve nazik sallanan ortamda oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin; Bu her ikisi hücreleri permeabilize eder ve düzleştirir.
5. Metanolü çıkarıp atın ve 4 ° C'de oda sıcaklığında 1 saat boyunca ~ 250 uL% 5 NHS uygulayarak hücreleri bloke edin. Metanolün uygun şekilde atılmasına ilişkin ayrıntılar için yerel çevre güvenlik ofisine başvurun.
6. Birincil antikorlar için, antikorları% 5 NHS'de seyreltin.
   NOT: Gözlemlenen granüllerin iyi SG'ler olup olmadığını teyit etmek için çoklu SG işaretlerinin kullanımı anahtardır. Kullanılabilecek SG işaretlerinin sayısı, mikroskopta bulunan filtrelere bağlıdır. Standart yeşil, kırmızı ve uzak kırmızı filtre setleri mevcutsa, 1/250 seyreltme ile G3BP1, eIF4G ve eIF3b'yi kullanın.
   1. Bu deney için (250 ul'lik lamelleri, her biri toplam: 3 mL,% 5 NHS), aşağıdakilerden her birinden 12 μL ekleyin: anti-G3BP1, anti-eIF3b ve anti-eIF4G. Birincil antikorları, 4 ° C'de oda sıcaklığında veya O / N'de en az 1 saat nazik ajitasyonla kuluçkalayın.
7. Kuyucukları PBS ile 3 kez yıkayın ve her yıkamayı 5 dakika inkübe edin.
8. İkincil antikorlar için, tüm ikincil antikorları (1/250 seyreltme) ve Hoechst boyasını (1/1000 seyreltme)% 5 NHS'de seyreltin.
   1. Bu deney için, her birinden 250 μL'de lamelleri toplamı: 3 mL% 5 NHS), aşağıdakilerden her birinden 12 uL ekleyin: Cy2-Fare, Cy3-Tavşan ve Cy5-Keçi (her biri bir 1/250 seyreltme ) Ilave edin ve 3 μL Hoechst boyayı ekleyin.
   2. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca lamelleri ikincil antikorlarla inkübe edin. Bu ve takip eden adımlar sırasında plakayı bir kutu ile örterek veya doku kültürü çanağının üstüne folyo koyarak örnekleri ışığa karşı koruyun.
9. Biz yıkaHer biri 5 dakika PBS ile üç kez.
10. Etiket cam slaytlar üzerine montaj orta kullanarak lamelleri monte edin. Montaj ortamını, 37 ° C'lik bir ısı bloğunda 10 dakika boyunca ısıtın; Bu viskozite azalır ve pipetlenmeyi kolaylaştırır. Kesilmiş bir P200 ucu ile, cam slayt üzerine lamel başına ortalama 25 μL pipetleme; 4-8 lamelleri, mikroskop aşamasının buna izin verdiklerini varsayarak bir cam slaydına sığabilir. İnce forseps kullanarak, lamelini kuyudan slayda aktarın, hücrenin yüzeyi ayağın altına yerleştirdiğinizden emin olun. Temiz bir P200 ucu kullanarak, lamel aşağı doğru bastırın.
11. Tüm lamelleri monte edildikten sonra, laboratuar dokusunu slayt üzerine sıkıca basarak aşırı montaj ortamını temizlemek için katlanan laboratuar dokularını kullanın. Fazla montaj ortamını boşaltmak için H ₂ O içeren bir sıkıştırma şişesi kullanın ve sonra suyun alınması için katlanmış laboratuvar dokusu ile lekelenmeyi tekrarlayın.

4. Fluorescence In Situ </ Em> Hibridizasyon (FISH)

1. Bir kılavuz olarak 1 ve 2.1-4 adımlarını kullanarak hücreleri plaklayın ve tedavi edin; Aşağıdaki deneyde sadece 3 lamel batması gerektiği için, hücreleri 1 sütununa yerleştirmeniz yeterlidir.
2. Tüm tamponların hazırlandığından emin olun ( yani PBS içinde% 4 PFA, suda% 70 etanol, 2X Tuzlu Sodyum Sitrat (SSC) ve% 5 NHS), metanol -20 ° C'ye soğutulur ve bu da Hibridizasyon fırını uygun sıcaklığa kadar ısıtılır.
3. Hücreleri yıkamak ve düzeltmek için 3.1-3.3 adımlarını uygulayın.
4. 10 dakika boyunca -20 ° C metanol ekleyerek hücreleri geçirir hale getirin.
5. Metanolü çıkarın ve lamelleri% 70 etanol içinde inkübe edin. Plakayı gece boyunca 4 ° C'ye yerleştirin. Buharlaşmayı önlemek için parafilm kullanarak tabakayı mühürleyin.
6. Ertesi gün, etanolü çıkarın ve 500 μL 2x SSC ilave ederek hücreleri yeniden su haline getirin. Lamelleri, oda sıcaklığında nazik ajitasyonla 5 dakika inkübe edin.
7. 2x SSC'yi çıkarın ve 500'ü ekleyinΜL 2X SSC. Nazik ajitasyonda 5 dakika inkübe edin.
8. Hibridizasyon fırınının altına parafilm bir parça koyun. Her lamel için parafilm üzerine hibridizasyon tamponu pipet 25 mcL. (Bu noktada, lamelleri hücre tarafında olan) 24 yuvalı lamel kaldırın ve hibridleştirme tampon üzerinde lamel hücre tarafı aşağı yerleştirin. Bunu 42 ° C'de veya isteğe bağlı olarak 65 ° C'de 15 dakika boyunca yapın.
   NOT: Bu adımı 65 ° C'de tamamlamak hücresel RNA'ları denatürecektir; PolyA proteinlerle etkileşimler tarafından maskelenirse, bu sinyali artırabilir.
9. Hibridizasyon tamponu içinde Biotin-Oligo (dT) probunu (100 ng / μL) 2 ng / ml'lik bir konsantrasyona kadar seyreltin; Lamel başına 25 μL yeterlidir.
10. Her lamel için, parafilm üzerine Biotin-Oligo (dT) içeren hibridizasyon tamponu pipetle 25 mcL. Forseps ile lamel Pick up ve yavaşça bir laboratuar dokusu üzerine lamel kenarına dokunmak aşırı kaldırmak içinHibridizasyon tamponu. Lamelini, Biotin-Oligo (dT) ile hibridizasyon tamponuna aktarın; Hücre tarafını aşağıya tutmayı unutmayınız.
11. Buharlaşmayı sınırlandırmak için lamelleri bir hibridizasyon kutusuna yerleştirin. Lamelleri Biotin-Oligo (dT) ile melezleme tamponu içinde 42 ° C'de 60 dakika inkübe edin.
12. 42 ° C'ye dengelenmesine izin vermek için melezleme fırınına 2x SSC yerleştirin.
13. 24-yuva çanağındaki çukurlara ~ 500 uL ısıtılan 2x SSC ilave edin ve lamelleri kuyuya aktarmak için forseps kullanın. 10 dakika inkübe edin.
14. Yukarıdaki yıkama adımını 42 ° C'de iki kez ve oda sıcaklığında iki kez tekrarlayın.
15. Geleneksel bir antikor yerine Biotin-Oligo (dT) saptamak için bir streptavidin florokrom kullandığınızdan emin olun, 3.5-3.10 adımlarını tamamlayın.

5. Translasyonel Durumu Değerlendirmek için Ribopuromycylation Testi

1. Adım 1'de belirtildiği gibi lamelleri Üzerinde U2OS plakaları plaka, ancak koşul başına sadece bir lamel slayt (buOlgu, 3 lamelleri: tedavi edilmedi, 100 uM sodyum arsenit ve 150 uM vinorelbin) ( Şekil 1A).
2. 2. adımda protokolü kullanarak, adım 2.1-2.4'i tamamlayan hücreleri stres haline getirin.
3. Fiksasyondan 5 dakika önce, 2 μL puromycin (stok: 1.25 mg / mL, 5 μg / mL'lik bir nihai puromisin konsantrasyonu elde etmek için 500 μL'de 2 μL seyreltin) ve 2.9 μL emetin (stok: 20 μg / mL; 2.9 uL, zaten puromisin içeren aynı çözeltiye) 0.5 mL içeren her kuyuya ilave edildi.
4. Puromisin tespit etmek için bir anti-puromisin antikor (1/1000 seyreltme) kullanarak, yukarıda belirtildiği gibi 3.1-3.10 adımlarını tamamlayın. İdeal olarak, kalan kanallarda iki SG işaretçisi kullanın.
5. Puromisin sinyalini nicelleştirirken, tüm görüntüleri aynı pozlamayı kullanarak alın. En parlak (çekilmemiş) örneği kullanarak ve doygunluk olmadan mümkün olduğunca parlak bir görüntü alarak bu pozlamayı seçin.
   NOT: Anti-puromycin floresan sinyalinin yoğunluğuBir amino asit yerine puromisin olduğu için devam eden çeviri, yeni proteine ​​dahil olur ve proteinin erken terminasyonunu zorlar.

6. Görüntü Edinimi ve Analizi

1. Stres Granüllerinin Miktar Tayini
   1. SG'leri ölçmek için 40X'lik bir objektif kullanarak örnek başına 100'den fazla hücre toplamı olan 3 - 5 görüntü elde edin. Alternatif olarak, diğer hedefleri kullanarak görüntüler elde edin, ancak> 100 hücre lâtivite için sayılır ve büyütme granülleri net bir şekilde görselleştirmek için yeterince büyük olduğundan emin olun. Bunu lamelini beş kabaca eşit bölgelere bölerek ve her bölgeden rastgele bir alan seçerek yapın ( Şekil 1B ); Işaretçilerin birlikte yerelleştirilmesini değerlendirmek için aynı alanın görüntüleri tüm kanalları içermelidir.
   2. Tüm görüntüler edinildikten sonra, kanalları birleştirin. Bazı kamera yazılımı bunu otomatik olarak yapar, diğerleri manuel birleştirmeyi gerektirir; Bu ile yapılabilirImageJ tüm görüntüleri açıp ardından [Resim | Renkli | Birleştirme Kanalları].
   3. Hoechst'i çekirdek markörü olarak kullanarak, çekirdek sayısını sayarak toplam hücre sayısını elle sayın. Hücre başına ikiden fazla SG içeren hücrelerin sayısını manuel olarak hesaplayın.
      NOT: Örneğin, G3BP1 (yeşil), eIF4G (kırmızı) ve Hoechst (mavi) görüntüleyen birleştirilen bir üç kanallı görüntü kullanarak mavi kanalı kullanarak çekirdeği (veya hücre sayısını) sayın. Daha sonra, SG pozitif hücreleri hücre başına iki veya daha fazla sarı odak olan hücreler olarak sayın. Granüller, G3BP1'den yeşil olarak, sarı renkte görünür ve eIF4G'den gelen kırmızı, eğer birlikte yerelleştirilmişse sarı görünür.
   4. 3-5 bağımsız bölgeden gelen verileri birleştirerek SG pozitif olan hücrelerin yüzdesini belirleyin ve hesaplayın:
      SG pozitif / çekirdek sayısı) * 100 = SG-pozitif hücrelerin yüzdesi
2. Hat Yerinde Tarama Analiziyle Kolokalizasyonu Değerlendirme - Manuel Yöntem
   1. AçıkImageJ. () Adresinden ücretsiz indirebilirsiniz
   2. ROI yöneticisini açın: [Analiz et | Araçlar | ROI yöneticisi ...].
   3. Birleştirilmiş görüntüyü ImageJ'de açın: [File | Açık].
   4. ImageJ araç çubuğunda bulunan çizgi aracını kullanarak, SG'den önce ve sonra eklediğinizden emin olarak bir SG'den geçen bir satır ekleyin. ROI yöneticisi penceresinde [Ekle] öğesini tıklatarak bu satırı ROI yöneticisine ekleyin.
   5. Her işaretçinin granüle lokalizasyonu değerlendirmek için birleştirilmiş görüntüyü ayrı kanallara bölün. [Image | Renkli | Bölünmüş Kanal]; Bu, birleştirilen görüntüyü üç siyah-beyaz görüntü haline bölecektir.
   6. Siyah-beyaz görüntüde satırın seçili olduğundan emin olun; Çizgi resimde göründüğü takdirde seçilir. Değilse, ROI yöneticisi penceresinde paneldeki çizgiyi tıklayın; ROI yöneticisi penceresinde çizgi mavi renkte vurgulanır ve çizgiyi siyah-beyaz görüntüde görünür hale getirecektir. Hat hala görünmüyorsa, "show all" seçeneğinin ch olduğundan emin olunROI yöneticisinde ecked ve ardından resimdeki satırı tıklayın.
   7. Satırın yoğunluğunu analiz edin: [Analiz et | Arsa Profili]; Bu, hat boyunca sinyalin yoğunluğunu gösteren "Plot Profile" penceresini ortaya çıkaracaktır.
   8. "Plot Profile" penceresinde, [Listele] 'ye tıklayın; bu, grafikten ham verileri içeren bir pencere açar. Bu penceredeki tüm verileri kopyalayın ve bir elektronik tablo dosyasına yapıştırın. Bunu yapmak için, penceredeki tüm verileri seçin: [Düzenle | Hepsini seç]. Tarihi kopyalayın: [Düzenle | Kopya]. Bir elektronik tablo dosyasını açın ve verileri yapıştırın: [Düzenle | Yapıştırmak].
   9. Her bir kanal için 6.2.6 - 6.2.8 adımlarını tamamlayın. Değerlendirilen kanalı takip ettiğinizden emin olun.
   10. Bir elektronik tabloda, sonuçların bir çizgi grafiği oluşturun. [Control] 'e basarak ve her sütunun üstündeki harfi tıklatarak veri içeren sütunları seçin. Ardından, çizgi grafiğini seçin: [Insert | Çizgi grafiği].
   11. Bu analizi mult için tekrarlayınÇoklu bağımsız deneyler boyunca granülleri zorlayın.
3. Hat Tarama Analizi ile Kolokalizasyonu Değerlendirme - ImageJ Plugin
   1. RGB profil aracını ImageJ web sitesinden indirin ve yükleyin (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Doğru takıldığında, kırmızı, yeşil ve mavi (RGB) çizgili simgeler araç çubuğunda görünmelidir.
   2. ImageJ'de görüntüyü ( örn. Tiff, JPG) açın: [File | Açık].
   3. ImageJ araç çubuğunda bulunan RGB simgesini tıklayın.
   4. Bir SG aracılığıyla uzanan ve bitişik bölgeleri dahil etmeyi seçerek bir çizgi eklemek için tıklayın ve sürükleyin; Histogramın bir resmi bir pop-up pencerede görünür.
   5. Verileri bir resim olarak kaydedin: [File | Farklı Kaydet | TIFF]. Alternatif olarak, verileri yukarıdaki 6.2.8 adımıyla başka bir grafik programında dışa aktarın ve grafiklerden çizin.

Sonuçlar

Stres kaynaklı odaklanma alanları mutlaka SG değildir. SG'ler, mRNA'lar, translasyon başlatma faktörleri ve RNA-bağlayıcı proteinleri içeren sitoplazmik odaklar olarak sınıflandırılır ve aktif translasyon ile denge halindedir. Yukarıdaki protokol, belirli bir stresin iyi niyetli SG'ler oluşturup oluşturmadığını karakterize etmek için bir kalıp olarak kullanılabilir.

SG'ler, hem ...

Tartışmalar

Birden fazla hastalıkta immünhistolojik çalışmalarla kanıtlandığı üzere, kronik stres, farklı hücre içi odakların oluşumuna yol açar. Örneğin, çoğu nörodejeneratif hastalıklar, çözünmeyen proteinlerin hücre içi agregaları ile karakterizedir. Bu agregalarda SG ile ilişkili proteinlerin bulunması, bu tür odakların SG'ler olduğu sonucuna varmak için temel oluşturur. Yeni stres uyarıları ile tedavi edilen hücrelerde SG belirteç pozitif sitoplazmik odağı gözlendiğinde de benzer ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
U-2 OS	ATCC	ATCC®HTB-96™	- commonly written as "U2OS" - culture at 37 °C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium	Corning	10-013-CV	- abbreviated DMEM - contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red - supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin - prewarm prior drug(s) dilution
Fetal Bovine Serum	Sigma	F2442-500ml	- abbreviated FBS - used to supplement media
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630-080	- used to supplement media
penicilline streptomycine	Sigma	P0781-100ml	- used to supplement media
24 well plate	Costar	3524
lab tissues	KIMTECH SCIENCE	34120	- commonly called "kimwipes"
Coverglass for Growth Cover Glasses	Fisher Scientific	12-545-82	- autoclaved before used - keep sterile in the tissue culture hood
Sodium (meta)arsenite ≥90%	Sigma	S7400-100G	- commonly called sodium arsenite and abbreviated SA - dissolution in water at 1 M concentration, then dilute to 100 µM as a working stock
Vinorelbine	TSZ CHEM	RS055	- abbreviated VRB - dissolve in water to 10 mM
Puromycin	Sigma	P9620	- used to assess translation level (ribopuromycylation) - used to assess SG connection with active translation - dilute in water to 10 mg/mL
Emetine dihydrochloride hydrate	Sigma	E2375	- used in combination with puro to assess general translation level - used to assess SG connection with active translation - dilute in water to 10 mg/mL
Cycloheximide	Sigma	C4859	- abbreviated CHX - used to assess SG connection with active translation - dilute in water to 10 mg/mL
Phosphate Buffered Saline	Lonza / VWR	95042-486	- abbreviated PBS - wash buffer for immunofluorescence
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline	Sigma	P6148-500G	- make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved - aliquots can be stored at - 20 °C for several months - hazardous, use ventilation - discard in special waste
Methanol, ACS	BDH / VWR	BDH1135-4LP	- pre-chilled to -20°C before use - discard in special waste
Normal Horse Serum	Thermo Fisher Scientific	31874	- abbreviated NHS - dilute to 5% in PBS - add sodium azide for storage at 4°C - blocking solution for immunofluorescence
Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC	Decon Labs / VWR	89125-188	- dilute to 70% with water
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y)	Santa Cruz	sc-81940	- store at 4 °C - use at 1/100 dilution
rabbit anti eIF4G antibody (H-300)	Santa Cruz	sc-11373	- store at 4 °C - 1/250 dilution
goat anti eIF3η (N-20) antibody	Santa Cruz	sc-16377	- eIF3η is also known as eIF3b - store at 4 °C - 1/250 dilution
mouse anti puromycin 12D10 antibody	Millipore	MABE343	- store at 4 °C - 1/1000 dilution
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	715-225-150	- reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C - 1/250 dilution
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	711-165-152	- reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C - 1/2500 dilution
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	705-175-147	- reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C - 1/250 dilution
Hoechst 33258 solution	Sigma	94403-1ML	- incubate with secondary antibodies -stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light - Store at 4 °C
Cy3 Streptavidin	Jackson Immunoresearch	016-160-084	- reconstitute in water as per manufacturer’s instructions, then store at 4°C - 1/250 dilution
oligo-(dT)40x probe biotinilated	Integrated DNA Technologies (IDT)	/	- reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20°C - dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use - custom order
hybridation box	/	/	- make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom - prewarm the box prior use
20 x SSC buffer	Thermo fisher Ambion	AM9763	- dilute to 2X SSC using RNase Free water (DEPC treated) - store at room temperature - wash buffer for FISH
PerfectHybPlus Hybridization Buffer	Sigma	H7033-50ml	- block and probe incubation buffer for FISH
slide mounting media	home made	/	- mix 5 g of “cold-soluble” poly(vinyl alcohol) in 20 ml of PBS - mix by sonication, followed by stirring overnight at RT - Add 5 ml of glycerol and 0.2 ml of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT - centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet - aliquot viscous liquid, long-term storage at -20°C, 1 week at 4°C
Parafilm "M"	Sigma	P7793-1EA	- usually referred as "parafilm"
Poly(vinyl alcohol)	Sigma	P-8136-250G	- reagent to make vinol
Glycerol	Sigma	G5516-100ML	- reagent to make vinol
sodium azide	Fisher Scientific	S2002-5G	- preservative agent for blocking solution and vinol - make a 20 % dilution in water