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요약

이 원고는 일련의 생화학 분석법 외에도 적절한 Vibrio cholerae 유지 기술을 설명하며, 임상 적 및 환경 적 V 사이의 신속하고 안정적인 차별화를 위해 집합 적으로 활용됩니다. 실험실 환경에서 cholerae biotypes.

초록

수중 그람 음성 박테리아 Vibrio cholerae 는 감염성 위장병 콜레라의 원인균입니다. 이 질병의 세계적 유병률과 중증도 때문에 V. cholerae 는 환경 및 실험실 환경에서 광범위하게 연구되어 왔으며 적절한 유지 관리 및 배양 기술이 필요합니다. Classical과 El Tor는 V 를 구성하는 두 가지 주요 biotypes입니다. cholerae O1 serogroup은 각각 고유 한 genotypic과 phenotypic 특성을 나타내어 생물 종 특성 결정을위한 신뢰할 수있는 메커니즘을 제공하고 배양 조건을 유도하는 독성을 필요로한다. 주어진 감염 또는 발병에 대한 원인 균주의 생물 유형에 관계없이, 질병의 표준 치료에는 항생제 처방으로 보충 된 수분 요법이 포함됩니다. 그러나 생물학적 분류는 실험실 연구에 필요할 수 있으며 생물 의학 분야에서 더 광범위한 영향을 미칠 수 있습니다.2000 년대 초반에는 임상 적으로 분리 된 균주가 확인되었는데, 이는 고전 및 엘 토 바이오 타입의 유전형 및 표현형 특성을 나타냅니다. 엘 토르 (El Tor) 변종으로 불리는 새롭게 확인 된 잡종 (hybrid)은 임상 적 및 환경 적으로 격리 된 생물 종 식별을 이전의 전통적인 단일 분석 식별 프로토콜보다 더 복잡하게 만들었다. V 를 기술하는 것 외에. (copyyyin B 저항성, 구연산 대사, 단백 분해 활성, 용혈 활성, 운동성 및 포도당 대사)에 대한 일련의 유전자 특이 적 ( ctxB 및 tcpA ) PCR 기반 유전자 스크린과 표현형 분석을 기술하고있다. Proskauer assay)은 고전적 및 엘 토르 생물 유형을 특성화 및 / 또는 구별하기 위해 집합 적으로 사용되었습니다. 함께,이 assays는 대안으로, 또는 추가로, characteriza에 비용이 많이 드는, 노동 집약적 인 실험에 사용되는 효율적인 체계적인 접근 방식을 제공합니다V의 변화 . cholerae 임상 (및 환경) 균주.

서문

콜레라 (Cholera)는 오염 된 음식물이나 수생 그람 음성 박테리아 인 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae)를 함유 한 물의 섭취로 말초 소장의 질병입니다. 콜레라의 증상으로는 구토와 통제 할 수없는 수분 설사가 있으며 심한 탈수증을 유발합니다. 제대로 치료하지 않으면 사망에 이릅니다. V. 콜레라 는 세포 표면 리포 폴리 사카 라이드 O- 항원의 구조에 따라 200 개 이상의 혈청군으로 나눌 수 있습니다. 그러나 O1과 O139의 2 가지 혈청군 만이 전염병 또는 유행성 잠재력 1 , 2을 나타냈다. 또한, 혈청 그룹 O13은 주로 동남 아시아 3 , 4에 격리되어 있으며 혈청 그룹 O1은 전 세계적으로 분포되어있다. 또한, O1 혈청 그룹은 2 가지 주요 바이오 타입으로 분류 될 수있다 : 클래식 및 엘 토르. 고전적인 생물 종은 콜레라 전염병 유행병진행중인 일곱 번째 전염병은 엘 토르 (El Tor) 바이오 타입의 결과로 환경에서 5 , 6 , 7 의 고전적 바이오 타입을 전 세계적으로 대체하고있다. 최근에는 클래식 및 엘 토 바이오 타입 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 의 특징을 지닌 균주가 생겨 났으며 , 이후 엘 토르 변종 13 , 17 이라고 명명되었습니다. 일부 엘 토르 (El Tor) 변종은 이전에 관찰 된 것보다 더 빠르고 심각한 질병 진행으로 상승 된 병독성 능력을 입증했으며,에이전트 식별 및 질병 예방 및 치료에 대한보다 포괄적 인 접근 방법의 필요성 8 , 9 , 18 . 생물 종 동정은 치료를 즉시 지시하지는 않지만 백신 개발 및 향후 치료제의 발전은 생물 형별의 이점을 얻을 수 있습니다.

여기에 열거 된 첫 번째 일련의 프로토콜은 조사자가 V 를 적절히 유지할 수있게합니다. cholerae 실험실 환경에서의 변종. 일관성 및 후속 분석을 위해서는 생물학적 특성에 의존하지 않는 균주의 재배 및 성장이 필요합니다. 그러나, 독성 유전자 발현을 최적으로 유도하기 위해서는 독립적 인 생물 종 특이 적 배양 기술이 필요합니다 19 . 또한, 다양한 유전 및 생화학 분석을위한 준비가이 원고에 설명되어 있습니다.

콜레라 독소 (CT)와 독소가 다시 반응합니다.gulated pilus (TCP)는 V 의 두 가지 생물 유형 모두에서 마스터 조절 자 ToxT에 의해 제어되는 두 가지 주요 독성 인자이다. cholerae O1 혈청 군 20 . CT는 5 개의 CtxB로 구성된 bipartite 독소입니다. 단일 CtxA 서브 유닛을 둘러싸고있는 서브 유닛이며 콜레라와 관련된 급속한 전해질 손실을 일으킨다. TCP는 tcp 오페론 ( tcpABQCRDSTEF )에 의해 암호화 된 유형 IV 파일로 말초 소장의 부착과 집락에 관여합니다. tcpA 는 필라 스 8 구축에 필수적인 개별 필린 서브 유닛을 암호화하는 tcp 오페론의 첫 번째 유전자입니다. ctxA 의 유전자 서열은 클래식과 El Tor 바이오 타입 사이에서 완전히 보존되는 반면, ctxB 와 tcpA 는 두 바이오 타입 간에 다르지만 각 바이오 타입 내에서 보존된다. ctxB 는 2 개의 염기 자리를 제외한 바이오 타입 사이에서 완전히 보존된다(115 및 203). 엘 토르 (El Tor) 바이오 타입에서, 티민은 115 번과 203 번 위치에 있고, 전형적인 바이오 타입은이 염기에 시토신을 포함하고있다. tcpA 는 각 바이오 타입 내에서 완전히 보존되지만, 바이오 타입 사이의 여러 기지에서 다르다. 이러한 유전 적 특성은 일차적 인 생물 종 식별 마커 역할을하며, 이들 부위를 포함하는 폴리 메라 이제 연쇄 반응 (PCR) 증폭 산물을 시퀀싱 한 후에 야생형 (WT) 고전 O395 또는 WT El Tor N16961과 비교하여 생물 형질의 배경을 결정할 수있다 주어진 V. cholerae 균주에서 CT와 TCP의 발현 양상을 비교 하였다.

클래식과 El Tor biotypes 21 , 22 , 23 사이의 표현형 차이를 특성화하기 위해 수많은 프로토콜이 개발되었습니다. Polymyxin B는 그람 음성 백신에서 외부 세포막의 완전성을 손상시키는 펩타이드 항생제입니다.teria 및 polymyxin B 저항성은 polymyxin B 저항성 분석을 통해 시각화 할 수 있습니다 21 . 구연산염은 크렙스 사이클의 주요 기질이며 구연산염을 유일한 탄소원으로 대사하는 능력은 구연산 대사 분석법 22 를 사용하여 결정할 수 있습니다. hapR 은 다양한 프로모터 지역에 결합하고 유전자와 오페론 발현을 조절하는 V. cholerae, HapR의 글로벌 조절기와 마스터 쿼럼 감지 조절기를 암호화합니다. V. cholerae 의 일부 병원성 균주는 hapR 유전자에서 자연적으로 발생하는 프레임 변이 돌연변이를 가지고 있으며, 이로 인해 독성 유전자 발현의 밀도 의존적 ​​조절이 24 , 25 개 손실되었다. 우유 한천 배지를 사용하여 HapR- 조절 프로테아제 활성을 측정하면 연구자는 특정 분리주가 기능적 HapR23을 함유하고 있는지 여부를 확인할 수 있습니다. 그만큼용혈 분석법은 적혈구를 용해시키는 용혈 효소를 분비하는 균주의 능력을 시험한다. 용혈 정도를 혈액 한천 플레이트 23 에서 시각화 할 수 있습니다. 운동성은 종종 V. cholerae의 병독성과 관련이 있으며 운동성 한천 플레이트 23을 사용하여 분석 할 수 있습니다. Voges-Proskauer assay는 포도당을 유일한 탄소원으로 발효시켜 부산물 인 acetoin 21 을 생산하는 균주의 능력을 시험합니다. 엘 토르 (El Tor) 변종이 출현함에 따라 광범위한 유전자형 스크리닝없이 V의 바이오 타입 배경을 추론하기 전에 주어진 표현형 분석의 결과를 예측하기가 어렵습니다. cholerae isolates의 경우, assays 23 의이 assembly를 수행하고 그 결과를 표 2 에서와 같이 참조 균주와 비교하는 것이 추천된다.

여기서 우리는 일련의 프로토콜을 발전 시켰으며,V 를 특성화하기위한보다 포괄적 인 접근을위한 genotypic 및 phenotypic 분석법의 사용. cholerae biotypes. 또한, 우리는 알려진 V 의 genotypic 및 phenotypic 구분을 설명했다. (WT 고전적 O395, WT El Tor C6706 및 WT El Tor N16961, 표 1 )와 비교하여, 콜레라 엘 토르 변이체 (MQ1795 및 BAA-2163)를 사용하는 것이 바람직하다. 엘 토르 (El Tor) 변종의 출현은 이전에 사용 된 단일 분석 생물 형질 규명 프로토콜의 신뢰성에 대한 문제점을 제기했다. 그러나,이 다중 분석법 식별 시스템은 임상 및 환경 V 의보다 신뢰성있는 특성 분석을 가능하게합니다. cholerae isolates.

프로토콜

참고 : 개별 배지 준비가 다른 시간을 필요로하기 때문에 각 분석에 대한 시간 고려 사항을 만들어야합니다. 예를 들어, 고체 한천 평판 배지는 충분히 냉각되고 건조되어야합니다 (1-2 일). 추가적인 시간 고려 사항 ( 즉, 단일 식민지와 야간 배양기의 성장)은 각 프로토콜에 명시되어 있으며 표 2 에 나와 있습니다.

1. 미디어 준비

  1. 1x Phosphate Buffered Saline (PBS)
    1. NaCl 4.0g, KCl 0.1g, Na2HPO4 0.72g 및 KH2PO4 0.12g을 칭량한다. 1 L 삼각 플라스크에 성분을 합하고, 탈 이온수로 부피를 500 mL로 조정하고, pH 미터를 사용하여 pH를 7.2로 조정하고, HCl을 용액에 적가 한 다음, 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 오토 클레이브 또는 필터 멸균한다. 1x PBS는 실온에서 무기한 보관할 수 있습니다.
      주의 : HCl은 농축산이므로 취급시주의해야합니다.기관, 지방, 주 및 연방 규정에 따라 다릅니다. 적절한 취급 지침은 제조업체가 제공 한 안전 데이터 시트를 참조하십시오.
  2. Luria-Bertani (LB) 배지
    1. 트립 톤 5.0g, 효모 추출물 2.5g, NaCl 2.5g. 구성 성분을 1L 병에 넣고 탈 이온수, 오토 클레이브로 500mL로 부피를 조절하고 최대 6 개월 동안 실온에서 보관하십시오. 고전적인 생물 형 독성 유발 조건의 경우, 오토 클레이브 전에 HCl을 사용하여 pH를 6.5로 조정하십시오.
  3. 0.03 % (w / v) NaHCO3를 함유하는 AKI 배지
    1. 성분 1 (AKI 배지)의 경우 : 펩톤 7.5g, 효모 추출물 2.0g 및 NaCl 2.5g의 무게를 잰다. 1 L 병에 성분을 넣고 탈 이온수와 오토 클레이브로 용량을 450 mL로 맞 춥니 다. AKI 배지는 실온에서 최대 6 개월 동안 보관할 수 있습니다.
    2. 성분 2 (NaHCO3)의 경우 : 1.5g NaHCO3의 무게를 재고, 부피를 조절한다멸균 된 소포에서 탈 이온수로 50 mL로. 0.22 μm 필터를 사용하여 NaHCO 3 을 멸균 여과하십시오. NaHCO 3 는 사용 직전에 준비해야합니다.
    3. 사용하기 전에 구성 요소 2를 구성 요소 1로 필터링하여 1:10 비율을 만드는 두 구성 요소를 무작위로 결합합니다.
  4. Luria-Bertani (LB) 한천 플레이트
    1. 트립 톤 5.0 g, 효모 추출물 2.5 g, NaCl 2.5 g 및 한천 7.5 g의 무게를 잰다. 1L 삼각 플라스크에 성분을 넣고 탈 이온수, 오토 클레이브로 500mL로 부피를 조절하고 표준 크기의 100mm x 15mm 무균 페트리 접시로 준비합니다. 도금 된 배지는 최대 6 개월 동안 플라스틱으로 싸서 보관할 수 있으며, 뚜껑면이 위로 4 ° C까지 보관할 수 있습니다.
  5. Polymyxin B가 보충 된 LB 한천 플레이트
    1. 성분 1 (LB 한천)의 경우 : 트립 톤 5.0 g, 효모 추출물 2.5 g, NaCl 2.5 g 및 한천 7.5 g을 잰다. 성분을 1L 삼각 플라스크에 합치고 부피를 500 mL로 맞춘다.탈 이온수 및 오토 클레이브.
    2. 성분 2 (polymyxin B)의 경우 : 멸균 된 2 mL microcentrifuge tube에서 탈 이온수에 polymyxin B를 50,000 IU / μL의 농도로 용해시키고 0.22 μm 필터를 사용하여 필터 살균합니다.
    3. 일단 성분 1이 차갑지 만 아직 고화되지 않으면 무균 적으로 성분 2 500 μL를 성분 1에 첨가하여 50 IU / μL의 최종 농도를 만들고 철저하게 혼합합니다. 페트리 접시에 혼합 한천 미디어를 부어 표준 크기의 100mm x 15mm 멸균 배양 접시에서 준비합니다. 도금 된 용지는 최대 3 개월 동안 플라스틱으로 싸서 보관할 수 있으며, 뚜껑이있는 쪽은 4 ° C까지 보관할 수 있습니다.
  6. 최소 구연산염 중형 한천 플레이트
    1. 성분 1 (브롬 티몰 블루가 포함 된 한천) : 7.5g 한천과 0.02g 브로 모티 몰 블루. 1L 엘렌 마이어 플라스크에 성분을 넣고 탈 이온수로 450mL로 부피를 조절하고 혼합물을 고압 멸균한다.
    2. 구성 요소 2 (10x VBMM)의 경우 : 1MgSO4 7H2O 10g, 구연산 H2O 10.0g, K 2 HPO 4 무수물 50.0g 및 NaNH 4 HPO 4 4H 2 O 17.5g을 넣는다. 1L 삼각 플라스크에 성분을 합하여 용량을 500mL 탈 이온수 및 오토 클레이브로 여과하거나 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 필터 살균합니다. 10x VBMM은 실온에서 6 개월까지 저장할 수 있습니다.
    3. 구성 요소 1에 구성 요소 2 50 ML을 추가하고 페트리 접시에 혼합 한천 미디어를 부어 표준 크기의 100mm x 15mm 무균 페트리 접시에서 준비하십시오. 도금 된 배지는 최대 6 개월 동안 플라스틱으로 싸서 보관할 수 있으며, 뚜껑면이 위로 4 ° C까지 보관할 수 있습니다.
  7. 우유 한천 접시
    1. 성분 1 (우유)의 경우 : 1L 삼각 플라스크에 인스턴트 무 지방 분유 8.0g을 달아 탈 이온수와 오토 클레이브로 부피를 200mL로 맞춘다.
    2. 성분 2 (뇌 심장 주입 한천) : 뇌 심장 주입 3.68 g과 한천 6.0 g의 무게를 잰다. 사기를 맺어 라.수용액을 500 mL 삼각 플라스크에 넣고 탈 이온수와 오토 클레이브로 부피를 200 mL로 맞춘다.
    3. 오토 클레이브 한 후 성분 2를 성분 1에 붓고 두 성분을 혼합하고 철저히 혼합합니다. 150mm x 15mm 무균 페트리 접시를 준비하십시오. 밀크 플레이트는 플라스틱으로 싸여 1 주일 동안 보관할 수 있으며, 뚜껑면이 아래로 4 ° C 아래에 보관할 수 있습니다. 페트리 접시에 혼합 한천 미디어를 부어 150mm x 15mm 무균 페트리 접시에서 준비합니다.
  8. 운동성 한천 플레이트
    1. 성분 1 (LB 한천) : tryptone 5.0g, 효모 추출물 2.5g, NaCl 2.5g 및 한천 2.0g을 잰다. 1L 엘렌 마이어 플라스크에 성분을 넣고 탈 이온수와 오토 클레이브로 부피를 500mL로 맞춘다.
    2. 성분 2 (1 % (w / v) 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드; TTC) : 0.25 g TTC의 무게. 멸균 소포에서 탈 이온수로 25 mL로 부피를 조정하고 0.22 μm 필터를 사용하여 필터 살균합니다. 상온에서 6 개월 동안 보관하십시오.광 노출을 최소화하기 위해 호일에 넣습니다.
    3. 1 % (w / v) 멸균 TTC 2.5 ML을 autoclaved 미디어에 추가합니다.
    4. 대형 150mm x 15mm 무균 페트리 접시에 가능한 한 두꺼운 배지 (≥50mL / 플레이트)를 붓습니다. 도금 된 미디어는 최대 1 주일 동안 플라스틱으로 싸서 보관할 수 있으며, 뚜껑면이 위로 4 ° C까지 보관할 수 있습니다. 페트리 접시에 혼합 한천 미디어를 부어 150mm x 15mm 무균 페트리 접시에서 준비합니다.
  9. 보그 - 프로스카 우어 (VP)
    1. 성분 1 (Methyl Red-Voges-Proskauer broth, MR-VP) : 500 mL 삼각 플라스크에 1.7 g MR-VP 배지를 달고 탈 이온수와 오토 클레이브로 100 mL로 부피를 조절한다. 무균 MR-VP 배지는 실온에서 6 개월까지 보관할 수 있습니다.
    2. 성분 2 (5 % (w / v) 알파 (나) 나프톨)의 경우 : 멸균 소포에서 1.0 g의 α- 나프톨을 달아 95 % 에탄올로 20 mL로 부피를 조절한다. α- 나프톨은 실온에서 최대 1 주간 호일에 싸여 가벼운 효과를 최소화 할 수 있습니다.오 슈레.
    3. 성분 3 (40 % (w / v) 수산화 칼륨, KOH) : 멸균 소포에서 KOH 20.0g을 멸균 탈 이온수로 50mL로 부피를 조절한다. KOH는 상온에서 최대 6 개월 동안 플라스틱 용기에 보관할 수 있습니다.

2. V의 유지와 성장. 콜레라 균 균주

  1. 냉동 주식 배양 물의 준비와 사용
    1. 멸균 2 ML microcentrifuge 튜브에서 centrifugation (≥8,600 xg)에 의해 2 분 동안 액체 밤새 문화의 펠렛 1.8 ML, 뜨는 제거하고 pipetting하여 신선한 LB 국물의 900 μL에서 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
    2. 멸균 60 % (V / V) 글리세롤 900 μL를 배양 물에 넣고 볼 텍싱하여 혼합합니다.
    3. 혼합물을 멸균 2 mL 극저온 튜브에 옮기고 -80 ° C에 무기한 보관하십시오.
    4. 사용하려면 LB ag에 단일 식민지에 대한 멸균 접종 루프 및 줄무늬를 사용하여 소량의 얼어 붙은 주식을 제거하십시오ar 접시. 배양 물이 완전히 해동되는 것을 방지하기 위해 냉동 재고를 사용 후 즉시 -80 ° C로 되돌립니다. 37 ° C에서 12 ~ 16 시간 동안 뚜껑을 아래로하여 배양 판을 배양하십시오.
  2. 액체 배지에서의 밤새 배양의 성장
    1. 얼린 주식에서 LB 한천 플레이트로 단일 식민지에 대한 줄무늬 (섹션 2.1.4에 따라). 37 ° C에서 12 ~ 16 시간 동안 뚜껑을 아래로하여 배양 판을 배양하십시오.
    2. 멸균 어플리케이터 스틱으로 단일 식민지의 표면을 만지고 액체 배지로 식민지를 전송하여 단일 식민지와 멸균 10 ML 배양 튜브에 액체 LB 배양액 4 ML을 예방 접종.
    3. 37 ° C에서 12 ~ 16 시간 동안 225 rpm으로 쉐이커 배양기에서 통기와 함께 품어 낸다.
  3. 성장 곡선
    1. 이전에 프로토콜 2.2에 명시된대로 액체 LB 배지에서 밤새 문화를 준비합니다.
    2. 밤새 문화 250 μL를 2로 옮겨서 야간 배양 물을 1 : 100로 희석한다.멸균 된 250 mL 삼각 플라스크에 5 mL의 신선한 LB 브로스.
    3. 접종 시간 (T 0 )에 시작하여 매시간 600 nm (OD 600 )에서 액체 배양 물의 광학 밀도를 측정합니다.
    4. 37 ° C에서 30 시간 동안 225 rpm의 쉐이커 배양기에서 통기와 함께 밤새 배양 한 1 : 100 희석 배양 물을 배양하거나 배양액이 최대 밀도에 도달 할 때까지 배양하십시오.
    5. OD 600 vs. Time을 그래프로 표시하고 선형 회귀를 사용하여 각 변형에 대한 대략적인 배가 시간을 결정합니다.
  4. 엘 토르 바이오 타입 병원성 유도 조건
    1. 얼린 주식에서 LB 한천 접시에 단일 식민지에 대한 줄무늬. 37 ° C에서 12 ~ 16 시간 동안 플레이트 뚜껑면을 아래로 배양하십시오.
    2. 단일 식민지와 0.03 % (w / v) NaHCO 3 함유 AKI 매체 10 ML을 예방 접종.
    3. 37 ° C에서 3.5 시간 통기없이 배양하십시오.
    4. 배양액 7 mL를 제거하고 나머지 3 mL 배양쉐이커 인큐베이터 (saker incubator)에서 225rpm으로 폭기하여 추가 4 시간.
  5. 고전적 Biotype 병적 상태 유도 조건
    1. 얼린 주식에서 LB 한천 접시에 단일 식민지에 대한 줄무늬. 37 ° C에서 12 ~ 16 시간 동안 뚜껑을 아래로하여 배양 판을 배양하십시오.
    2. 단일 콜로니와 함께 4 ML 액체 LB 브로스 (pH 6.5)를 예방 접종.
    3. 30 ° C에서 12 ~ 16 시간 동안 225 rpm으로 쉐이커 인큐베이터에서 폭기로 품어 낸다.
  6. 1x PBS로 세척 셀 펠렛
    1. 멸균 2 ML microcentrifuge 튜브에서 원심 분리 (≥8,600 XG)에 의해 2 분 동안 밤새 문화의 펠렛 1.8 ML 및 피펫을 사용하여 뜨는을 제거하십시오. pipetting하여 1.8 ML 1X PBS에서 세포 펠렛을 다시 중단하십시오.
    2. 1.8 ML 1X PBS에서 최종 resuspension 다음에 세 번 세척 절차를 반복합니다.

3. V 특성화. cholerae Biotypes

  1. 피ctxB 와 tcpA 를 이용한 CR 기반 유전자 스크린
    1. ctxB 및 tcpA의 번역 시작 및 정지 부위의 상류 및 하류에 각각 약 50-70 bp 어닐링하는 프라이머 세트를 설계하십시오.
    2. 이전에 프로토콜 2.2에 명시된대로 액체 LB 배지에서 밤새 문화를 준비합니다.
    3. 염색체 DNA를 그람 음성 세균 용으로 설계된 시판용 키트를 사용하여 분리합니다. 정화 된 염색체 DNA는 -20 ° C에서 무기한 보관할 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하는 염색체 DNA 분리는 일반적으로 약 4 시간이 걸립니다.
    4. 마이크로 볼륨 분광 광도계를 사용하여 염색체 DNA 샘플이 고품질 (A 260/280 > 1.8)인지 확인하십시오.
    5. 각 염색체 DNA 단리에 대해 멸균 200 μL PCR 튜브 (s)에서 얼음으로 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)을 만들고 표준 PCR 성분을 사용하여 ctxB 및 tcpA의 영역을 증폭시킵니다 : Taq polymerase and buffer (또는 등가물), dNTP 용액 및 정방향 / 역방향 프라이머가 포함됩니다. 표준 PCR 매개 변수를 사용하십시오 (~ 3 시간). 예를 들어, 다음 프로토콜을 사용하십시오.
      1. 95 ° C에서 120 초 동안 초기 변성.
      2. 95 ° C에서 60 초 동안 변성.
      3. 60 ° C에서 45 초 동안 Anneal 프라이머.
      4. 72 ° C에서 90 초간 연장하십시오.
      5. 34 사이클 동안 3.1.5.2 ~ 3.1.5.4 단계를 반복하십시오.
      6. 최종 연장 72 ° C에서 600 초.
      7. 4 ° C에서 무한히 기다리십시오.
    6. 표준 6X DNA 겔로드 염료를 사용하여 각각의 PCR 산물 5 μL를 염색하고 1X Tris-Borate-EDTA (TBE)의 1 % 아가 로스 젤에 1 kb 사다리와 10 μL의 PCR 산물 약 10 μL를 넣습니다. 완충기.
    7. 염료 전선이 젤의 끝 부분에 도달 할 때까지 130V에서 겔 전기 영동을 실행하십시오 (약 90 분). 전압에 따라 지속적인 모니터링이 권장되며 장비에 따라 작동 시간이 다를 수 있습니다.
    8. 확인시예상 크기의 성공적인 PCR 증폭, 시중에서 판매하는 DNA 청정 및 농축기 키트를 사용하여 나머지 45 μL PCR 생성물을 정제하십시오.
    9. PCR 증폭에 사용 된 것과 동일한 프라이머를 사용하여 PCR 제품을 세척하고 로컬 시퀀싱 설비 지침에 따라 준비하십시오.
    10. 검색 결과 상자에서 다음 수식 번호를 검색하여 NCBI 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)에서 사용할 수있는 출판 된 서열에 대한 각각의 분리 된 유전자 서열의 FASTA 형식을 비교하십시오.
    11. ctxB : (클래식) VC0395_A1059 ~ VC0395_A1060 (엘 토르) VC_1456
    12. tcpA : (클래식) VC0395_A0353 (엘 토르) VC_0828
  2. Spotting을 통한 Biotype 분류를위한 Phenotypic Assays
    1. 이전에 프로토콜 2.2에 명시된대로 액체 LB 배지에서 밤새 문화를 준비합니다.
    2. 프로토콜 2.6에 명시된대로 세포 펠렛을 씻으십시오.
    3. 피펫을 사용하여세척 한 배양액 1 μL를 각각의 배지에 넣는다. 중간 배양 및 항온 배양에 대해서는 표 2를 참조하십시오.
  3. 운동성 분석
    1. 앞서 프로토콜 2.2에 명시된대로 액체 LB 배지에서 밤새 문화를 준비합니다.
    2. 프로토콜 2.6에 명시된대로 세포 펠렛을 씻으십시오.
    3. 씻은 액체 배양액에 주사 접종을 삽입하고 배지에 수직으로 "삽입"하여 운동성 한천 플레이트를 접종합니다. 각 접종 사이에 Bunsen 버너를 사용하여 와이어 찌꺼기를 멸균하고, 한천을 찔렀을 때 접종 된 찌름이 구부러지지 않도록하십시오. 결과가 바뀔 수 있습니다.
    4. 37 ° C에서 14 ~ 24 시간 동안 뚜껑이 위를 향하도록 플레이트를 배양하십시오. 14 시간 후, 운동성 플레이트를 면밀히 모니터하여 배양 물의 과증식을 예방하십시오.
  4. Voges-Proskauer (VP) 분석법
    1. 앞서 프로토콜 2.2에 명시된대로 액체 LB 배지에서 밤새 문화를 준비합니다.
    2. 접종 4미리 준비한 하룻밤 배양액 10 μL를 멸균 배양 튜브에서 MR-VP broth 4 mL에 pipette하고, 쉐이커 배양기에서 225 rpm으로 12에서 16 사이의 통기와 함께 배양하여 메틸 레드 Voges-Proskauer 또는 MR-VP broth h에서 37 ° C.
    3. 멸균 배양 튜브에서 MR - VP 하룻밤 배양의 1 ML의 aliquots 각각 5 % (W / V) α- 나프톨과 50 μL 40 % (W / V) KOH 150 μL를 추가합니다.
    4. 간단히 와동하고 색상 변화가 발생할 때까지 최대 4 시간 동안 실온에서 방치합니다.

결과

박테리아 균주의 적절한 유지 관리 및 사용을 위해서는 관심있는 균주의 배가 시간을 알아 두는 것이 좋습니다. 여기서, 일반적으로 사용되는 V 의 변화하는 성장 속도. 콜레라 균주는 성장 곡선을 통해 입증되었고 근사 배가 시간은 선형 회귀를 사용하여 계산되었다. WT El Tor N16961 및 El Tor 변종 MQ1795는 WT 고전 O395 (~ 2 시간)보다 짧은 배증 시간 (각각 1 시간 및...

토론

200 개 이상의 식별 된 V 중 . cholerae serogroups, 오직 O1과 O139만이 전염병 가능성이있다. O1 혈청 그룹은 클래식과 엘 토르의 두 가지 바이오 타입으로 나눌 수 있습니다. 그러나 엘 토르 (El Tor) 변종 13,17이라고 불리는 하이브리드 계통이 엘 토르 (El Tor) 바이오 타입 배경을 가지고 있으며 고전적 특성 8 , 9 , 10 ,...

공개

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 말

뉴 햄프셔 - 인 브레 (New Hampshire-INBRE)가 NIH의 국립 종합 의학 연구소 (National Medical Sciences of NIH)의 기관 개발상 (IDeA), P20GM103506을 통해 지원

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