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摘要

表征气味受体的功能在 deorphanization 过程中起着不可缺少的作用。我们描述了一种方法来测量气味受体的激活, 在实时使用阵营分析。

摘要

哺乳动物气味受体 (或) 家庭的巨大尺寸在许多挥发性化学物质中发现其同源配体存在困难。为了有效和准确地 deorphanize 口服补液盐, 我们结合使用异种细胞线表达哺乳动物口服补液盐和基因修饰的生物传感器质粒来测量营地生产的下游或实时激活。这种方法可以用于筛选气味对口服补液盐和反之亦然. 通过对各种气味浓度的测试, 产生浓度-反应曲线, 可以证实从屏幕上的正气味受体相互作用。在这里, 我们使用这种方法进行高通量筛选的气味化合物对人类或图书馆表达的 Hana3A 细胞, 并证实, 积极反应受体是同源受体的化合物的兴趣。我们发现这种高通量的检测方法在评估或激活时是有效和可靠的, 我们的数据提供了它的潜在用途或功能研究的一个例子。

引言

嗅觉在动物的生存中起着重要作用, 因为它们依赖嗅觉才能获得食物, 避免捕食者和危险, 区分物种, 并选择交配1,2。这些功能的实现取决于气味受体 (口服补液盐), 这是单独表达在纤毛表面的嗅觉感觉神经元 (OSNs) 位于嗅觉上皮 (OE)。口服补液盐组成的 G 蛋白偶联受体 (化学) 超家族的最大的家庭与大约400和1200多样或基因在人和小鼠, 分别3,4,5。气味激活的口服补液盐, 通过嗅 g 蛋白 (g阵线) 和 III 型腺苷 (ACIII) 的顺序激活, 导致细胞内 cAMP 水平增加。细胞内 cAMP 的增加可以作为第二信使, 在细胞表面打开核苷酸门控通道, 触发阳离子的流入, 包括 Ca2 +和动作电位, 并最终启动神经-潜在的传播和嗅觉知觉。检测和鉴别大量气味的过程被认为是嗅觉知觉的第一步6,7。

由于降压和一周半跳8首次成功地克隆了气味受体, 阐明了由口服补液盐引发的嗅觉知觉机制, deorphanization 或家族成为该领域的热点之一。各种体内, ex 体内和体外测量或激活方法已被报告9,10,11,12。传统的方法, 使用 Ca2 +成像后, 单细胞 RT PCR 在 OSNs 启用了识别不同的口服脂肪族气味13,14,15。最近, large-scale 转录分析的问世促进了更高通量的在体内方法的发展。肯塔基试验鉴定了丁香酚和麝香反应的老鼠, 使用了 S100a5-tauGFP 报告鼠株和微阵列分析9。根据气味暴露后的下降或 mRNA 水平, 梦想技术采用了一种组的方法来确定或激活脊椎动物和无脊椎动物物种的剖面图16。同样, 考虑到 S6 在神经元激活中的磷酸化, Matsunami 组从磷酸酯核糖体 immunoprecipitations 测序基因, 以确定反应灵敏的口服补液盐12。最后, 该组报告了超级嗅探小鼠, 可以作为一个平台, 研究气味编码在体内, 称为 MouSensor 技术17。

在体外领域, 培养 OSNs 的挑战使一个异源表达系统模仿或功能表达在体内一个理想的解决方案, 进行 large-scale 筛选气味化学品的口服补液盐。然而, 因为培养的细胞系 non-olfactory 起源不同于当地的 OSNs, 或蛋白质被保留在内质网并且不能交通对血浆膜, 导致或退化和损失受体作用18,19. 为了解决这一问题, 在外源细胞系中对细胞膜的复制或功能表达做了大量的工作。Krautwurst et al.首先将前20氨基酸的视 (ρ标签) 附加到 N 终端或蛋白质, 这促进了一些口服补液盐在人类胚胎肾脏 (HEK) 细胞的细胞表面表达,20。通过对单 OSNs、斋藤et al的基因表达 (SAGE) 库分析进行序列分析。首先克隆受体转运蛋白 (RTP) 家族成员, RTP1 和 RTP2, 和受体表达增强蛋白 1 (REEP1), 促进或贩运到细胞膜和增强气味介导的口服补液盐在 HEK293T 细胞的反应21. 根据这些发现, Matsunami 集团成功地建立了 Hana3A 细胞系, 稳定地转染了 RTP1、RTP2、REEP1 和 Gα阵线HEK293T, 并瞬时转染了ρ标记的口服补液盐, 用于高效或功能表达.随后的研究揭示了 1) 一种较短的形式的 RTP1, RTP1S, 可以更有力地促进或功能比原 RTP1 蛋白和 2) 类型3毒蕈乙酰胆碱受体 (M3R), 可以加强或活动通过抑制β-arrestin-2招聘, 这两个被引入到外源表达系统优化实验输出22,23。

几种检测方法已被用来量化受体激活在异源系统。分泌的胎盘碱性磷酸酶 (SEAP) 检测工作与一个记者酶转录调节的阵营反应元素 (CREs), 使它成为一个有吸引力的选择评估或激活。荧光在培养基样品中容易地被发现在培养媒介以后与 SEAP 检测试剂24。使用这种方法, 口服补液盐的功能以及第二类化学受体表达的 OE-微量胺相关受体 (TAARs) 已被描绘成25,26,27。另一种常见的方法, 荧光检测, 使用了萤火虫荧光报告基因的控制下的阵营反应元件 (综合考试)。测量荧光生成的发光提供了一种有效且健壮的方法来量化或激活10、11、28。

实时营区检测也被广泛应用于动态监测外源或内受体的功能。这种先进的分析的一个例子是利用基因编码的生物传感器变体, 它拥有一个阵营结合的领域融合到一个突变形式的荧光。当阵营束缚, 构象变动导致激活荧光, 发光从然后可以被测量用化学发光的读者29,30。据报道, real-time 营技术适用于 HEK293 和 NxG 108CC15 细胞中人类气味受体的 de-orphaning驴子 = "xref" >> 31,32,33, 以及在 HEK293T-derived Hana3A 单元格34,35。Krautwurst 组还详细描述了 real-time 阵营技术适合双向 large-scale 或筛选方法32,33。

在这里, 我们描述了一个用于测量或激活使用 real-time cAMP 测定 Hana3A 细胞的协议。在本协议中, pre-equilibrated 活细胞的发光是动力学测量的30分钟后, 特定的挥发性化合物的治疗, 代表一个更有效和准确的分析或活化, 不太容易在细胞环境中发生的工件, 具有长时间和气味诱导的细胞毒性。这种 real-time 的测量允许 large-scale 筛选的口服补液盐和配体, 以及表征特定或配基对的兴趣。使用这种方法, 我们成功地确定了 OR5AN1 作为麝香化合物麝香受体, 通过对379人体口服补液盐进行筛选, 并随后确认阳性筛查结果。

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研究方案

1. Hana3A 细胞的培养和维护

  1. 将10毫升的最小必需培养基 (FBS)、100和 #181 的细胞维持在10% 胎牛血清中; g/毫升青霉素-链霉素, 以及1.25 和 #181; g/毫升两性霉素 B 在100毫米细胞培养皿在37和 #176; C 细胞培养孵化器与 5% CO 2 。每隔一段, 添加1和 #181; 嘌呤以保持质粒的稳定转染 (参见 简介 ).
    注意: 在第二类生物安全柜中执行涉及细胞培养的所有步骤, 以确保无菌环境.
  2. 亚文化的比例为10-20% 在100毫米的菜肴每2-3 天.

2。用于转染的电镀细胞

  1. 在相衬显微镜下观察 Hana3A 细胞, 以确保细胞活力并估计汇流.
  2. 从细胞培养皿中吸取所有培养基.
  3. 通过在盘子上加入10毫升磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 来洗涤细胞, 旋转盘子, 并吸出 pbs.
  4. 在板上加入3毫升的0.05% 胰蛋白酶-乙烯二胺乙酸酸 (EDTA)。混合1分钟或直到所有细胞漂浮.
    注意: 在必要的显微镜下观察细胞从底板底部分离的进展情况.
  5. 在 10% FBS 和吸管上加5毫升的记忆液来破坏胰蛋白酶, 从而分解细胞块.
    注: 对于在转染前电镀, 所使用的培养基不应含有抗生素。添加抗生素可降低转染效率.
  6. 将适当数量的电池转移到 15 mLl 管, 具体取决于要转印的板材数量。对于每个96孔板, 板 2 x 10 6 单元格, 或约1/5 的100% 汇合 100 mm 盘, 每井提供 2 x 10 4 单元格数, 或每井大约15-30% 汇合点的密度。离心管在 200 x g 为5分钟, 并吸取上清, 而不干扰细胞颗粒.
    注: 计算正确数量的细胞被镀上 96-井板, 以避免 overgrowing 或 undergrowing 细胞之前的刺激.
  7. 在15毫升管和吸管中加入适量的 10% FBS, 以分解细胞块。对于每个96井板, 重6毫升的记忆与 10% FBS 的细胞.
    注意: 小心不要在管子里产生气泡.
  8. 将悬浮的单元格添加到库中。使用多通道吸管, 吸管50和 #181; L 的细胞到每一个96井板的井。在37和 #176 的夜间孵育; C 与 5% CO 2 .

3。转染质粒

  1. 在转染前, 观察镀膜细胞以确保在相衬显微镜下每井大约30-50% 的适当汇合, 并返回孵化器.
  2. 预先准备好ρ标记或构造 11 , 21 , 22 , 28 , 辅助因子构造 (RTP1S 22 , 36 和 M3R 23 ) 和生物传感器变体构造 29 30 由 miniprep。通过分光光度计对 dna 浓度进行量化, 并根据需要调整质粒 dna 浓度 ( 例如 , 以 100 ng/和 #181; L).
  3. 转染混合物的制备
    1. 在500和 #181 中准备质粒转染混合物; 根据 表 1 , 每个 96-井板的记忆体 L。 注: 当不同的口服补液盐在相同的96孔板上进行测试时, 转染混合物的体积和添加的质粒 DNA 的数量必须适应于在给定或.
    2. 在500和 #181 中用18和 #181 的试管制备转染混合试剂; 我的记忆.
  4. 移将质粒混合物与转染混合物混合。室温孵育15分钟.
  5. 停止反应, 加入5毫升的记忆与 10% FBS.
  6. 在细胞培养罩中摊开一层厚的无菌纸巾。从孵化箱中取一个96井板。轻轻地、反复地在纸巾上把盘子倒过来敲击, 使介质完全被纸巾吸收.
    注意: 不要用力或突然敲打盘子, 因为你可能会失去细胞.
  7. 传输50和 #181; 将混合转染混合物的 L 转到96井板的每个井中, 并在夜间孵育18-24 小时, 在37和 #176; C 与 5% CO 2 .
    注: time-managed 转染和刺激计划应在测量之前, 超过一个 96-井板在一个实验中测试, 以使所有的板块测量后, 相同的转染时间和刺激曝光时间.

4。使用实时野营试验的刺激和测量或活动

  1. 在相衬显微镜下观察转染细胞, 以确保每井50-80% 的正确汇合并返回孵化器.
  2. 将10毫米羟乙基 piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES) 和5毫米葡萄糖添加到汉克和 #39 的平衡盐溶液 (HBSS), 以制备刺激培养基.
  3. 解冻 real-time 阵营化验基质试剂等分在冰上。在-80 和 #176 上贮存底物试剂; C 在55和 #181; 在 PCR 管中每管 L。每盘使用1管.
  4. 2% 平衡解决方案通过混合55和 #181; 基体试剂和2750和 #181 的 l; HBSS/HEPES/葡萄糖溶液.
  5. 在长凳上摊开一层厚的纸巾。轻轻地反复敲击纸巾上的盘子, 使转染介质完全被纸巾吸收.
  6. 移50和 #181 清洗细胞; HBSS/HEPES/葡萄糖溶液对每一个井.
  7. 轻轻地反复从96井板上 HBSS/HEPES/葡萄糖溶液.
  8. 吸管25和 #181; 每井2% 平衡溶液, 在室温下孵育 2 h.
  9. 提前准备1米气味库存解决方案, 并在-20 和 #176 中存储, 直到使用.
  10. 在孵化时间结束之前, 将气味的库存溶液稀释到 HBSS/HEPES/葡萄糖刺激培养基中的工作浓度.
    注: 在这一步骤中制备的气味稀释的浓度应加倍, 以便在每个井中产生正确的最终浓度.
  11. 使用化学发光板读写器和在气味之前, 测量板材的基发光水平连续2次, 以1000年毫秒为单位的速率 34 .
  12. 快速从板读取器中取出板, 并添加25和 #181; 气味稀释每口井, 并立即启动所有井的连续发光测量20周期在30分钟内
    注意: 在同一板块中使用不同的气味和/或不同浓度的同一气味时, 小心移液器避免污染相邻的水井.

5。数据分析

  1. 从化学发光板读取器软件导出数据.
  2. 使用公式计算每个时间点的规范化或响应
    (发光的 N 和 #8211; 发光 基 )/(发光 最高的 和 #8211; 发光 基底 ) 在其中 N = 某一井的发光值; 基底 = 两个基底的平均发光值发光值;最高 = 一盘或一组板材的最高发光值.
    注: 根据实验的目的, 可采用可选的图形表示。例如, 对于筛选分析 (参见 图 1 ) 和生成浓度-响应曲线, 在动态测量期间某一特定时间点的发光值 (如最大值或最终值, 可以使用.

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结果

麝香是天然麝香的主要芳香成分。最近的研究发现 OR5AN1 作为人类受体的麝香和其他环麝香化合物的同源性的鼠标或, MOR215-1, 克隆从麝香反应性肾小球的行为小鼠37,38。通过筛选人类或曲目, 我们的小组和 Touhara 组也确定 OR5AN1 作为主要受体的两个环麝香化合物, 酮和麝香, 分别使用荧光化验系统38,

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讨论

在接触到某气味时, 准确地测量或激活是破译嗅觉信息编码的第一步。本研究中所示的实验表明了一个例子, 说明如何使用一个体外或表达系统来识别人类或有气味的化学物质的反应性口服补液盐, 并随后表征该受体药理学使用各种浓度的化学物质。我们的结果证实 OR5AN1 作为一个善意受体的麝香。这与以前的报告39一致, 并提供了进一步的证据, 推测只有少数的受体?...

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披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作得到了中国国家科学基金会 (31070972)、上海市科学技术委员会 (16ZR1418300)、上海市教育委员会创新研究小组项目、上海东部学者计划 (J50201) 和中国国家基础研究计划 (2012CB910401)。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BSigmaA2942
DMSOSigmaD2650
FBSGibco10099-141
GloSensor cAMP reagentPromegaE1290
pGloSensor-20F cAMP plasmidPromegaE1171
Hana3A cellsavailable from authors upon request
HBSS, without calcium or magnesiumGIBCO14175095
HEPESHycloneSH30237
Lipofectamine2000Invitrogen11668-019
M3R plasmidcloned into a mammalian expression vector such as pCI
MEM, with EBSS and L-glutamineHycloneSH30024
MusconeSanta Cruzsc-200528
Musk tibeteneSigma-AldrichS359165
OR plasmidscloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI
PBS, without calcium or magnesiumCellgro21-040-CV
Penicillin-streptomycinHycloneSV30010
Plasmid miniprep kitTiangenDP103-03
PuromycinSigmaP8833
RTP1S plasmidcloned into a mammalian expression vector such as pCI
Trypsin-EDTAHycloneSH30236
0.2-mL PCR tubeAxygenPCR-02-C
1.5-mL Eppendorf tubeEppendorf
15-mL 17 mm x 120 mm conical tubeBD Falcon352096
8-well and/or 12-well multichannel pipetmanEppendorf
96-well flat-bottomed white cell culture plateGreiner655098
100 mm x 20 mm cell culture dishBD Falcon353003
Class II biological safety cabinet with laminar flow
Cell culture incubator, with 5% CO2
Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes
Infinite F200 plate readerTecan
Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives
Spectrophotometer
Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution
Sterile paper towel

参考文献

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