JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu el yazması, klinik ve çevresel V arasındaki hızlı ve güvenilir diferansiyasyon için topluca kullanılan bir dizi biyokimyasal tahlilin yanı sıra, uygun Vibrio kolera bakımı tekniklerini tanımlamaktadır. Bir laboratuar ortamında kolera biyotipleri.

Özet

Sucul Gram-negatif bakteri Vibrio cholerae , bulaşıcı gastrointestinal hastalık kolera'sının etyolojik ajanıdır. Bu hastalığın yaygınlığı ve şiddeti nedeniyle, V. Kolera, uygun bakım ve kültür teknikleri gerektiren çevresel ve laboratuvar ortamlarında kapsamlı olarak incelenmiştir. Klasik ve El Tor, V'yi oluşturan iki ana biyotiptir. Kolera O1 serogrup, her biri biyotip karakterizasyonu için güvenilir mekanizmalar sağlayan benzersiz genotipik ve fenotipik özellikler gösterir ve kültürel koşulları uyandıran virülans gerektirir. Herhangi bir enfeksiyon ya da salgın için nedensel suşun biyotipinden bağımsız olarak, hastalık için standart tedavi rehidrasyon terapisini antibiyotik rejimi ile takviye edilmesini içerir. Bununla birlikte, biyotip sınıflandırması laboratuar çalışmaları için gerekebilir ve biyomedikal alanda daha geniş etkilere sahip olabilir.2000'lerin başında hem klasik hem de El Tor biyotiplerinden genotipik ve fenotipik özellikler sergileyen klinik izolatlar tespit edildi. El Tor varyantları olarak adlandırılan yeni tanımlanan melezler, klinik ve çevresel izolat biyotip tanımlamasının önceki geleneksel tek deney tanımlama protokollerinden daha karmaşık hale gelmesine neden oldu. V'yi tanımlamanın yanı sıra. Kolera genel bakım ve kültür teknikleriyle, bu el yazması PCR temelli genetik ekranlar ve fenotipik tahliller (polimiksin B direnci, sitrat metabolizması, proteolitik aktivite, hemolitik aktivite, motilite ve glikoz metabolizması ile Voges- Proskauer tahlili), klasik ve El Tor biyotiplerini tanımlamak ve / veya ayırmak için topluca kullanılır. Bu analizler birlikte, alternatif olarak veya buna ek olarak pahalı, yoğun emek yoğun deneyler için etkili bir sistematik yaklaşım sağlamaktadır.V. Kolera klinik (ve çevresel) izolatlar.

Giriş

Kolera kirlenmiş yiyeceklerin veya sudaki Gram-negatif bakteri Vibrio cholerae'nin bulunduğu suyun tüketiminden kaynaklanan distal ince bağırsağın bir hastalığıdır. Kolera semptomları, kusma ve kontrol edilemeyen sulanmış ishale neden olur ve ciddi şekilde dehidrasyona yol açar ve düzgün tedavi edilmezse ölümle sonuçlanacaktır. V. Kolera, hücre yüzeyi lipopolisakarid O-antijeninin yapısına dayanan 200'den fazla serogrupa bölünebilir. Bununla birlikte, sadece 2 serogrup, O1 ve O139, epidemik veya pandemik potansiyel 1 , 2 göstermiştir. Dahası, serogrup O139, öncelikle Güneydoğu Asya 3 , 4 için izole edilirken, O1 serogrup dünya çapında dağıtılır. Ayrıca, O1 serogrup 2 ana biyotipe ayrılabilir: klasik ve El Tor. Klasik biyotip, ilk 6 kolera salgından sorumluyduS devam ediyor. Yürürlükteki yedinci pandemi, klasik biyotipi 5 , 6 , 7 ortamında küresel olarak değiştiren El Tor biyotipinin bir sonucudur. Son zamanlarda, klasik ve El Tor biyotiplerinin 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 ayırıcı özelliklerini içeren ve bu tarihten itibaren El Tor varyantları 13 , 17 olarak adlandırılan suşlar ortaya çıkmıştır. Bazı El Tor varyantları, daha önce gözlemlenenden daha hızlı ve şiddetli hastalığın ilerlemesi ile artan virülans yetenekleri gösterdiğini vurguluyorAjan tanımlama ve hastalık önleme ve tedavisine yönelik daha kapsamlı bir yaklaşım gereği 8 , 9 , 18 . Biyotip tanımlaması tedaviyi derhal belirtmezken, aşı geliştirmede ilerlemeler ve gelecekteki terapötik ajanlar biyotip ayrımından yararlanabilir.

Burada listelenen protokollerin ilk serisi, araştırmacıların V'yi düzgün bir şekilde muhafaza etmelerini sağlayacaktır. Kolera atıkları laboratuar ortamında. Tutarlılık ve müteakip analiz, stokların hazırlanmasını ve izolatların büyümesini gerektirir; bu, biyotipe bağımlı değildir. Bununla birlikte, virülans gen ekspresyonunu optimal olarak teşvik etmek için, bağımsız biotipe özgü kültürleme teknikleri gereklidir 19 . Ayrıca, bu yazıda çeşitli genetik ve biyokimyasal tahliller için hazırlıklar özetlenmiştir.

Kolera toksini (BT) ve toksin birlikteGulated pilus (TCP), V'nin her iki biyotipinde ana düzenleyici ToxT tarafından kontrol edilen iki ana virülans faktördür. Kolera O1 serogrup 20 . CT, beş CtxB'den oluşan iki parçalı bir toksindir Tek bir CtxA altbirimini çevreleyen alt birimlerdir ve kolera ile ilişkili hızlı elektrolit kaybından sorumludur. TCP, tcp operon ( tcpABQCRDSTEF ) tarafından kodlanan bir tip IV pilus olup, distal ince bağırsağın tutunması ve kolonizasyonu ile ilgilidir. TcpA , pilusun yapımı için gerekli olan tek tek pilin alt birimlerini kodlayan tcp operonunun ilk genidir 8 . CtxA için gen dizisi, klasik ve El Tor biyotipleri arasında tamamen korunurken, ctxB ve tcpA iki biyotip arasında farklılık gösterir, ancak her biyotip 8'de korunmaktadır. CtxB , iki taban pozisyondan başka biotipler arasında tamamen korunmuştur(115 ve 203). El Tor biyotipinde, timin 115 ve 203 baz pozisyonlarında bulunurken, klasik biyotip bu bazlarda sitozin içerir. TcpA her biyotip içinde tamamen korunur, ancak biyotipler arasındaki çoklu bazlarda farklılık gösterir. Bu genetik farklılıklar birincil biyotip tanımlama markörleri olarak görev yapar ve bu siteleri de içeren polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyon ürününün diziliminden sonra, izotop dizileri, biyotip arka planını belirlemek için vahşi tip (WT) klasik O395 veya WT El Tor N16961 ile karşılaştırılabilir Belirli bir V. cholerae izolatında BT ve TCP'nin sırasıyla.

Klasik ve El Tor biyotipleri 21 , 22 , 23 arasındaki fenotipik ayrımları karakterize etmek için çok sayıda protokol geliştirildi. Polimiksin B, Gram negatif bakta dış hücre zarı bütünlüğünü tehlikeye atan bir peptid antibiyotiktirTeria ve polimiksin B direnci, polimiksin B direnci tahlili ile görselleştirilebilir 21 . Sitrat Kreb döngüsünün birincil alt tabakasıdır ve sitratın tek bir karbon kaynağı olarak metabolize olabilme özelliği, sitrat metabolizması tahlili 22 kullanılarak saptanabilir. HapR , çeşitli promotör bölgelerine bağlanan ve gen ve operon ifadesini düzenleyen, global bir düzenleyiciyi ve ana çekirdeği algılayan düzenleyiciyi kodlar V. cholerae, HapR'de kodlar 24 . V. cholerae'nin bazı patojenik suşları, hapR geninde, virülans gen ekspresyonunun yoğunluğa bağlı düzenlenmesinin 24 , 25 yaşında kaybolmasına neden olan doğal olarak meydana gelen bir çerçeve kayması mutasyonuna sahiptir. Süt agar medyumu kullanarak HapR ile düzenlenmiş proteaz aktivitesinin ölçülmesi, araştırmacıya belirli bir izolatın işlevsel bir HapR 23 içerdiğini belirlemesine izin verir.Hemoliz testi, bir suşun kırmızı kan hücrelerini parçalayan hemolitik enzimleri salgılama kabiliyeti için test eder; Hemoliz derecesi kan agar plakalarında 23 görülebilir. Hareket genellikle V. cholerae virulence ile ilişkilidir ve motilite agar plakaları 23 kullanılarak analiz edilebilir. Voges-Proskauer tahlili, bir suşun tek bir karbon kaynağı olarak glikozu fermente etme ve yan ürün asetoin 21 üretme kabiliyeti için test eder. El Tor değişkenlerinin ortaya çıkmasıyla, geniş genotipik tarama yapılmadan ve V'nin biyotip arka planını çıkarmadan önce, herhangi bir fenotipik analizin sonuçlarını tahmin etmek zordur. Kolera izolatları için, bu tahlillerin 23 bir araya getirilmesinin ve sonuçların Tablo 2'deki gibi referans suşlarla karşılaştırılması önerilir.

Burada, toplu olarak bahsedilenleri kullanan bir seri protokol geliştirdik.V genini karakterize eden daha kapsamlı bir yaklaşım için genotipik ve fenotipik testler. Kolera biyotipleri. Ayrıca, bilinen V genotipik ve fenotipik ayrımlarını tanımladık. Kolera El Tor değişkenleri (MQ1795 ve BAA-2163), yaygın olarak kullanılan biyotip referans suşlarına kıyasla (WT klasik O395, WT El Tor C6706 ve WT El Tor N16961, Tablo 1 ) karşılaştırılmıştır. El Tor varyantlarının ortaya çıkışı, daha önce kullanılan tekli tahlil biyotip karakterizasyon protokollerinin güvenilirliğine meydan okuyor; Bununla birlikte, bu çoklu tahlil tanımlama sistemi, klinik ve çevresel V'nin daha güvenilir tanımlanmasına olanak tanır. Kolera izolatları.

Protokol

Not: Her tahlil için zaman faktörleri ayrı ortam hazırlıkları için farklı zaman gerektirdiğinden yapılmalıdır. Örneğin, katı agar plakası ortamının yeterince soğumasına ve kurumasına (1-2 gün) izin verilmelidir. Ek zaman faktörleri ( yani, tek koloni ve gece boyunca kültür büyümesi) her protokol altında belirtilmiş ve Tablo 2'de bulunmuştur.

1. Medyanın Hazırlanması

  1. 1x Fosfat Tamponlu Tuz (PBS)
    1. 4.0 g NaCI, 0.1 g KCI, 0.72 g Na2HP04 ve 0.12 g KH2PO4 tartın. Bileşenleri 1 L'lik bir Erlenmeyer şişesi içerisinde birleştirin, hacmi deiyonize su ile 500 mL'ye ayarlayın, bir pH metre kullanarak pH'ı 7.2'ye ayarlayın ve çözeltiye damla damla HC1 ilave edin ve 0.22 μm'lik bir filtre kullanarak otoklav veya filtre sterilize edin. 1x PBS süresiz olarak oda sıcaklığında saklanabilir.
      DİKKAT: HC1 konsantre bir asittir ve buna göreKurumsal, yerel, eyalet ve federal yönetmeliklere. Uygun taşıma talimatları için, üretici tarafından sağlanan güvenlik bilgi formuna bakın.
  2. Luria-Bertani (LB) Broth
    1. 5.0 g tripton, 2.5 g maya özütü ve 2.5 g NaCI'yi tartın. Bileşenleri 1 L'lik bir şişede birleştirin, hacmi deiyonize su, otoklav ile 500 mL'ye ayarlayın ve 6 aya kadar oda sıcaklığında saklayın. Klasik biyotip virulence indükleme koşulları için, otoklavlamadan önce HC1 kullanarak pH'ı 6.5'e ayarlayın.
  3. % 0.03 (a / h) NaHC03 içeren AKI Ortamı
    1. Bileşen 1 için (AKI ortamı): 7.5 g pepton, 2.0 g maya ekstraktı ve 2.5 g NaCl tartılır. Bileşenleri 1 L'lik bir şişede birleştirin, deiyonize su ve otoklav ile hacmi 450 mL'ye ayarlayın. AKI ortamı oda sıcaklığında 6 aya kadar depolanabilir.
    2. Bileşen 2 için (NaHC03): 1.5 g NaHC03 tartılır ve hacim ayarlanırSteril bir vezikülde deiyonize su ile 50 mL'ye kadar soğutulur. Filtre, 0.22 um'lik bir filtre kullanarak NaHCO 3'ü sterilize edin. NaHCO 3 , kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır.
    3. Kullanmadan önce Bileşen 2'yi Bileşen 1'e filtreleyerek iki bileşeni aseptik olarak birleştirerek 1:10 oranını oluşturun.
  4. Luria-Bertani (LB) Ağar Pleytleri
    1. 5.0 g tripton, 2.5 g maya özütü, 2.5 g NaCl ve 7.5 g agardan tartılır. Bileşenleri 1 L'lik bir Erlenmeyer şişesi içinde birleştirin, hacmi, deiyonize su, otoklav ile 500 mL'ye ayarlayın ve standart boyutlu 100 mm x 15 mm steril Petri kaplarında hazırlayın. Kaplamalı ortam, kapak tarafı 4 ° C'de 6 aya kadar plastik içinde saklanabilir.
  5. Polimiksin B ile Tamamlanan LB Agar Plakaları
    1. Bileşen 1 (LB agar) için: 5.0 g tripton, 2.5 g maya özütü, 2.5 g NaCl ve 7.5 g agar tartılır. Bileşenleri 1 L'lik bir Erlenmeyer şişesi içerisinde birleştirin, hacmi 500 mL'ye ayarlayın.Deiyonize edilmiş su ve otoklav.
    2. Bileşen 2 (polimiksin B) için: polimiksin B'yi steril 2 mL mikrosantrifüj tüpünde 50.000 IU / μL konsantrasyona kadar deiyonize su içinde eritin ve 0.22 μm filtre kullanarak sterilize edin.
    3. Bileşen 1 dokunulduğunda serin, ancak katılaşmadıktan sonra, 50 μM / μL'lik bir nihai konsantrasyon oluşturarak Bileşen 1'e aseptik olarak 500 μL Bileşen 2 ekleyin ve iyice karıştırın. Petri kaplarına karışık agar medyum dökerek standart boyutlu 100 mm x 15 mm steril Petri yemekleri hazırlayın. Kaplamalı ortam, plastik kaplı olarak 3 aya kadar, kapak tarafı da 4 ° C'de saklanabilir.
  6. Minimal Sitrat Orta Agar Tabakları
    1. Bileşen 1 için (bromotiol mavisi olan agar): 7.5 g agar ve 0.02 g bromotimol mavi ağırlığındadır. Bileşenleri 1 L'lik bir Erlenmeyer şişesi içinde birleştirin, deiyonize su ile hacmi 450 mL'ye ayarlayın ve karışımı otoklavlayın.
    2. Bileşen 2 için (10x VBMM): 1 tartın0,0 g MgS04 7H20, 10,0 g sitrik asit H2O, 50,0 g susuz K2HPO4 ve 17,5 g NaNH4HP04 4H20. Bileşikleri 1 L'lik bir Erlenmeyer şişe içerisinde birleştirin, hacmi 500 mL'ye ayarlayın Deiyonize su ve otoklav ile veya 0.22 um'lik bir filtre kullanarak filtre sterilize edin. 10x VBMM oda sıcaklığında 6 aya kadar depolanabilir.
    3. Bileşen 1'e 50 mL Bileşen 2 ekleyin ve Petri kaplarına karışık agar medyum dökerek standart boyutlu 100 mm x 15 mm steril Petri yemekleri hazırlayın. Kaplamalı ortam, kapak tarafı 4 ° C'de 6 aya kadar plastik içinde saklanabilir.
  7. Süt Agar Tabakları
    1. Parça 1 (süt) için: 1 litrelik bir Erlenmeyer şişe içinde kuru gıdadan 8.0 g ağırlığında, deiyonize su ve otoklav ile hacmi 200 mL'ye ayarlayın.
    2. Bileşen 2 (beyin-kalp infüzyonlu agar) için: 3.68 g beyin-kalp infüzyonu ve 6.0 g agar ağırlığındadır. Konuyu birleştir500 mL'lik bir Erlenmeyer şişesi içerisinde çözündürülür, hacmi deiyonize su ve otoklav ile 200 mL'ye ayarlayın.
    3. İki bileşeni, otoklavdan sonra Bileşen 1'e dökerek birleştirin ve iyice karıştırın. 150 mm x 15 mm steril Petri yemekleri hazırlayın. Süt plakaları plastik kaplı, kapak tarafı 4 ° C'de bir hafta kadar saklanabilir. Karışık agar medya Petri yemekleri dökerek 150 mm x 15 mm steril Petri yemekleri hazırlayın.
  8. Hareketlilik Agar Tabakları
    1. Bileşen 1 (LB agar) için: 5.0 g tripton, 2.5 g maya özütü, 2.5 g NaCl ve 2.0 g agar tartılır. Kurucu maddeleri 1 L'lik bir Erlenmeyer şişesi içerisinde birleştirin, hacmi deiyonize su ve otoklav ile 500 mL'ye ayarlayın.
    2. Bileşen 2 için (% 1 (a / a) trifeniltetrazolyum klorür; TTC): 0,25 g TTC ağırlığında. Steril vezikül içinde deiyonize su ile hacmi 25 mL'ye ayarlayın ve 0.22 μm filtre kullanarak filtre sterilize edin. Oda sıcaklığında sarılı 6 aya kadar saklayınIşık maruziyetini en aza indirgemek için folyo halinde.
    3. Otoklavlı medyaya 2.5 mL% 1 (w / v) steril TTC ekleyin.
    4. Ortamı olabildiğince kalın (≥50 mL / plaka) büyük 150 mm x 15 mm steril Petri kaplarına koyun. Kaplamalı ortam, kapak tarafı 4 ° C'ye kadar bir hafta kadar plastik saklanabilir. Karışık agar medya Petri yemekleri dökerek 150 mm x 15 mm steril Petri yemekleri hazırlayın.
  9. Voges-Proskauer (VP)
    1. Bileşen 1 için (Methyl Red-Voges-Proskauer broth; MR-VP): 500 mL'lik bir Erlenmeyer şişesi içinde 1.7 g MR-VP ortamı tartın, hacmi deiyonize su ve otoklav ile 100 mL'ye ayarlayın. Steril MR-VP suyu oda sıcaklığında 6 aya kadar depolanabilir.
    2. Bileşen 2 için (% 5 (a / a) alfa (α) naftol): 1.0 g α-naftolü steril bir vezikül içinde tartın ve hacmi,% 95 etanol ile 20 mL'ye ayarlayın. Α-naftol oda sıcaklığında 1 hafta boyunca depolanabilir ve ışık exp değerini en aza indirgemek için folyoyla sarılabilir.osure.
    3. Bileşen 3 için (% 40 (w / v) potasyum hidroksit; KOH) steril vezikül içinde 20.0 g KOH tartın, steril deiyonize su ile hacmi 50 mL'ye ayarlayın. KOH, plastik bir kapta oda sıcaklığında 6 aya kadar depolanabilir.

2. V. Bakım ve Büyüme. Kolera suşları

  1. Dondurulmuş Stok Kültürlerinin Hazırlanması ve Kullanımı
    1. Steril 2 mL lik bir mikrosantrifüj tüpünde santrifüj (≥8,600 xg) ile 2 dakika boyunca sıvı gece boyunca kültürde 1.8 mL peletleyin, süpernatantı alın ve pipetleme ile taze LB suyu 900 μL'de hücre peletini tekrar askıya alın.
    2. Kültürü steril% 60 (v / v) gliserol 900 mcL ekleyin ve vorteksleme ile karıştırın.
    3. Karışımı steril 2 mL'lik kriyojenik bir tüpe aktarın ve -80 ° C'de süresiz olarak saklayın.
    4. Kullanmak için, steril bir inokülasyon halkası kullanarak küçük miktarda dondurulmuş stok çıkarın ve LB ag üzerinde tek koloniler çizinAr levhaları. Kültürlerin tamamen çözülmesini önlemek için donduktan hemen sonra -80 ° C'ye getirin. Plakaları kapak tarafı aşağıya 37 ° C'de 12 ila 16 saat inkübe edin.
  2. Sıvı Ortamda Gecelik Kültürlerin Büyümesi
    1. Donmuş stoktan LB agar plakalarına tek koloniler için (2.1.4'e göre) çizgiler. Plakaları kapak tarafı aşağıya 37 ° C'de 12 ila 16 saat inkübe edin.
    2. Steril bir aplikatör çubuğu ile tekli koloni yüzeyine dokunarak ve sıvı suyu içine koloni aktararak, tek bir koloni ile steril 10 mL kültür tüp 4 ml sıvı LB suyu inoküle edin.
    3. 37 ° C'de 12 ila 16 saat 225 rpm'de çalkalayıcı inkübatörde havalandırma ile inkübe edin.
  3. Büyüme Eğrisi
    1. Daha önce protokol 2.2'de belirtildiği gibi, sıvı LB suyu içinde gece kültür hazırlayın.
    2. Gece kültürünün 1: 100 seyreltmesini 250 μL gece kültürü 2'ye aktararak yapın5 mL taze LB suyu, steril 250 mL'lik Erlenmeyer şişesi içerisinde.
    3. Sıvı kültürlerin optik yoğunluğunu 600 nm'de (OD 600 ) her saat başı inokülasyon (T 0 ) zamanında ölçün.
    4. 37 ° C'ye kadar 30 saate kadar 225 rpm'de çalkalayıcı inkübatöründe havalandırma ile gece kültürü 1: 100 oranında seyreltin veya kültür maksimum yoğunluğa erişene kadar inkübe edin.
    5. OD 600'ün Zamanına grafiği çizin ve her suş için yaklaşık katlama süresini belirlemek için doğrusal regresyonu kullanın.
  4. El Tor Biotip Virulans İndükleme Koşulları
    1. Donmuş stoktan LB agar plakalarına tek koloniler çizin. Plakaları kapak tarafı aşağıya inkübe edin, 12-16 saat boyunca 37 ° C'de.
    2. Tek bir koloni ile% 0.03 (w / v) NaHC03 içeren 10 mL AKI ortamı inoküle edin.
    3. 37 ° C'de havalandırma olmadan kültürü 3.5 saat inkübe edin.
    4. 7 mL kültür çıkarın ve kalan 3 mL kültürü inkübe edinBir çalkalayıcı inkübatöre havalandırma ile 225 rpm'de ilave bir 4 saat tekrar uygulayın.
  5. Klasik Biyotip Virulans İndükleme Koşulları
    1. Donmuş stoktan LB agar plakalarına tek koloniler çizin. Plakaları kapak tarafı aşağıya 37 ° C'de 12 ila 16 saat inkübe edin.
    2. Tek bir koloni ile 4 mL sıvı LB suyu (pH 6.5) aşılayın.
    3. 30 ° C'de 12 ila 16 saat 225 rpm'de çalkalayıcı inkübatöründe havalandırma ile inkübe edin.
  6. 1x PBS'de Hücre Peletini Yıkama
    1. Steril 2 mL lik bir mikrosantrifüj tüpünde santrifüje (≥8,600 xg) ile 2 dakika boyunca gece boyunca kültür 1.8 mL peletleyin ve bir pipet kullanarak süpernatantı çıkarın. Pipetleme ile 1.8 mL 1x PBS içinde hücre süspansiyonunu yeniden askıya alın.
    2. Yıkama prosedürünü üç kez tekrarlayın, ardından 1.8 mL 1x PBS içinde nihai bir yeniden süspansiyon uygulayın.

3. V karakterizasyonu. Kolera biyotipleri

  1. PCtxB ve tcpA'yi kullanarak CR tabanlı Genetik Ekranlar
    1. Sırasıyla ctxB ve tcpA'nın translasyonel başlangıç ​​ve durma yerlerinin yaklaşık 50-70 bp yukarı akış ve aşağı akış hızlarına sahip bir dizi primer dizayn edin.
    2. Daha önce protokol 2.2'de belirtildiği gibi, sıvı LB suyu içinde gece kültür hazırlayın.
    3. Kromozomal DNA'yı, Gram negatif bakteriler için tasarlanmış piyasada bulunan bir kit kullanarak izole edin. Saflaştırılmış kromozomal DNA -20 ° C'de süresiz olarak saklanabilir. Ticari olarak temin edilebilen kitleri kullanarak kromozomal DNA izolasyonu genellikle yaklaşık 4 saat sürer.
    4. Kromozomal DNA örneğinin yüksek kalitede olmasını sağlamak için bir mikro-hacim spektrofotometre kullanın (A 260/280 > 1.8).
    5. Her bir kromozom DNA izolatı için, steril 200 μL PCR tüpü içerisinde buz üzerine polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) hazırlayın ve standart PCR bileşenleri kullanılarak ctxB ve tcpA bölgelerini çoğaltın: Taq polimeraz ve buFfer (veya eşdeğerleri), dNTP çözeltisi ve ileri / geri primerler. Standart PCR parametrelerini kullanın (~ 3 saat). Örneğin, aşağıdaki protokolü kullanın:
      1. İlk denatürasyon 95 ° C'de 120 sn.
      2. 95 ° C'de 60 saniye boyunca denature edin.
      3. Anneal astarları 60 ° C'de 45 saniye süreyle.
      4. 90 ° C'de 72 ° C'de genleşin.
      5. 34 devir için 3.1.5.2 ile 3.1.5.4 arasındaki adımları tekrarlayın.
      6. Son uzantı 72 ° C 600 s.
      7. Sonsuz 4 ° C'de tutun.
    6. Standart bir 6x DNA jel yükleme boyası kullanarak ilgili PCR ürünlerinin 5 μl'ini boyayın ve 1x Tris-Borat-EDTA (TBE) içerisinde% 1 agaroz jel üzerine yaklaşık 10 mcL 1 kb merdiven ve 10 uL PCR ürünü yükleyin. tampon.
    7. Jel elektroforezi 130 V'da boya önü jelin sonuna gelene kadar (yaklaşık 90 dakika) çalıştırın. Voltaj ve çalışma süreleri ekipmana bağlı olarak değişebileceğinden, sabit izleme önerilir.
    8. Doğrulama üzerineBeklenen büyüklükte başarılı PCR amplifikasyonu, kalan 45 μL PCR ürününü ticari olarak mevcut bir DNA temiz ve konsantratör kiti kullanarak arındırın.
    9. Sıra, PCR amplifikasyonu için kullanılan aynı primerler kullanılarak PCR ürün (lerini) temizledi ve yerel sıralama düzeni talimatlarına göre hazırlandı.
    10. Her bir izolattan gelen gen dizilerinin FASTA biçimini, NCBI web sitesinde (http://www.ncbi.nlm.nihm.gov/gene/) bulunan yayınlanmış diziyle karşılaştırarak, arama sorgu kutusundaki aşağıdaki erişim numaralarını arayın.
    11. CtxB : (klasik) VC0395_A1059 ile VC0395_A1060 (El Tor) arasında VC_1456
    12. TcpA : (klasik) VC0395_A0353 (El Tor) VC_0828
  2. Spotting yoluyla biyotip sınıflandırması için fenotipik tahliller
    1. Daha önce protokol 2.2'de belirtildiği gibi, sıvı LB suyu içinde gece kültür hazırlayın.
    2. Hücre pelet (ler) i protokol 2.6'da belirtildiği şekilde yıkayın.
    3. Bir pipetleİlgili ortamda 1 μL yıkanmış küf kültürleyin. Orta seçim ve inkübasyon spesifikasyonları için Tablo 2'ye bakın.
  3. Hareket Testi
    1. Daha önce protokol 2.2'de belirtildiği gibi gece boyunca kültür (leri) sıvı LB suyu içinde hazırlayın.
    2. Hücre pelet (ler) i protokol 2.6'da belirtildiği şekilde yıkayın.
    3. Yıkanan sıvı kültür içine inokülasyon bıçağı takarak motilite agar plakalarını aşılayın ve medyaya dikey olarak "bıçakla" sokun. Her inokülasyon sırasında, bir boğaz yakıcı kullanarak tel bıçağını sterilize edin ve ağarı bıçaklandığında, sonuçların değişmesi için inokulasyon bıçağının bükülmediğinden emin olun.
    4. Plakaları kapak tarafını 14 ila 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 14 saat sonra, hareketlilik plakalarını yakından izleyerek kültürlerin aşırı büyümesini önleyin.
  4. Voges-Proskauer (VP) Testi
    1. Daha önce protokol 2.2'de belirtildiği gibi gece boyunca kültür (leri) sıvı LB suyu içinde hazırlayın.
    2. İnoküle et 4ML metil kırmızı Voges-Proskauer veya MR-VP besiyeri ile önceden hazırlanmış 10 ul'lik bir gece kültürü, steril bir kültür tüpünde 4 mL MR-VP suyu içine pipetle konur ve 12 ila 16'lık 225 rpm'de bir çalkalayıcı kuluçka havası ile inkübe edilir Saat 37 ° C'de.
    3. Sırasıyla steril kültür tüpleri içinde 1 mL'lik MR-VP gece kültürü kısımlarına 150 uL% 5 (a / a) a-naftol ve 50 μL% 40 (a / a) KOH ilave edin.
    4. Kısaca vorteks ve renk değişikliği gelişene kadar oda sıcaklığında 4 saate kadar bekletin.

Sonuçlar

Herhangi bir bakteri suşunun uygun şekilde bakım ve kullanımı için, ilgili suşların katlanma zamanını bilmek tavsiye edilir. Burada, yaygın olarak kullanılan V'nin değişen büyüme oranları. Kolera suşları bir büyüme eğrisi vasıtasıyla gösterildi ve yaklaşık çiftleme süreleri doğrusal regresyon kullanılarak hesaplandı. WT El Tor N16961 ve El Tor varyantı MQ1795, WT klasik O395'e (~ 2 saat) kıyasla daha kısa katlanma süreleri (sırasıyla...

Tartışmalar

Belirlenen 200'den fazla V. Kolera serogrupları, sadece O1 ve O139 epidemik potansiyele sahiptir. O1 serogrup iki biyotipe ayrılabilir: klasik ve El Tor. Bununla birlikte, El Tor'un 13 ve 17 tipi olarak adlandırılan melez soyları, El Tor'un biyotip arka planına sahip ve 8 , 9 , 10 , 11 ,

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

NIH Ulusal Tıp Bilimleri Enstitüsünden bir Kurumsal Gelişim Ödülü (IDeA), P20GM103506 aracılığıyla New Hampshire-INBRE tarafından desteklenen araştırma.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb DNA LadderNew England BiolabsN3232Shttps://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder
60% GlycerolCalbiochem356352http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352
AgarBecto, Dickinson and Co.214030http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch
Agar with brain-heart infusionBecto, Dickinson and Co.237500http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch
AgarosePeqlab732-2789https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+&currentLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+
Anhydrous K2HPO4Fisher ScientificP288-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID
Blood Agar PlatesRemelR01200Store at 4 °C;  http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar
Boric AcidFisher ScientificA73-500https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID
Bromothymol BlueFisher ScientificB388-10https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID
Cirtric acid ·H2OFisher ScientificS72836-3https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363
Deoxynucleotide (dNTP) Solution KitNew England BiolabsN0446SStore at -20 °C;  https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset
Disodium EDTAFisher ScientificS311-500https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID
DNA Clean & Concentrator™ -25 KitZymo ResearchD4007http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit
GelGreen Nucleic Acid StainBiotium41005https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/
Genesys 10SUV-VIS SpectrophotometerThermo Scientific840-208100https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100
Gentra Puregene Yeast/Bact. KitQiagen158567https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation
HClFisher ScientificA144-212Corrosive;  https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID
KClFisher ScientificP217-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID
KH2PO4Fisher ScientificP285-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID
KOHFisher ScientificP250-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID
Le LoopDecon Labs Inc.MP190-25http://deconlabs.com/products/leloop/
Le StabDecon Labs Inc.MP186-5http://deconlabs.com/products/lestab/
MgSO4·7H2OFisher ScientificM63-500https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis SystemBio Rad Labs1704406http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373
MR-VP BrothDifco216300http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch
Na2HPO4Fisher ScientificS374-500https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID
NaClFisher ScientificS271-10https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID
NaHCO3Fisher ScientificS233-500https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&searchTerm=S233500&searchType=RAPID
NaNH4HPO4·4H2OFisher ScientificS218-500https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID
NanoDrop Lite SpectrophtometerThermo ScientificND-LITE-PRhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR
Nonfat dry milkNestle CarnationN/AN/A
PeptoneBecto, Dickinson and Co.211677http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch
Petri Dishes (100 mm x 15 mm)Fisher ScientificFB0875712https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712
Petri Dishes (150 mm x 15 mm)Fisher ScientificFB0875714https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID
Polymyxin B sulfate saltSigma-AldrichP1004-10MUStore at 2-4 °C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en&region=US
Taq DNA PolymeraseNew England BiolabsM0273SStore at -20 °C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer
Taq Reaction BufferNew England BiolabsM0273SStore at -20 °C;  https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer
Thermal Cycler Bio-Rad C1000 Touch™ Bio Rad Labs1840148http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME
Triphenyltetrazolium chlorideAlfa AesarA10870https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/
Tris BaseFisher ScientificBP152-1https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&searchTerm=BP1521&searchType=RAPID
TryptoneBecto, Dickinson and Co.211705http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch
Yeast ExtractBecto, Dickinson and Co.212750http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch
α-naptholMP Biomedicals204189http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189

Referanslar

  1. Shimada, T., et al. Extended serotyping scheme for Vibrio cholerae. Curr. Microbiol. 28 (3), 175-178 (1994).
  2. Yamai, S., Tadayuki, O., Toshio, S., Yasuji, K. Distribution of serogroups of Vibrio cholerae non-O1 non-O139 with specific reference to their ability to produce cholera toxin, and addition of novel serogroups. Jpn. J. Infect. Dis. 71 (10), 1037-1045 (1997).
  3. Karaolis, D. K., Lan, R., Reeves, P. R. The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent clones separately derived from environmental, nontoxigenic, non-O1 Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 177 (11), 3191-3198 (1995).
  4. Albert, M. J., et al. Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae O139 synonym Bengal. Lancet. 342 (8868), 387 (1993).
  5. Barua, D., Barua, D., Greenough III, W. B. History of Cholera. Cholera. , 1-36 (1992).
  6. Morales, R., Delgado, G., Cravioto, A., Faruque, S. M., Nair, G. B. Population Genetics of Vibrio cholerae. Vibrio cholerae-Genomics and Molecular Biology. , 29-47 (2008).
  7. Samadi, A. R., Chowdhury, M. K., Huq, M. K., Khan, M. U. Seasonality of classical and El Tor cholera in Dhaka, Bangladesh: 17-year trends. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 77 (6), 853-856 (1983).
  8. Son, M. S., Megli, C. J., Kovacikova, G., Qadri, F., Taylor, R. K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 49 (11), 3739-3749 (2011).
  9. Ghosh-Banerjee, J., et al. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 48 (11), 4283-4286 (2010).
  10. Ansaruzzaman, M., et al. Cholera in Mozambique, variant of Vibrio cholerae. Emerg. Infect. Dis. 10 (11), 2057-2059 (2004).
  11. Ansaruzzaman, M., et al. Genetic diversity of El Tor strains of Vibrio cholerae O1 with hybrid traits isolated from Bangladesh and Mozambique. Int. J. Med. Microbiol. 297 (6), 443-449 (2007).
  12. Lan, R., Reeves, P. R. Pandemic spread of cholera: genetic diversity and relationships within the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism. J. Clin. Microbiol. 40 (1), 172-181 (2002).
  13. Nair, G. B., Faruque, S. M., Bhuiyan, N. A., Kamruzzaman, M., Siddique, A. K., Sack, D. A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 40 (9), 3296-3299 (2002).
  14. Nair, G. B., et al. Isolation of Vibrio cholerae O1 strains similar to pre-seventh pandemic El Tor strains during an outbreak of gastrointestinal disease in an island resort in Fiji. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1559-1562 (2006).
  15. Nair, G. B., Mukhopadhyay, A. K., Safa, A., Takeda, Y., Faruque, S. M., Nair, G. B. Emerging hybrid variants of Vibrio cholerae O1. Vibrio cholerae—Genomics and Molecular Biology. , 179-190 (2008).
  16. Safa, A., et al. Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae O1 that are hybrids between classical and El Tor biotypes. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1563-1569 (2006).
  17. Nusrin, S., et al. Diverse CTX phages among toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139 strains isolated between 1994 and 2002 in an area where cholera is endemic. J. Clin. Microbiol. 42 (12), 5854-5856 (2004).
  18. Carignan, B. M., Brumfield, K. D., Son, M. S. Single nucleotide polymorphisms in regulator-encoding genes have an additive effect on virulence gene expression in a Vibrio cholerae clinical isolate. mSphere. 1 (5), e00253 (2016).
  19. Iwanaga, M., Yamamoto, K., Higa, N., Ichinose, Y., Nakasone, N., Tanabe, M. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor. Microbiol. Immunol. 30 (11), 1075-1083 (1986).
  20. DiRita, V. J., Claude, P., Georg, J., Mekalanos, J. J. Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (12), 5403-5407 (1991).
  21. Kovacikova, G., Lin, W., Skorupski, K. Duel regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive Lys-R type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 57 (2), 420-433 (2005).
  22. Vogel, H. J., Bonner, D. M. Acetylornithinase of Escherechia coli: partial purification and some properties. J. Biol. Chem. 218 (1), 97-106 (1956).
  23. Son, M. S., Taylor, R. K. Genetic screens and biochemical assays to characterize Vibrio cholerae O1 biotypes: classical and El Tor. Curr. Protoc. Microbiol. , 6A.2.1-6A.2.17 (2011).
  24. Kovacikova, G., Skorupski, K. Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter. Mol. Microbiol. 46 (4), 1135-1147 (2002).
  25. Wang, Y., et al. The prevalence of functional quorum-sensing systems in recently emerged Vibrio cholerae toxigenic strains. Environ. Microbiol. Rep. 3 (2), 218-222 (2011).
  26. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
  27. Martinez, R. M., Megli, C. J., Taylor, R. K. Growth and laboratory maintenance of Vibrio cholerae. Curr. Protoc. , 6A.1.1-6A.1.6 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm nolojiSay 123BakteriyolojiB y mebak mbiyotiplerklasikEl TorEl Tor varyantlarvir lansbiyokimyasal analizler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır