Canlı hücre ölçüm propil reseptörü harekete geçirmek kullanımı gerçek zamanlı bir kamp tahlil

Özet

Işlev propil reseptörlerinin karakterize vazgeçilmez bir parçası deorphanization süreç içinde hizmet vermektedir. Biz gerçek zamanlı bir kamp tahlil kullanarak propil reseptörleri aktivasyonu ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Memeli propil reseptör (OR) aileler büyük boyutları arasında çok sayıda uçucu Kimyasalları soydaş onların ligandlar bulmak için zorluklar. ORs verimli bir şekilde ve doğru bir şekilde deorphanize için memeli ORs ve genetiği değiştirilmiş Biyoalgılayıcı plazmid kamp üretim aşağı OR etkinleştirme gerçek zamanlı olarak ölçmek için ifade etmek için bir kapaklı cep satırının kullanımını birleştirir. Bu tahlil için ekran odorants ORs ve ahlak bozukluğu çok yönlükarşı kullanılabilir. Pozitif propil-reseptör etkileşimleri ekranlar üzerinden daha sonra konsantrasyon-yanıt eğrileri oluşturma çeşitli koku konsantrasyonlarının karşı test ederek teyit edilmesi. Burada Hana3A hücrelerde ifade ve olumlu yanıt reseptör soydaş reseptör için faiz bileşik olduğunu doğruladı insan bir OR Kütüphane karşı kokulu bir bileşik bir yüksek-den geçerek tarama gerçekleştirmek için bu yöntem kullanılır. Verimli ve güvenilir OR harekete geçirmek değerlendirirken bu yüksek üretilen iş algılama yöntem bulduk ve bizim veri OR fonksiyonel çalışmalar potansiyel kullanım için bir örnek sağlar.

Giriş

Onlar yiyecek elde kaçının saldırganlar ve tehlike tür ayırt etmek ve dostum^1,2seçin için koku alma yeteneklerini üzerinde itimat gibi koku alma duygusu hayvanların hayatta önemli bir rol oynar. Bu işlevlerin gerçekleşme tek tek koku epitel (OE) bulunan silier yüzeyi koku duyusal nöronların (OSNs) ifade edilir propil reseptörleri (ORs), bağlıdır. ORs en büyük ailesi G-protein birleştiğinde reseptör (GPCR) süper yaklaşık 400 ve 1200 farklı OR genleri olan insan ve fare, sırasıyla^3,4,5oluşturmaktadır. Odorants tarafında....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Culturing ve Hana3A hücreleri bakım

1. 10 mL % 10 fetal sığır serum (FBS), 100 ile minimum temel orta (MEM) hücrelerde koru µg/mL penisilin-streptomisin ve 1,25 µg/mL Amfoterisin B 100 mm hücre kültür çanak 37 ° C hücre kültür kuluçka %5 CO ₂. Her diğer geçişiyle plazmid (bkz: giriş) istikrarlı transfection korumak için 1 µg/mL puromisindir eklemek.
   Not: steril ortam sağlamak için bir sınıf II biyolojik Emanet dolabı hücre kültüründe içeren tüm adımları.
2. 100-mm yemeklerinde 2-3 günde % 10-20 oranında alt kültür.

2. Hücreleri Transfection için kaplama

1. Hana3A hücreleri ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Muscone doğal misk üzerinden ana aromatik bileşenidir. Son muscone ve fare veya MOR215-1, fareler^37,38davranışlar içinde muscone duyarlı glomeruli üzerinden klonlanmış homoloji dayalı diğer macrocyclic misk bileşikler için insan bir reseptör olarak tanımlanan OR5AN1 çalışmalar. İnsan OR repertuar, bizim grup ve Touhara grup Ayrıca tarama tarafından OR5AN1 olarak iki macrocyclic misk bileşikler, cyclopentadec.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

AMELİYATHANEYİ'ın etkinleştirme maruz bir belirli propil için üzerine doğru ölçme koku bilgi kodlama deşifre ilk adımdır. Deneyler nasıl bir örneği, bir vitro kullanarak tanımlayabilirsiniz bu çalışma temsil OR ifade sistem, duyarlı ORs uygun faiz ve daha sonra reseptör karakterize kokulu gelir insan OR repertuar arasında gösterilen çeşitli kimyasal konsantrasyonları kullanarak Farmakoloji. Bizim sonuçları OR5AN1 muscone için bir bona fide reseptör olarak onaylamak. Bu bir .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Sigma	A2942
DMSO	Sigma	D2650
FBS	Gibco	10099-141
GloSensor cAMP reagent	Promega	E1290
pGloSensor-20F cAMP plasmid	Promega	E1171
Hana3A cells			available from authors upon request
HBSS, without calcium or magnesium	GIBCO	14175095
HEPES	Hyclone	SH30237
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-019
M3R plasmid			cloned into a mammalian expression vector such as pCI
MEM, with EBSS and L-glutamine	Hyclone	SH30024
Muscone	Santa Cruz	sc-200528
Musk tibetene	Sigma-Aldrich	S359165
OR plasmids			cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI
PBS, without calcium or magnesium	Cellgro	21-040-CV
Penicillin-streptomycin	Hyclone	SV30010
Plasmid miniprep kit	Tiangen	DP103-03
Puromycin	Sigma	P8833
RTP1S plasmid			cloned into a mammalian expression vector such as pCI
Trypsin-EDTA	Hyclone	SH30236
0.2-mL PCR tube	Axygen	PCR-02-C
1.5-mL Eppendorf tube	Eppendorf
15-mL 17 mm x 120 mm conical tube	BD Falcon	352096
8-well and/or 12-well multichannel pipetman	Eppendorf
96-well flat-bottomed white cell culture plate	Greiner	655098
100 mm x 20 mm cell culture dish	BD Falcon	353003
Class II biological safety cabinet with laminar flow
Cell culture incubator, with 5% CO2
Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes
Infinite F200 plate reader	Tecan
Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives
Spectrophotometer
Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution
Sterile paper towel