Viver-pilha medição de odorante Receptor de ativação usando um ensaio de campo em tempo real

Resumo

Caracterizando a função dos receptores de odorante serve uma parte indispensável do processo de deorphanization. Nós descrevemos um método para medir a ativação dos receptores odorant em tempo real, usando um ensaio de campo.

Resumo

Os tamanhos enormes das famílias do receptor (OR) odorant mamíferos apresentam dificuldades para encontrar seus cognatos ligantes entre numerosos produtos químicos voláteis. Para eficiência e precisão deorphanize ORs, podemos combinar o uso de uma linha de celular heteróloga para expressar ORs mamíferos e um plasmídeo geneticamente modificado biosensor para medir a produção de acampamento a jusante de ativação OR em tempo real. Este ensaio pode ser usado para tela odorantes contra ORs e vice-versa. Interações de odorante-receptor positivo das telas podem ser posteriormente confirmadas por teste em relação a várias concentrações de odor, gerando curvas concentração-resposta. Aqui nós usamos este método para executar um rastreio do elevado-throughput de um composto odoríferos contra uma biblioteca de OR humano expressos nas células Hana3A e confirmou que o receptor está respondendo positivamente é o receptor cognato para o composto de interesse. Encontramos este método de deteção de alta produtividade para ser eficiente e confiável na avaliação da ativação OR e nossos dados fornecem um exemplo de seu uso potencial em estudos funcionais de OR.

Introdução

O sentido do olfato desempenha um papel importante na sobrevivência dos animais, como eles dependem de suas habilidades olfativas para obter alimentos, evitar predadores e perigo, distinguir a espécie e selecione companheiro^1,2. A realização dessas funções depende os receptors odorant (SRO), que individualmente são expressos na superfície ciliar dos neurônios sensoriais olfativos (OSNs) localizada no epitélio olfativo (OE). RUP constituem a maior família da superfamília de receptores (GPCR) G-proteína juntamente com aproximadamente 400 e 1200 diversas OR genes em humanos e rato, respectivamente^3,4,5. SRO ativado por odorantes leva ao aumento dos níveis intracelular de cAMP através da ativação sequencial de olfativa G-proteína (G_olf) e digite adenilato ciclase III (ACIII). O resultante aumento do nível de cAMP intracelular pode funcionar como um segundo mensageiro, que abre o canal do nucleotide-gated na superfície das células, provocando o influxo de cátions incluindo Ca^{2 +} e potenciais de ação e, finalmente, iniciar neuro-potencial transmissão e percepção olfativa. O processo de detectar e discriminar um grande número de odores pelo RUP é considerado como o primeiro passo de percepção olfativa^6,7.

Desde que Buck e Axel⁸ primeiro com êxito clonado odorant receptores e elucidado o mecanismo da percepção olfativa, iniciada pelo RUP, deorphanization da família OR tornou-se um dos hotspots neste campo. Vários métodos in vivo, ex vivo e in vitro , para medir a ativação OR foram relatados^9,10,11,12. Um método tradicional usado Ca^{2 +} imagem seguida de célula única RT-PCR na OSNs permitiu a identificação de diferentes RUP para alifáticos odorantes^13,14,15. Mais recentemente, o advento das análises em larga escala transcriptome promoveu o desenvolvimento de métodos de alta produtividade na vivo mais. O ensaio de Kentucky identificou ORs eugenol e muscona-responsivo do mouse com o uso do S100a5-tauGFP repórter rato estirpe e microarray análise⁹. Baseia a diminuição nos níveis de RNAm OR após exposição odorante, a tecnologia de sonho empregou uma abordagem transcriptomic para determinar perfis de ativação OR em ambas as espécies de vertebrados e non-vertebrado¹⁶. Da mesma forma, dada a fosforilação de S6 em ativações neuronais, o Matsunami grupo sequenciados mRNAs de moleculas de Ribossoma fosforilada para identificar responsivo ORs¹². Finalmente, o grupo de Feinstein relatou ratos super cheirador que poderiam servir como uma plataforma para estudar o odor de codificação na vivo, conhecido como o de tecnologia de MouSensor¹⁷.

No Reino em vitro , o desafio de cultivo OSNs faz um sistema de expressão heteróloga que imita OR expressão funcional na vivo uma solução ideal para realizar a triagem em larga escala de produtos químicos odoríferos para RUP. No entanto, desde linhas de células cultivadas de origens não-olfactory diferem OSNs nativas ou proteínas são retidas no retículo endoplasmático e incapaz de tráfego para a membrana plasmática, resultando em OR degradação e perda da função de receptor^{18 , 19}. para resolver este problema, foram feitas obras extensas para replicar a expressão funcional de OR na membrana celular em linhagens celulares heteróloga. Krautwurst et al primeiro anexados os 20 primeiros aminoácidos da rodopsina (Rho-marca) do N-terminal da proteína OR e isto promoveu a expressão da pilha-superfície de alguns ORs em células de rim humano embrionário (HEK)²⁰. Realizando uma análise serial de análise de biblioteca de expressão (SAGE) gene do único OSNs, Saito et al. primeiro clonado do receptor-transportando proteínas (RTP) os membros da família, RTP1 e RTP2 e a proteína de potenciador de expressão do receptor 1 (REEP1) que facilitou OR tráfico para a membrana celular e aprimorado mediada por odorant respostas das RUP em células HEK293T ²¹. com base nesses resultados, o grupo Matsunami estabelecida com êxito a linha de celular Hana3A, estàvel transfected com RTP1, RTP2, REEP1 e Gα_olf em HEK293T e transitoriamente transfected com RUP Rho-tag, para eficiente ou funcional expressão. Posteriores estudos revelaram 1) um formulário mais curto da RTP1, RTP1S, que poderia promover mais robustamente ou função do que o original proteína RTP1 e 2) o receptor de acetilcolina muscarínicos tipo 3 (M3R) que pode aumentar a atividade de OR através da inibição da β-arrestin-2 recrutamento, ambos os quais foram introduzidos no sistema de expressão heteróloga para otimizar experimental de saída^22,23.

Vários métodos de deteção têm sido utilizados para quantificar a ativação do receptor em sistemas heterólogos. O ensaio da fosfatase alcalina placentária secretado (SEAP) trabalha com uma enzima reveladora transcriptionally regulamentada por elementos de resposta acampamento (CREs), tornando-se uma opção atraente para avaliar a ativação OR. A fluorescência é facilmente detectada em uma amostra de meio de cultura após a incubação com SEAP deteção reagente²⁴. Usando este método, as funções das regiões ultraperiféricas, bem como uma classe secundária dos receptores chemosensory, expressado no OE, o rastreamento associado da amina receptores (TAARs) tem sido caracterizam^25,26,27. Um outro método comum, o ensaio de luciferase, usa um gene de repórter de luciferase de vaga-lume sob o controle do elemento de resposta acampamento (CRE). Medição da luminescência gerada pela produção de luciferase oferece um meio eficiente e robusto de quantificar OR ativação^10,11,28.

Ensaios de campo em tempo real também têm sido amplamente utilizados na monitoração dinamicamente a função de GPCRs heterólogos ou endógenas. Um exemplo desses ensaios avançados aproveita-se de uma variante geneticamente codificado biosensor, que possui um domínio de ligação de acampamento fundido a uma forma mutante de luciferase. Quando vincula de acampamento, a mudança conformacional leva à ativação de luciferase, luminescência, que então pode ser medida com um leitor de quimioluminescência^29,30. A tecnologia de campo em tempo real tem sido relatada apropriado para o de orfandade de odorante humana receptores nas células de 108CC15 HEK293 e NxGbunda = "xref" > 31^,32,33, como bem como o Hana3A HEK293T-derivado de células^34,35. O grupo de Krautwurst também descrito em detalhes a tecnologia de campo em tempo real para ser apropriado para abordagens em grande escala ou triagem de bi-direcional de^32,33.

Aqui descrevemos um protocolo para medir a ativação OR usando um ensaio de campo em tempo real em células Hana3A. Neste protocolo, a luminescência de células vivas pre-equilibradas cineticamente é medida por 30 min após o tratamento com compostos voláteis específicos, o que representa uma análise mais eficiente e precisa de ativação OR que são menos suscetíveis a artefatos que ocorrem no ambiente celular com tempo prolongado e toxicidades celular induzida pelo odor. Esta medição em tempo real permite uma triagem em larga escala do RUP e ligantes, bem como a caracterização de pares específicos de OR-ligante de interesse. Usando esse método, com sucesso identificamos OR5AN1 como receptor para a muscona composto de almíscar executando um rastreio contra 379 ORs humanos e posteriormente confirmando o resultado da seleção positiva.

Protocolo

1. Culturing e manutenção de células Hana3A

1. manter as células em 10 mL de meio essencial mínimo (MEM) com 10% soro bovino fetal (FBS), 100 µ g/mL penicilina-estreptomicina e 1,25 µ g/mL anfotericina B em um 100-mm placa de cultura de células em uma incubadora de cultura de célula de 37 ° C com 5% de CO ₂. Com cada outra passagem, adicionar 1 puromicina µ g/mL para manter estável transfection de plasmídeos (ver introdução).
   Nota: Executar todas as etapas que envolvem a cultura de células em uma classe de segurança biológica II para garantir ambiente esterilizado.
2. Subcultura na proporção de 10-20% em 100mm pratos cada 2-3 dias.

2. Chapeamento de células para transfeccao

1. observar as Hana3A células sob um microscópio de contraste de fase para garantir a viabilidade celular e estimar a confluência.
2. Aspirar todos os meio do prato de cultura celular.
3. Lavar as células adicionando 10 mL de tampão fosfato salino (PBS) na chapa, rodando o prato, e aspirando a PBS.
4. Adicionar 3 mL de 0.05% tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) na chapa. Mistura por 1 min ou até que todas as células estão à tona.
   Nota: Observar o progresso de células desanexação da parte inferior da placa sob o microscópio como necessário.
5. Inativar tripsina pela adição de 5 mL de MEM com 10% FBS e pipeta de cima e para baixo para quebrar pedaços de célula Mass.
   Nota: Para o chapeamento antes de transfeccao, o meio utilizado não deve conter antibióticos. Adição de antibióticos pode diminuir a eficiência do transfection.
6. Transferir uma quantidade adequada de células para um tubo de 15-mLl dependendo do número de placas a transfected. Para cada placa de 96 poços, placa de 2 x 10 ⁶ células ou aproximadamente 1/5 de um prato de 100mm confluente de 100%, dando uma contagem de células de 2 x 10 ⁴ células por poço ou uma densidade de aproximadamente 15-30% confluência por bem. Centrifugar tubos a 200 x g por 5 min e aspirar o sobrenadante sem perturbar o centrifugado.
   Nota: Calcular a quantidade correta de células a ser chapeado em placas de 96 poços para evitar sobrecrescimento ou células antes da estimulação de undergrowing.
7. Adicionar uma quantidade adequada de MEM com 10% FBS na 15 mL do tubo e pipetar para cima e para baixo para quebrar pedaços da célula em massa. Para cada placa de 96 poços, Ressuspender as células com 6 mL de MEM com 10% FBS.
   Nota: Tenha cuidado para não gerar bolhas de ar no tubo.
8. Adicionar as células suspensas em um reservatório. Usando uma pipeta multicanal, pipete 50 µ l de células em cada poço de uma placa de 96 poços. Incubar durante uma noite a 37 ° C com 5% de CO ₂.

3. Transfection de plasmídeos

1. antes de transfeccao, observar as células chapeadas para assegurar uma adequada confluência de aproximadamente 30-50% por alvéolo sob um microscópio de contraste de fase e voltar para a incubadora.
2. Preparar antecipadamente o Rho-tag OR construção ^{11 , 21 , 22 , 28}, o fator acessório constrói (RTP1S ^{22 , 36} e M3R ²³), e a variante de biosensor construir ^{29 , 30} de miniprep. Quantificar a concentração de DNA por um espectrofotômetro e ajustar as concentrações de DNA do plasmídeo (por exemplo, a 100 ng / µ l) com água destilada, conforme necessário.
Preparação de misturas a transfeccao de
1. de
2. prepara uma mistura de transfeccao Plasmideo em 500 µ l de MEM para cada placa de 96 poços, de acordo com a tabela 1.
   Nota: Quando diferentes RUP é testados sobre a mesma placa de 96 poços, o volume da mistura de transfeccao e a quantidade de Plasmideo DNA adicionado deve ser adaptado em função do número de poços transfectados com um determinado OR.
3. Prepare uma mistura de transfeccao num tubo com 18 µ l de reagente de transfeccao mediada por lipídios em 500 µ l de Madame
3. Misturar a mistura com a mistura de transfeccao Plasmideo pipetando para cima e para baixo. Incubar a temperatura ambiente por 15 min.
4. Pare a reação adicionando 5 mL de MEM com 10% FBS.
5. Espalhar uma camada espessa de toalhas de papel estéril do capuz de cultura de células. Pegue uma placa de 96 poços com células da incubadora. Suavemente e repetidamente toque placa de cabeça para baixo sobre a pilha de papel toalha para que o meio é completamente absorvido pela toalha de papel.
   Nota: Não à força ou abruptamente tocar a placa como um poderia perder células.
6. Transferir 50 µ l da mistura de transfeccao combinada a cada poço da placa de 96 poços e incubar durante uma noite por 18-24h a 37 ° C com 5% de CO ₂.
   Nota: Uma agenda de transfecção e estimulação tempo gerenciado deve preceder a medição quando mais de uma placa de 96 poços são testados em um experimento para ter todas as placas medidas após o mesmo tempo de transfecção e tempo de exposição de estímulo.

4. Estimulação e a medição ou a atividade usando o ensaio de campo em tempo real

1. observar as células transfectadas sob um microscópio de contraste de fase para garantir uma adequada confluência de 50-80% por poço e voltar para a incubadora.
2. Prepare o suporte de estimulação adicionando o ácido de piperazineethanesulfonic de hidroxietil (HEPES) 10 mM e 5 mM de glicose para Hank ' s solução sal equilibrado (HBSS).
3. Descongelar as alíquotas de reagente de substrato de ensaio de campo em tempo real no gelo. Armazenar reagente substrato a-80 ° C a 55 µ l pelo tubo em cadeia da polimerase. Use 1 tubo por placa.
4. Preparar 2% solução de equilibração misturando 55 µ l de reagente substrato e solução de glicose/HBSS/HEPES 2750 µ l.
5. Espalhar uma camada espessa de toalhas de papel no banco. Suavemente e repetidamente toque placa de cabeça para baixo sobre a toalha de papel para que a transfeccao é completamente absorvido pela toalha de papel.
6. Lavar as células por pipetagem 50 µ l de solução HBSS/HEPES/glicose em cada Pocito.
7. Suavemente e repetidamente toque a solução HBSS/HEPES/glicose da placa de 96 poços.
8. Pipetar 25 µ l de solução de equilíbrio de 2% a cada bem e incubar a temperatura ambiente no escuro por 2 h.
9. Preparar antecipadamente 1m odorant Soluções conservadas em estoque em DMSO e loja a-20 ° C até usado.
10. Antes do final do tempo de incubação, diluir as soluções estoque de odorante de concentrações de trabalho no meio de estimulação HBSS/HEPES/glicose.
    Nota: As concentrações de odorante diluições preparadas nesta etapa devem ser duplicadas para render as concentrações finais corretas em cada poço.
11. Usando uma quimioluminescência placa leitor e antes da adição de odorante, medir o nível basal de luminescência da placa por 2 vezes consecutivas a uma taxa de 1000 ms por bem ³⁴.
12. Rapidamente, retire a placa do leitor de placa e adicionar as diluições de odorante 25 µ l de cada poço e começar imediatamente a medição contínua da luminescência de todos os poços para 20 ciclos dentro de 30 min.
    Nota: Pipeta com cuidado para não poluir os vizinhos poços quando usando diferentes odores e/ou concentrações diferentes de odorantes a mesma no mesmo prato.

5. Análise de dados

1. exportar os dados a partir do software de leitor de placa de quimioluminescência.
2. Calcular normalizado resposta OR para cada ponto de tempo, usando a fórmula de
   (luminescência _N – luminescência _basal) / (luminescência _maior – luminescência _basal)
   onde N = valor de luminescência de um certo bem; basal = valor médio da luminescência dos dois basais valores de luminescência; maior = maior valor de luminescência de uma placa ou um conjunto de placas de.
   Nota: Dependendo da finalidade do experimento, representações gráficas alternativas podem ser adoptadas. Por exemplo, para a seleção de ensaios (ver Figura 1) e para a geração de curvas concentração-resposta, o valor de luminescência de um determinado bem em um ponto de tempo desejado durante a medição cinético, tais como o valor máximo ou o valor final, podem ser usados.

Resultados

Muscona é o principal componente aromático de almíscar natural. Recentes estudos de OR5AN1 identificado como um receptor humano para muscona e outros compostos de almíscar macrociclos com base na homologia com o mouse ou, MOR215-1, clonado de glomérulos muscona-responsivos em comportar-se de ratos^37,38. Selecionando o repertório OR humano, nosso grupo e o grupo de Touhara também identificado OR5AN1 como um grande receptor p...

Discussão

Medir com precisão a ativação de um Bo após exposição a um determinado odorant é o primeiro passo para decifrar a codificação da informação olfactiva. Os experimentos mostrado neste estudo representam que um exemplo de como um pode identificar, usando um em vitro sistema de expressão OR, RUP ágil entre o repertório OR humano para o produto químico odoríferos de interesse e posteriormente, caracterizando o receptor Farmacologia, utilizando diferentes concentrações do produto químico. Nossos res...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Sigma	A2942
DMSO	Sigma	D2650
FBS	Gibco	10099-141
GloSensor cAMP reagent	Promega	E1290
pGloSensor-20F cAMP plasmid	Promega	E1171
Hana3A cells			available from authors upon request
HBSS, without calcium or magnesium	GIBCO	14175095
HEPES	Hyclone	SH30237
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-019
M3R plasmid			cloned into a mammalian expression vector such as pCI
MEM, with EBSS and L-glutamine	Hyclone	SH30024
Muscone	Santa Cruz	sc-200528
Musk tibetene	Sigma-Aldrich	S359165
OR plasmids			cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI
PBS, without calcium or magnesium	Cellgro	21-040-CV
Penicillin-streptomycin	Hyclone	SV30010
Plasmid miniprep kit	Tiangen	DP103-03
Puromycin	Sigma	P8833
RTP1S plasmid			cloned into a mammalian expression vector such as pCI
Trypsin-EDTA	Hyclone	SH30236
0.2-mL PCR tube	Axygen	PCR-02-C
1.5-mL Eppendorf tube	Eppendorf
15-mL 17 mm x 120 mm conical tube	BD Falcon	352096
8-well and/or 12-well multichannel pipetman	Eppendorf
96-well flat-bottomed white cell culture plate	Greiner	655098
100 mm x 20 mm cell culture dish	BD Falcon	353003
Class II biological safety cabinet with laminar flow
Cell culture incubator, with 5% CO2
Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes
Infinite F200 plate reader	Tecan
Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives
Spectrophotometer
Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution
Sterile paper towel