Méthodes pour classer les foyers cytoplasmiques sous forme de granulés de stress mammalien

Résumé

Les granules de stress (SG) sont des structures cytoplasmiques non moulues qui se forment dans des cellules exposées à une variété de contraintes. Les SG contiennent des ARNm, des protéines de liaison à l'ARN, des petites sous-unités ribosomales, des facteurs liés à la traduction et diverses protéines de signalisation cellulaire. Ce protocole décrit un flux de travail qui utilise plusieurs approches expérimentales pour détecter, caractériser et quantifier les SG de bonne foi .

Résumé

Les cellules sont souvent confrontées à des changements environnementaux soudains. Les granulés de stress (SG), les complexes de ribonucléoprotéines cytoplasmiques qui se forment dans des cellules exposées aux conditions de stress sont impliqués dans divers aspects du métabolisme et de la survie cellulaire. Les SGs modulent les voies de signalisation cellulaire, l'expression génique post-transcriptionnelle et les programmes de réponse au stress. La formation de ces granules contenant des ARNm est directement liée à la traduction cellulaire. L'assemblage SG est déclenché par l'initiation de la traduction inhibée, et le démontage SG est favorisé par l'activation de la traduction ou par un allongement de la traduction inhibé. Cette relation est encore soulignée par la composition SG. Les composants SG de base sont des complexes de pré-initiation de traduction bloqués, des ARNm et des protéines de liaison à l'ARN sélectionnées (RBP). Le but de l'assemblage de SG est de conserver l'énergie cellulaire en séquestrant des ARNm de ménage de maintien de la traduction, ce qui permet une traduction améliorée des protéines sensibles au stress. En complémentSur les constituants de base, tels que les complexes de préinitiation de traduction bloqués, les SG contiennent une pléthore d'autres protéines et des molécules de signalisation. Les défauts dans la formation de SG peuvent nuire à l'adaptation cellulaire au stress et peuvent donc favoriser la mort cellulaire. Les SG et les granulés contenant de l'ARN similaires ont été liés à un certain nombre de maladies humaines, y compris les troubles neurodégénératifs et le cancer, conduisant à l'intérêt récent à classer et à définir les sous-types de granules d'ARN. Ce protocole décrit des analyses pour caractériser et quantifier les SG de mammifères.

Introduction

Les cellules utilisent de nombreux mécanismes pour répondre au stress. Certaines réponses se produisent au niveau post-transcriptionnel et impliquent la régulation de la traduction et / ou de la stabilité de l'ARNm ^{1 , 2} . L'arrestation et la dégradation translationnelle de l'ARNm modulée par le stress sont associées à la formation de foyers cellulaires non mémarchiques spécifiques, les plus classés étant les Granules de Stress (SG) ³ . Les SG sont des foyers cytoplasmiques qui concentrent les mRNP non traduits dans des cellules qui ont réussi à réagir au stress ( p. Ex., Oxydation, choc thermique, altération des nutriments et infection virale) ⁴ . En plus des mRNAs non traduits, les SG contiennent des facteurs d'initiation de la traduction, des protéines de liaison à l'ARN et diverses protéines de signalisation ⁵ . Les SG sont des biomarqueurs de la traduction inhibitrice des protéines et de l'altération du métabolisme de l'ARN et ont été liés à la survie cellulaire et à l'apoptose, la voie de signalisationS, et les processus nucléaires ⁵ .

Les SG sont des entités dynamiques, et leur formation est étroitement liée à l'état de la traduction cellulaire ⁶ . En dépit de leur aspect apparemment solide, la plupart des composants de la protéine SG passent rapidement et à l'extérieur, avec un temps de séjour de secondes. Alors que les SG persistent pendant des minutes, la plupart de leurs composants sont en flux rapide. L'inhibition de l'initiation de la traduction et le désassemblage conséquent des polysomes de traduction favorisent la formation de SG; Ainsi, les SG sont en équilibre avec la traduction des polysomes. Cet équilibre de polysome / SG est la clé pour distinguer les SG de bonne foi des autres foyers induits par le stress ^{6 , 7} .

L'initiation à la traduction d'arrestation implique la conversion de complexes de pré-initiation compétents en traduction qui contiennent des ARNm, des facteurs d'initiation de la traduction (EIF) et des sous-unités ribosomales 40S (s) O-called complexes 48S) dans des complexes qui sont paralysés en translation (complexes appelés 48S *) qui peuvent s'unir aux SG ^{4 , 6} . Les SG sont favorisés par l'arrestation translationnelle à deux étapes différentes en amont de la formation complexe 48S: interférence avec les fonctions du complexe eIF4F de liaison de cap ( par exemple, ciblant sa sous-unité eIF4A) ou la phosphorylation de la sous-unité α du facteur d'initiation de la traduction eIF2, médiée par une Ou plus des quatre kinases eIF2. La présence de complexes 48S bloqués ( c.-à-d. Sous-unités ribosomales 40S et facteurs d'initiation de traduction sélectionnés) est une caractéristique des SG ^{8 , 9} .

Les SG ont été liés à divers états pathologiques, tels que les infections virales, la neurodégénérescence, l'auto-immunité et le cancer ^{3 , 10 , 11 ,}Ss = "xref"> 12 ^{, 13} . Les formes mutées de plusieurs composants SG sont associées à des maladies neurodégénératives ( par exemple, une sclérose latérale amyotrophique) dans laquelle les neurones présentent des inclusions pathologiques intracellulaires pouvant jouer un rôle actif dans la mort neuronale ¹³ . Certains virus détournent les composants SG pour inhiber la formation du SG et pour améliorer la replication virale ¹⁴ . Des études récentes associent également les SG au cancer ¹⁵ et à la survie des cellules cancéreuses dans les traitements de chimiothérapie et de radiothérapie ^{10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} . Bien que de tels résultats aient suscité un grand intérêt pour la biologie SG, bon nombre des rapports publiés manquent de contrôles importants pour distinguer la formation de SG d' une bonne foi d'autres foyers induits par le stress.

Les SG ont d'abord été décrits comme des foyers cytoplasmiques non mécontentés composés de protéines de liaison à l'ARNm sélectionnées (RBP), y compris l'antigène ntracellulaire à cellules T 1 (TIA-1) et la protéine à liaison poly-A (PABP); Facteurs d'initiation de la traduction; ARNm polyadénylé; Et petites sous-unités ribosomales ^{4 , 6 , 21 , 22} . Traditionnellement, leur composition a été déterminée par des techniques telles que l'immunocoloration et l'expression ectopique de protéines marquées par fluorescence ^{23 , 24} . En raison de leur nature très dynamique, l'immunocolorisation des protéines SG et / ou des ARNm reste la méthodologie déterminante pour la détection des SG ^{23 , 24} . À ce jour, de nombreux RBP et autres protéines (plus de 120 protéines distinctes) sont décrits comme composants SG ¹¹ . Autant de SLes protéines localisées G changent leur localisation à la fois de manière indépendante du stress et indépendantes et peuvent s'accumuler à d'autres compartiments et foyers intracellulaires, il est important de choisir des marqueurs SG corrects et d'utiliser des critères fonctionnels pour distinguer les SG d'autres types de stress induit Les foyers. Les SG de bonne qualité contiennent des ARNm, des facteurs d'initiation de la traduction et de petites sous-unités ribosomales et sont en équilibre dynamique avec la traduction.

Ce flux de travail simple est conçu pour déterminer si les foyers induits par le stress sont des SG de bonne foi . Ce flux de travail comprend plusieurs approches expérimentales utilisant des cellules U2OS, des cellules couramment utilisées pour étudier les SG. Ces cellules sont idéales, car elles ont un grand cytoplasme, sont relativement plates et s'attachent fortement aux lamelles de verre. D'autres types de cellules peuvent être utilisés pour étudier les SG, mais il est important de savoir que les différences de temps, de concentration de médicament et d'abondance de protéines de nucléation SG peuvent modifier la cinétique et la compositionSition. En outre, certaines cellules répondent à la fixation du paraformaldehyde en formant des bulles de surface cellulaire, ce qui donne alors une apparence ruffée qui provoque la localisation ponctuelle de certains marqueurs SG; Sans analyse minutieuse, ceux-ci peuvent être mal classés en SG. Cela met en évidence la nécessité d'évaluer tous les critères requis pour identifier les foyers induits par le stress en tant que SG de bonne foi . La vinorelbine (VRB), une thérapeutique contre le cancer qui favorise les SG ²⁰ , ainsi que l'arsénite de sodium (SA), un inducteur SG robuste et bien caractérisé, sont utilisés comme contraintes pour les expériences de ce protocole.

Les SG canoniques contiennent de multiples marqueurs SG (à la fois des protéines et des ARNm) qui se placalisent dans les foyers cytoplasmiques. Ce protocole utilise à la fois l'immunofluorescence et l'hybridation in situ fluorescente (FISH) pour détecter la localisation des marqueurs de protéines et de l'ARNm polyadénylé ²² , respectivement. En bref, l'immunofluorescence indirecte utilise des anticorps ( i.E. Anticorps primaires) spécifiques d'une protéine donnée pour la détecter dans la cellule. Ensuite, les anticorps secondaires (habituellement spécifiques à l'espèce) attachés aux fluorochromes reconnaissent l'anticorps primaire et révèlent la localisation des protéines cibles. La microscopie fluorescente est utilisée pour détecter le signal localisé dans la cellule. L'utilisation d'anticorps produits dans différentes espèces et leur détection avec des anticorps secondaires de couleur différente permet de détecter la localisation de multiples anticorps, ce qui indique que leurs cibles protéiques se trouvent au même endroit ²³ . Il est important de sélectionner des marqueurs qui ont été vérifiés pour la colocalisation dans les SG de bonne foi .

FISH utilise une sonde marquée qui se base sur une séquence d'ARN ou d'ADN spécifique ²⁵ . Pour détecter l'ARNm, ce protocole utilise une sonde oligo (dT) ₄₀ biotinylée qui s'hybride (ou paires de bases) à la queue polyA de l'ARNm ( c'est-à-dire polyA FISH). La sonde biotinylée est alors détectée en utilisant une streptavidine à conjugaison fluorescente, car la streptavidine a une forte affinité pour la biotine. Lors de l'évaluation des SG, il est important de coupler PolyA FISH avec immunofluorescence détectant un marqueur SG, comme dans les SG SG de bonne foi , les deux signaux devraient être localisés.

En utilisant ce protocole, la colocalisation est évaluée de multiples façons. Dans une image multi-canal ( c'est-à-dire RVB: rouge, vert et bleu), la colocalisation modifie la couleur du signal superposé ( p. Ex ., Le rouge colocalisé et le vert apparaissent en jaune) ²³ . En outre, la colocalisation est quantifiée graphiquement en utilisant l'analyse de balayage de ligne, où l'intensité de chacune des couleurs est mesurée sur une ligne donnée ^{8 , 20} . Ce protocole décrit deux procédures d'analyse de balayage en ligne utilisant ImageJ ²⁶ . Une procédure est manuelle et passe à travers le processus entier,L'autre utilise une macro, ou un programme simple qui automatise les étapes manuelles. Il est important de passer par le programme manuel pour comprendre la procédure macro.

Les SG se forment dans les cellules où la traduction est réprimée; Par conséquent, les cellules avec SG devraient afficher des niveaux réduits de traduction globale par rapport aux cellules non traitées. Expérimentalement, la ribopuromycylation est utilisée. La puromycine et l'emétine sont ajoutées aux cellules pendant une courte durée avant la fixation, ce qui permet à la puromycine d'incorporer dans la formation active de polypeptides, provoquant la terminaison ^{27 , 28} . Le traitement par emetine est nécessaire pour empêcher le redémarrage ²⁹ . La puromycine peut ensuite être détectée en utilisant un anticorps anti-puromycine, en donnant un instantané de la traduction active. Cette méthode est utilisée car elle est rapide, ne requiert pas de pré-affamer avec un milieu dépourvu d'un acide aminé particulier (et potentiellement précontrainte des cellules) et révèle leLocalisation subcellulaire de la traduction des protéines. D'autres procédés, notamment l'utilisation d'analogues d'acides aminés modifiés, tels que l'analogue de la méthionine L-azidohomoalaine (AHA), couplé à la chimie ³⁰ "cliquable", ont été utilisés pour montrer que les cellules contenant des SG présentent une traduction beaucoup plus faible que les cellules voisines ³¹ . Cependant, cette technique nécessite une famine de méthionine suivie d'un étiquetage des impulsions pendant 15 à 30 minutes. La famine de la méthionine constitue un stress supplémentaire, tandis que le temps d'étiquetage long ( c'est- à -dire 15-30 min) aboutit à la mesure de la traduction cumulative plutôt que continue et permet également aux protéines nouvellement synthétisées de passer de leur site de synthèse à leur destination finale cellule. En revanche, la ribopuromycylation est beaucoup plus rapide et compatible avec n'importe quel milieu, comme le milieu sans glucose utilisé pour induire des SG à cause de la famine du glucose.

Les SG canoniques sont en équilibre dynamiqueAvec la traduction active de polysomes. Ceci peut être évalué expérimentalement en traitant des échantillons avec les médicaments qui stabilisent ou déstabilisent les polysomes, réduisant ainsi l'équilibre entre les SG et les polysomes ²³ . Le cycloheximide (ou l'emetine, qui se comporte de la même manière) bloque l'allongement par la «congélation» des ribosomes sur l'ARNm, diminuant ainsi le pool de mRNP non polysomaux disponibles pouvant former des SG. D'une manière expérimentale, cela peut être utilisé de deux façons: en ajoutant du cycloheximide (ou de l'emetine) avant le stress pour éviter la formation de SG ou en ajoutant du cycloheximide (ou de l'emetine) après la formation des SG, même sans enlever l'agent contraignant, provoquant le désassemblage du SG, comme paralysé Des complexes de préinitiation sont admis lentement dans la fraction de polysome. En revanche, la puromycine provoque une terminaison prématurée et favorise le désassemblage des polysomes, ce qui augmente le nombre d'ARNm initiateurs capables de se constituer en SG. Expérimentalement, le traitement par la puromycine augmente le nombre de SG ou abaisse le thresholD à laquelle ils se forment en réponse à un stress gradué ou à un dosage médicamenteux. Lors de l'évaluation de l'effet de la puromycine, il est important d'utiliser un niveau sous-maximal de la drogue d'intérêt, car on s'attend à ce que la puromycine augmente l'effet du médicament et augmente le pourcentage de cellules présentant des SG - cela ne peut pas se produire si le médicament / Stress provoque des SG dans 100% des cellules initialement. Cela contraste avec le traitement par cycloheximide, qui désassemble les SG et fonctionne mieux lorsque ~ 95% des cellules présentent initialement des SG afin que la plus grande diminution possible puisse être observée et quantifiée avec précision.

Ce protocole fournit un cadre pour étudier les SG dans les cellules de mammifères. Les méthodes comprennent: (1) la coloration immunofluorescente et l'analyse de l'imageJ pour évaluer la colocalisation des marqueurs classiques associés au SG eIF4G, eIF3b et la protéine liant les protéines activant Ras GTPase 1 (G3BP1) dans les SG putatifs; (2) l'hybridation in situ par fluorescence oligo (dT) (polyA FISH) pour détecter l'ARNm polyadénylé; (3) le traitement par cycloheximide et puromycine pour déterminer si les foyers induits par le stress sont en équilibre dynamique avec les polysomes; Et (4) la ribopuromycylation pour évaluer l'état de translation des cellules contenant des SG putatifs. Ensemble, ces analyses peuvent déterminer si les foyers induits par le stress peuvent être classés comme SG de bonne foi .

Protocole

1. Préparation cellulaire

1. Ajouter des lamelles autoclavées à 12 puits d'une plaque à 24 puits, comme indiqué sur la figure 1A ; Cela peut se faire en utilisant une pipette Pasteur stérile attachée à un vide pour retirer chaque lamelle. Tapotez délicatement le lamelle sur le côté du puits pour relâcher l'aspiration, ce qui permet à la lamelle de couler de tomber dans le puits.
2. Plaque 1 x 10 ⁵ U-2 OS (U2OS) cellules d'ostéosarcome par puits à un volume final de 500 μL de milieu. Déplacez la plaque de côté à côté et de haut en bas plusieurs fois pour vous assurer que les cellules sont réparties uniformément.
3. Appuyez délicatement sur les lamelles vers le bas avec une pointe propre P1000 pour s'assurer que la lamelle se trouve au fond du puits et qu'il n'y a pas de bulles sous la lamelle.

2. Stressing Cells

1. Le lendemain, vérifiez visuellement la plaque pour s'assurer que les cellules sont uniformément dispersées et confluent uniformément à travers le lamelle, car les variations entre la saLes robots peuvent avoir un impact négatif sur la reproductibilité des résultats. Utilisez un objectif 10X sur un microscope à culture tissulaire inversée.
2. Préchauffer le milieu à 37 ° C. Évitez d'appliquer des fluides froids ou chauds sur les cellules, car elles provoquent un choc thermique ou un choc thermique, respectivement.
3. Diluer les médicaments dans les milieux préchauffés. Pour chaque concentration de médicament différente, préparer 2 puits contenant 500 μL de milieu. Préparez 500 μL supplémentaires pour permettre une perte pendant le pipetage. Aliquot 4 tubes contenant chacun 1,5 mL.
   1. Pour l'arsénite de sodium: à chaque puits contenant 500 μL, ajouter 1,5 μl d'arsénite de sodium 100 mM (concentration finale: 100 μM) ou ajouter 0,75 μl d'arsénite de sodium 100 mM (concentration finale: 50 μM).
   2. Pour la vinorelbine: à chaque puits contenant 500 μL, ajouter 22,5 μL de vinorelbine 10 mM (concentration finale: 150 μM) ou ajouter 18,75 μl de vinorelbine 10 mM (concentration finale: 100 μM).
      NOTE: arsénite de sodium Est un inducteur de granulés de contrainte bien caractérisé et couramment utilisé et est donc classiquement utilisé comme témoin positif.
4. Retirer et jeter le support des puits B1 - 4 et C1 - 4. Ajouter les médias avec des médicaments et attendre 60 minutes (Figure 1A).
   1. Ajouter 500 μL de milieu avec de l'arsénite de sodium 100 μM aux puits B1 et B2. Ajouter 500 μL de milieu avec de l'arsénite de sodium 50 μM aux puits B3 et B4.
   2. Ajouter 500 μL de milieu avec 150 μM de vinorelbine aux puits C1 et C2. Ajouter 500 μL de milieu avec 125 uM de vinorelbine aux puits C3 et C4.
5. 30 min avant la fixation, traiter les puits dans la colonne 2 avec 5 μL de cycloheximide (1 mg / mL de stock) et les puits dans la colonne 4 avec 2 μL de puromycine (1,25 mg / ml de stock). Faites glisser doucement la plaque pour mélanger avant de remettre la plaque dans l'incubateur à 37 ° C.

3. Fixation cellulaire et immunofluorescence

Nt "> REMARQUE: Avant l'expérience, assurez-vous que le méthanol est refroidi à -20 ° C. Effectuez des tampons, y compris la solution salée tamponnée au phosphate (PBS), 5% de sérum de cheval normal (NHS) dans le PBS et 4% de paraformaldéhyde (PFA ) Dans PBS.

1. Jeter les médias et laver les puits contenant des lamelles avec PBS. Selon les médicaments utilisés, il pourrait être important de rejeter correctement les médias contenant des médicaments; Communiquez avec le bureau local de sécurité environnementale pour obtenir des instructions spécifiques. Pour laver efficacement, remplissez une bouteille de compression avec PBS, réduisez la pointe afin de permettre un écoulement doux plutôt qu'un flux serré, et utilisez cette option pour ajouter du PBS à chaque puits après avoir aspiré le PBS d'origine.
2. Fixer les cellules en utilisant ~ 250 μL de PFA à 4% pendant 15 minutes à TA sous agitation douce. Recouvrez complètement le dessus de la lamelle avec PFA; 250 μL devrait être suffisant, mais sinon, ajouter plus. Évitez toujours de pipeter directement sur les lamelles, car certaines cellules (ou traitements de stress des cellules) peuvent modifier l'attachement et tIl force de pipeter peut déloger les cellules.
3. Retirez le PFA et lisez-le correctement. Communiquez avec le bureau local de sécurité environnementale pour obtenir des détails sur la façon de rejeter correctement le paraformaldéhyde.
4. Ajouter ~ 250 μL de methanol (-20 ° C) et incuber pendant 5 minutes à TA sous un basculement doux; Cela permette et stabilise les cellules.
5. Retirer et jeter le méthanol et bloquer les cellules en appliquant ~ 250 μL de NHS à 5% pendant 1 h à TA O / N à 4 ° C. Communiquez avec le bureau local de sécurité environnementale pour obtenir des détails sur le rejet correct du méthanol.
6. Pour les anticorps primaires, diluer les anticorps dans 5% de NHS.
   REMARQUE: L'utilisation de plusieurs marqueurs SG est essentielle pour confirmer si les granulés observés sont des SG de bonne foi . Le nombre de marqueurs SG pouvant être utilisés dépend des filtres disponibles au microscope. Si des ensembles de filtres verts, rouges et lointains standard sont disponibles, utilisez G3BP1, eIF4G et eIF3b à une dilution 1/250.
   1. Pour cette expérience (12 comprimés à 250 μL chacun-Total: 3 mL de NHS à 5%), ajouter 12 μL de chacun des éléments suivants: anti-G3BP1, anti-eIF3b et anti-eIF4G. Incuber les anticorps primaires en agitant doucement pendant au moins 1 h à la température ambiante ou O / N à 4 ° C.
7. Laver les puits 3x avec du PBS et incuber chaque lavage pendant 5 min.
8. Pour les anticorps secondaires, diluer tous les anticorps secondaires (dilution 1/250) et le colorant Hoechst (1/1 000 de dilution) dans du NHS à 5%.
   1. Pour cette expérience (12 comprimés à 250 μL chacun - Total: 3 mL de NHS à 5%), ajouter 12 μL de chacun des éléments suivants: Cy2-Mouse, Cy3-Rabbit et Cy5-Goat (une dilution de 1/250 de chaque ) Et ajouter 3 μL de colorant Hoechst.
   2. Incuber les lamelles avec les anticorps secondaires pendant 1 h à la température ambiante. Pendant cette étape et les étapes suivantes, protégez les échantillons de la lumière en recouvrant la plaque avec une boîte ou en plaçant du papier d'aluminium sur le dessus du plat de culture de tissus.
9. Lavez nousLls trois fois avec PBS pendant 5 min chacun.
10. Monter les lamelles sur des lames de verre marquées à l'aide d'un support de montage. Chauffer le milieu de montage dans un bloc de chaleur de 37 ° C pendant 10 min; Cela diminue la viscosité et facilite la pipette. Avec une pointe P200 coupée, pipettez 25 μL de support de montage par lamelle sur une glissière en verre; 4-8 lamelles couvrent une glissière en verre, en supposant que le stade du microscope le permet. À l'aide de pinces fines, transférez la lamelle du puits à la glissière, en vous assurant de mettre le côté de la cellule vers le bas sur le support de montage. À l'aide d'une pointe P200 propre, appuyez sur la lamelle vers le bas.
11. Une fois que tous les lamelles ont été montées, utilisez un tissu de laboratoire plié pour nettoyer l'excès de support en appuyant sur le tissu de laboratoire très fermement sur la glissière. Utilisez une bouteille de compression contenant H ₂ O pour rincer le surplus de support et répétez la tache avec du tissu de laboratoire plié pour enlever l'eau.

4. Fluorescence In Situ </ Em> Hybridation (FISH)

1. Placer et traiter les cellules, en utilisant les étapes 1 et 2.1-4 comme guide; Il suffit de plaquer les cellules dans la colonne 1, car seulement 3 lamelles sont nécessaires dans l'expérience suivante.
2. Assurez-vous que tous les tampons sont préparés ( c'est-à-dire 4% de PFA dans PBS, 70% d'éthanol dans l'eau, 2x de saline-citrate de sodium (SSC) et 5% de NHS), que le méthanol soit refroidi à -20 ° C et Le four à hybridation est chauffé jusqu'à la température appropriée.
3. Effectuer les étapes 3.1-3.3 pour laver et réparer les cellules.
4. Perméabiliser les cellules en ajoutant -20 ° C de methanol pendant 10 min.
5. Retirer le méthanol et incuber les lamelles dans l'éthanol à 70%. Placez la plaque à 4 ° C pendant la nuit. Sceller la plaque en utilisant du parafilm pour éviter l'évaporation.
6. Le lendemain, enlever l'éthanol et réhydrater les cellules en ajoutant 500 μL de 2x SSC. Incuber les lamelles pendant 5 minutes avec une agitation douce à la température ambiante.
7. Retirez le SSC 2x et ajoutez 500ΜL de 2X SSC. Incuber pendant 5 minutes sous agitation douce.
8. Placez un morceau de parafilm à plat au fond du four à hybridation. Pipettez 25 μL de tampon d'hybridation sur le parafilm pour chaque lamelle coulissante. Retirez le lamelle du plat de 24 puits (à ce stade, les lamelles sont à la cellule vers le haut) et placez le coté de la lamelle vers le bas vers le bas sur le tampon d'hybridation. Faites ceci à 42 ° C ou éventuellement à 65 ° C pendant 15 min.
   REMARQUE: l'achèvement de cette étape à 65 ° C dénatronera les ARN cellulaires; Cela peut améliorer le signal si le polyA est masqué par des interactions avec des protéines.
9. Diluer la sonde Biotin-Oligo (dT) (100 ng / μL) dans un tampon d'hybridation à une concentration de 2 ng / μL; 25 μL par lamelle est suffisante.
10. Pour chaque lamelle, pipettez 25 μL de tampon d'hybridation contenant Biotin-Oligo (dT) sur le parafilm. Ramassez la lamelle avec une pince et appuyez délicatement sur le bord de la lamelle sur un tissu de laboratoire pour enlever l'excèsTampon d'hybridation. Transférer le lamelleau au tampon d'hybridation avec Biotin-Oligo (dT); N'oubliez pas de garder le côté de la cellule vers le bas.
11. Placez les lamelles dans une boîte d'hybridation pour limiter l'évaporation. Incuber les lamelles avec Biotin-Oligo (dT) dans un tampon d'hybridation pendant 60 min à 42 ° C.
12. Placez 2x SSC dans le four d'hybridation pour lui permettre de s'équilibrer à 42 ° C.
13. Ajouter ~ 500 μL de SSC 2x réchauffé dans les puits dans le plat à 24 puits et utiliser une pince pour transférer les lamelles dans le puits. Incuber pendant 10 min.
14. Répétez l'étape de lavage ci-dessus deux fois à 42 ° C puis deux fois à la température ambiante.
15. Effectuez les étapes 3.5-3.10, en vous assurant d'utiliser un fluorochrome de streptavidine pour détecter le Biotin-Oligo (dT) au lieu d'un anticorps classique.

5. Ensemble de ribopuromycylation pour évaluer le statut translationnel

1. Placer les cellules U2OS sur les lamelles, comme indiqué à l'étape 1, mais seulement une lamelle couvre une assiette par condition (dans cetteCas, 3 lamelles: nontreated, arsénite de sodium 100 μM et 150 uM de vinorelbine) ( figure 1 A).
2. Cellules de stress utilisant le protocole à l'étape 2, complétant les étapes 2.1-2.4.
3. 5 min avant la fixation, ajouter 2 μL de puromycine (stock: 1,25 mg / mL, diluer 2 μL dans 500 μL pour obtenir une concentration finale de puromycine de 5 μg / mL) et 2,9 μL d'emetine (stock: 20 μg / mL, ajouter 2,9 μL à la même solution contenant déjà la puromycine) à chaque puits contenant 0,5 ml.
4. Effectuez les étapes 3.1-3.10 comme indiqué ci-dessus, en utilisant un anticorps anti-puromycine (dilution 1/1000) pour détecter la puromycine. Idéalement, utilisez deux autres marqueurs SG dans les canaux restants.
5. Lors de la quantification du signal de puromycine, prenez toutes les images en utilisant la même exposition. Choisissez cette exposition en utilisant l'échantillon le plus brillant (non résolu) et en prenant une image aussi brillante que possible sans saturation.
   NOTE: L'intensité du signal fluorescent anti-puromycine represUne traduction continue, car la puromycine se substitue à un acide aminé, incorpore la protéine naissante et applique la terminaison prématurée de la protéine.

6. Acquisition et analyse d'images

1. Quantifier les granulés de stress
   1. Pour quantifier les SG, acquérir 3 à 5 images totalisant 100 cellules par échantillon en utilisant un objectif 40X. Sinon, obtenez des images en utilisant d'autres objectifs, mais assurez-vous que> 100 cellules sont comptées par lamelle et que le grossissement est suffisamment grand pour visualiser clairement les granulés. Faites ceci en divisant la lamelle en cinq régions à peu près égales et en choisissant au hasard un champ de chaque région ( Figure 1B ); Les images du même champ devraient inclure tous les canaux pour évaluer la colocalisation des marqueurs.
   2. Une fois que toutes les images ont été acquises, fusionnez les chaînes. Un logiciel de caméra fera automatiquement cela, tandis que d'autres nécessitent une fusion manuelle; Cela peut se faire avecImageJ en ouvrant toutes les images puis en sélectionnant [Image | Couleur | Fusionner les canaux].
   3. Notez manuellement le nombre total de cellules en comptant le nombre de noyaux, en utilisant Hoechst comme marqueur de noyau. Comptez manuellement le nombre de cellules qui contiennent plus de deux SG par cellule.
      REMARQUE: par exemple, en utilisant une image fusionnée à trois canaux affichant G3BP1 (vert), eIF4G (rouge) et Hoechst (bleu), comptez les noyaux (ou nombre de cellules) à l'aide de la chaîne bleue. Ensuite, comptez les cellules SG positives comme celles avec deux focus jaunes ou plus par cellule. Les granulés apparaîtront en jaune, car le vert de G3BP1 et le rouge de eIF4G apparaissent jaunes s'ils sont colocalisés.
   4. Déterminer le pourcentage de cellules SG positives en combinant les données des 3 à 5 régions indépendantes, puis calculer:
      Nombre de SG positif / nombre de noyaux) * 100 = pourcentage de cellules SG positives
2. Évaluation de la colocalization par analyse de balayage de ligne - Méthode manuelle
   1. OuvrirImageJ. Téléchargez-le gratuitement depuis ()
   2. Ouvrez le gestionnaire de ROI: [Analyser | Outils | Responsable ROI ...].
   3. Ouvrez l'image fusionnée dans ImageJ: [Fichier | Ouvrir].
   4. À l'aide de l'outil de ligne situé dans la barre d'outils ImageJ, ajoutez une ligne qui passe par un SG, en vous assurant d'inclure avant et après le SG. Ajoutez cette ligne au gestionnaire de ROI en cliquant sur [Ajouter] dans la fenêtre du gestionnaire de ROI.
   5. Diviser l'image fusionnée en canaux séparés pour évaluer la localisation de chaque marqueur dans le granulé: [Image | Couleur | Split Channel]; Cela divise l'image fusionnée en trois images en noir et blanc.
   6. Dans l'image en noir et blanc, assurez-vous que la ligne est sélectionnée; La ligne est sélectionnée si elle apparaît dans l'image. Sinon, dans la fenêtre du gestionnaire de ROI, cliquez sur la ligne dans le panneau; Cela mettra en évidence la ligne en bleu dans la fenêtre du gestionnaire de ROI et rendra la ligne visible sur l'image en noir et blanc. Si la ligne n'apparaît toujours pas, assurez-vous que "Afficher tout" est chEcked dans le gestionnaire de ROI, puis cliquez sur la ligne dans l'image.
   7. Analyser l'intensité de la ligne: [Analyser | Profil de traçage]; Cela affichera la fenêtre "Profil de tracé", qui trace l'intensité du signal sur la ligne.
   8. Dans la fenêtre "Profil de tracé", cliquez sur [Liste], qui affiche une fenêtre contenant les données brutes du graphique. Copiez toutes les données dans cette fenêtre et collez-la dans un fichier de tableur. Pour ce faire, sélectionnez toutes les données dans la fenêtre: [Modifier | Tout sélectionner]. Copiez la date: [Modifier | Copie]. Ouvrez un fichier de tableur et collez les données: [Editer | Coller].
   9. Effectuez les étapes 6.2.6 - 6.2.8 pour chaque canal séparément. Assurez-vous de suivre la chaîne évaluée.
   10. Dans une feuille de calcul, générez un graphique linéaire des résultats. Sélectionnez les colonnes qui incluent des données en appuyant sur [contrôle] et en cliquant sur la lettre en haut de chaque colonne. Ensuite, sélectionnez le graphique linéaire: [Insérer | Graphique linéaire].
   11. Répétez cette analyse pour multIple stress granules à travers plusieurs expériences indépendantes.
3. Évaluation de la localisation par analyse de balayage linéaire - Plugin ImageJ
   1. Téléchargez et installez l'outil de profil RVB à partir du site Web ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Lorsqu'il est correctement installé, une icône rouge, verte et bleue (RVB) devrait apparaître dans la barre d'outils.
   2. Ouvrez l'image ( par exemple, Tiff, JPG) dans ImageJ: [Fichier | Ouvrir].
   3. Cliquez sur l'icône RVB située dans la barre d'outils ImageJ.
   4. Cliquez et faites glisser pour ajouter une ligne qui s'étend à travers un SG, en vous assurant d'inclure des régions adjacentes; Une image de l'histogramme apparaîtra dans une fenêtre contextuelle.
   5. Enregistrez les données sous forme d'image: [Fichier | Enregistrer sous | Tiff]. Sinon, exportez, puis graphez les données dans un autre programme graphique en utilisant l'étape 6.2.8 ci-dessus.

Résultats

Les foyers induits par le stress ne sont pas nécessairement des SG. Les SG sont classés comme des foyers cytoplasmiques qui contiennent des ARNm, des facteurs d'initiation de la traduction et des protéines liées à l'ARN et sont en équilibre avec la traduction active. Le protocole ci-dessus peut être utilisé comme modèle pour caractériser si un stress donné induit des SG de bonne foi .

Les SG se loca...

Discussion

Comme en témoignent les études immunohistologiques dans de multiples maladies, le stress chronique conduit à la formation de différents foyers intracellulaires. Par exemple, la plupart des maladies neurodégénératives sont caractérisées par des agrégats intracellulaires de protéines insolubles. La présence de protéines associées à SG dans de tels agrégats est souvent la base pour conclure que ces foyers sont des SG. Une conclusion similaire est également établie lorsque des foctes cytoplasmiques positiv...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
U-2 OS	ATCC	ATCC®HTB-96™	- commonly written as "U2OS" - culture at 37 °C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium	Corning	10-013-CV	- abbreviated DMEM - contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red - supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin - prewarm prior drug(s) dilution
Fetal Bovine Serum	Sigma	F2442-500ml	- abbreviated FBS - used to supplement media
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630-080	- used to supplement media
penicilline streptomycine	Sigma	P0781-100ml	- used to supplement media
24 well plate	Costar	3524
lab tissues	KIMTECH SCIENCE	34120	- commonly called "kimwipes"
Coverglass for Growth Cover Glasses	Fisher Scientific	12-545-82	- autoclaved before used - keep sterile in the tissue culture hood
Sodium (meta)arsenite ≥90%	Sigma	S7400-100G	- commonly called sodium arsenite and abbreviated SA - dissolution in water at 1 M concentration, then dilute to 100 µM as a working stock
Vinorelbine	TSZ CHEM	RS055	- abbreviated VRB - dissolve in water to 10 mM
Puromycin	Sigma	P9620	- used to assess translation level (ribopuromycylation) - used to assess SG connection with active translation - dilute in water to 10 mg/mL
Emetine dihydrochloride hydrate	Sigma	E2375	- used in combination with puro to assess general translation level - used to assess SG connection with active translation - dilute in water to 10 mg/mL
Cycloheximide	Sigma	C4859	- abbreviated CHX - used to assess SG connection with active translation - dilute in water to 10 mg/mL
Phosphate Buffered Saline	Lonza / VWR	95042-486	- abbreviated PBS - wash buffer for immunofluorescence
Paraformaldehyde reagent grade, crystalline	Sigma	P6148-500G	- make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved - aliquots can be stored at - 20 °C for several months - hazardous, use ventilation - discard in special waste
Methanol, ACS	BDH / VWR	BDH1135-4LP	- pre-chilled to -20°C before use - discard in special waste
Normal Horse Serum	Thermo Fisher Scientific	31874	- abbreviated NHS - dilute to 5% in PBS - add sodium azide for storage at 4°C - blocking solution for immunofluorescence
Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC	Decon Labs / VWR	89125-188	- dilute to 70% with water
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y)	Santa Cruz	sc-81940	- store at 4 °C - use at 1/100 dilution
rabbit anti eIF4G antibody (H-300)	Santa Cruz	sc-11373	- store at 4 °C - 1/250 dilution
goat anti eIF3η (N-20) antibody	Santa Cruz	sc-16377	- eIF3η is also known as eIF3b - store at 4 °C - 1/250 dilution
mouse anti puromycin 12D10 antibody	Millipore	MABE343	- store at 4 °C - 1/1000 dilution
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	715-225-150	- reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C - 1/250 dilution
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	711-165-152	- reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C - 1/2500 dilution
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	705-175-147	- reconstitute in water as per manufacturer’s instructions then store at 4°C - 1/250 dilution
Hoechst 33258 solution	Sigma	94403-1ML	- incubate with secondary antibodies -stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light - Store at 4 °C
Cy3 Streptavidin	Jackson Immunoresearch	016-160-084	- reconstitute in water as per manufacturer’s instructions, then store at 4°C - 1/250 dilution
oligo-(dT)40x probe biotinilated	Integrated DNA Technologies (IDT)	/	- reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20°C - dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use - custom order
hybridation box	/	/	- make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom - prewarm the box prior use
20 x SSC buffer	Thermo fisher Ambion	AM9763	- dilute to 2X SSC using RNase Free water (DEPC treated) - store at room temperature - wash buffer for FISH
PerfectHybPlus Hybridization Buffer	Sigma	H7033-50ml	- block and probe incubation buffer for FISH
slide mounting media	home made	/	- mix 5 g of “cold-soluble” poly(vinyl alcohol) in 20 ml of PBS - mix by sonication, followed by stirring overnight at RT - Add 5 ml of glycerol and 0.2 ml of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT - centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet - aliquot viscous liquid, long-term storage at -20°C, 1 week at 4°C
Parafilm "M"	Sigma	P7793-1EA	- usually referred as "parafilm"
Poly(vinyl alcohol)	Sigma	P-8136-250G	- reagent to make vinol
Glycerol	Sigma	G5516-100ML	- reagent to make vinol
sodium azide	Fisher Scientific	S2002-5G	- preservative agent for blocking solution and vinol - make a 20 % dilution in water