Yüksek molekül ağırlıklı Biotinylated Dextran Amin uygulama içinde sıçan izleme Thalamocortical projeksiyon için geliştirmek

Özet

Burada, etkili bir floresan yöntemi aracılığıyla karşılıklı bir sinirsel yol boyama ile etiketleme biotinylated dextran Amin (BDA) ortaya çıkarmak için rafine bir iletişim kuralı mevcut. Bu güzel yapı çözümleniyor için uygundur, etiketleme ve confocal bir lazer tarama mikroskop altında sinirsel diğer öğelerinden ayırt BDA.

Özet

Yüksek molekül ağırlıklı biotinylated dextran Amin (BDA) son derece hassas bir nöroanatomik izleyici onlarca yıl için kullanılmıştır. Onun etiketleme kalitesini çeşitli etkenlere göre burada, etkilendi biz rafine bir protokol yüksek molekül ağırlıklı BDA uygulama için en uygun sinir merkezi sinir sistemi etiketleme çalışmak için sağlar. BDA farenin hassas cam pipet ile talamus ventral posteromedial çekirdeği (VPM) içine stereotaksik enjeksiyon sonra BDA floresan streptavidin ile-Alexa (AF) 594 lekeli ve floresan Nisl leke AF500/525 ile counterstained. Yeşil Nisl boyama arka plan üzerinde kırmızı BDA, nöronal hücre gövdeleri ve aksonal terminaller gibi etiketleme daha belirgin korteks somatosensor gösterilmiştir. Ayrıca, floresan BDA için boyama çift ve kalsiyum bağlayıcı protein parvalbumin (PV) korelasyon BDA etiketleme ve PV-pozitif interneurons sinirsel yerel çalışma fırsatı sağlayan kortikal hedefteki gözlemlemek için yapılmıştır Devreler ve kimyasal özellikleri. Böylece, rafine bu yöntem sadece yüksek kaliteli talamus ve serebral korteks arasında karşılıklı Sinirsel yollar aracılığıyla yüksek molekül ağırlıklı BDA ile etiketleme sinirsel görüntülenmesi için uygun değildir, ancak aynı zamanda eşzamanlı gösteri verecektir Floresan histochemistry veya İmmünokimya diğer sinir işaretleyicilerle.

Giriş

Yüksek molekül ağırlıklı BDA (10.000 moleküler ağırlık), son derece hassas bir izleyici, merkezi sinir sistemi üzerinde 20 yıl¹için Sinirsel yollar izleme için kullanılmıştır. BDA kullanımı teknik izleme ortak bir sinir yolu olsa da, BDA etiketleme kalitesini hayvanlarda çeşitli faktörler^1,2,3tarafından etkilenebilir. Bizim son çalışma BDA etiketleme en uygun yapısı sadece uygun sonrası enjeksiyon yaşam süresi ile ilgili ama aynı zamanda boyama yöntemi⁴ile korelasyon göstermiştir. Şimdi, geleneksel avidin-biotin-peroksidaz kompleksi (ABC), streptavidin floresein isothiocyanate ve streptavidin-AF594 kadar boyama yöntemleri BDA önceki çalışmalar^2,3' te^{etiketleme ifşa için kullanılması, 4,5}. Buna karşılık, floresan BDA için boyama kolayca gerçekleştirilebilir.

Yüksek molekül ağırlıklı BDA uygulanması genişletmek için rafine bir iletişim kuralı da çalışmanın kullanılmaya başlandı. Talamus sıçan beyin VPM içine BDA enjeksiyonu, BDA etiketleme ortaya standart ABC boyama düzenli yöntemi yanı sıra çift Floresan, hangi BDA etiketleme korelasyon gözlemleyerek için gerçekleştirildiği boyama ve temel Sinirsel öğeleri veya interneurons kortikal hedef streptavidin-AF594 ve floresan Nisl histochemistry veya PV-İmmünokimya, anılan sıraya göre. VPM ve Primer somatosensor korteks (S1)^6,7,8arasında karşılıklı Sinirsel yollar, biz bizim gözlem BDA etiketleme öngörülen thalamocortical akson ve corticothalamic üzerinde duruldu S1 içinde öngörülen hücre somas. Bu işlem tarafından sadece sinirsel yüksek molekül ağırlıklı BDA ile etiketleme yüksek kalitesini elde etmek için ayrıntılı bir iletişim kuralı, aynı zamanda rafine bir protokol floresan BDA etiketleme ile birlikte ve diğer floresan sinirsel belirteçleri ile sağlamak bekleniyor histochemistry veya İmmünokimya. Bu yaklaşım yerel sinir devreleri ve confocal bir lazer mikroskobu tarama altında kimyasal özellikleri çalışma için tercih edilir.

Protokol

Bu çalışmada, Çin Çince tıbbi Bilimler Akademisi (referans numarası 20160014) Etik Komitesi tarafından kabul edildi. Tüm yordamları bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı (Ulusal Akademisi basın, Washington, DC, 1996) için Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Dört yetişkin erkek rats (ağırlığı 250-280 g) Bu çalışmada kullanılmıştır. Bütün hayvanlar kontrollü sıcaklık ve nem ile 12 h açık/koyu döngüsünde yer alan ve gıda ve su ücretsiz erişim izni. Aletleri ve malzemeler mevcut çalışmada kullanılan şekil 1' de gösterdi.  Ameliyattan önce stereotaksik çerçeve ve cam pipet, gibi tüm araçları % 70 etanol kullanarak temizlenmiştir.

1. cerrahi işlemler

1. Stereotaksik atlas⁹ (şekil 2A) kullanarak VPM ilgi koordinat alanı belirleyin.
2. 1 µL mikro-cam micropipette (yaklaşık 10-20 µm ipucu çaplı) ile donatılmış şırınga hazırlamak (şekil 1 d) ve Sıvı parafin ile test edin.
3. % 7 kloral hidrat (0.7 mL/100 g) farelerle mayi enjeksiyonu ile anestezi.
4. Derin anestezi onaylandıktan sonra kuyruk ile pinch ve para çekme refleks pedal, hayvanın başının ile tıraş Tıraş ve cerrahi sitesi 3 kez sırasıyla % 70 etanol tarafından takip % 10 povidone iyot ile fırçalayın.
5. Fareyi kulaklarına künt kulak çubuklarını yerleştirerek stereotaksik cihazın içine yerleştirin ve sıçan üst kesici dişler (şekil 1E) ağız yuvasına yerleştirin ve oftalmik merhem gözünü uygulayın.
6. Tekrar % 70 etanol kullanarak cerrahi sitesinin baş cilt temizlemek. Havlu ve steril cerrahi eldiven steril koşullarda ameliyat korumak için kullanın.
7. Cilt sagittal dikiş (şekil 1F) boyunca bir neşter ile sagittal bir kesi yapmak.
8. Kas ve steril pamuklu uçlu uygulayıcıları (şekil 1F) kanama kontrol cerrahiye boyunca kullanarak kafatası uzak kapaklarini kazı.
9. Bir Atlas (şekil 2A) önceden tanımlanmış koordinatları kullanarak, kranyotomi (şekil 1G) konumunu (-3.3 mm Bregma noktası, orta hat sağa 2.6 mm) belirleyin.
10. Burr matkap ile yuvarlak uçlu biraz (#106) (Resim 1 H) kullanarak bir kranyotomi gerçekleştirmek ve meninkslerde (şekil 1I) ulaşan kadar bir kaç dakika içinde Delme hakkında 1 mm derinliği için devam edin.
11. Serebral korteks enjeksiyon sitesi (şekil 1I) üzerinden ortaya çıkarmak için microforceps kullanarak dura mater tüketim.
12. Sıvı parafin % 10 BDA (10.000 molekül ağırlığı, distile su içinde) çözüm (şekil 1J) mikro şırınga değiştirin.
13. Şırınga mikroenjeksiyon aparatı monte ve bir mikro-pompa ile (şekil 1 K) bağlanın.
    Not: enjekte birimi mikro-pompa hızına bağlıdır. Burada 30 nL/dk (şekil 1 L) ayarlandı.
14. Bir stereomicroscope altında VPM 5.8 mm (şekil 1 M) derinlikte beynin kortikal yüzeyi üzerinden el ile mikroenjeksiyon aparatı ile cam micropipette takın.
15. Basınç enjekte-bir %100 10 nL BDA VPM 3 dk (35 nL/dk) bir mikro-pompa (şekil 1 L, M) ile bir süre içine.
16. Sonra enjeksiyon, pipet, yerde bir ek 5 min için tutun ve sonra yavaş yavaş geri.
17. Yara steril vida (şekil 1N) dikiş. Öncesi ve ameliyat sonrası analjezi için senin yerel hayvan bakımı Komitesi yönergeleri izleyin.
18. Bilincinin tekrar yerine geleceğinden ve tamamen iyileşti kadar fareyi bir sıcak kurtarma alanında koyun.
19. Kurtarılan fareyi onun kafes için geri dönün.

2. perfusions ve bölümler

1. Sonra bir yaşam süresi genellikle 10 günlük hayvan mayi enjeksiyonu ile ötenazi ikna etmek için % 10 üretan (2 mL/100 g) aşırı dozda enjekte et.
2. Hood (şekil 1O) deneysel fareler sıvı.
   1. Bir kez nefes durur, makas ve forseps, kullanarak kalp erişmek için fareyi göğüs boşluğuna açın. Sol ventrikül aort doğru bir damar içi kateter takın ve doğru auricle açın.
   2. İlk % 0,9 fosfat tamponlu tuz (PBS), fizyolojik sıcaklığında (37 ° C) ile sıvı kadar kan kalpten çıktıktan 1-2 dk temizleyin ve 250-300 mL % 4 paraformaldehyde 0.1 M fosfat tampon (PB, pH 7,4) ile devam edin.
3. Perfüzyon sonra baş cilt deşmek ve kafatasını açıp sıçan beyin incelemek. Oda sıcaklığında (26 ° C), o zaman cryoprotect içinde % 30 Sükroz 0.1 M PBS (pH 7,4) beyin çözüm (şekil 1 P) batırılır kadar 4 ° C'de 3 gün içinde 2 h için %4 paraformaldehyde disseke beyinde sonrası tamir et.
4. Bir kez beyin çözümde batırılır, beyin üzerinde beyin matrisler (şekil 1Ç) Koronal yönde üç sokak bölün. Merkezi bloğu VPM ve S1 içerir.
5. Koronal microtome sistemini sürgülü bir dondurucu sahnede merkezi bloğu 40 µm, beynin kesti. Bu bölümlerde düzenli bir 6-iyi yemek (rakamlar 1R, S) 0.1 M PBS (pH 7,4) ile toplamak.

3. standart ABC boyama

Not: Beynin her üçüncü koronal bölümünden ücretsiz kayan bölümler BDA standart ABC yordamı¹⁰ile etiketleme görüntülenmesi için kullanılmıştır.

1. 0.1 M PBS için yaklaşık 1 dakika bölümlerde durulayın.
2. (PH 7,4) içeren %0,3 %1 0.1 M PB ABC çözümde bölümlerde kuluçkaya Triton X-100 oda sıcaklığında 1 h için.
3. Sonraki bölümlerde 50 mM Tris arabellek (pH 7,4) üç kere yıkayın.
4. %0,02 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) ve %0.01 H₂O₂ oda sıcaklığında yaklaşık 2-5 dakika için 50 mM Tris arabellek içeren bir çözüm bölümlerde leke.
5. Sonraki bölümlerde 50 mM Tris arabellek (pH 7,4) üç kere yıkayın.
6. Bölümler standart histochemical teknikleri (1T rakam; bkz: Ek Video dosyası III, perfüzyon ve bölümler) kullanarak mikroskop slaytlarda bağlayın.
7. Gecede, oda sıcaklığında hava bölümlerde kuru.
8. Alkol (% 50, % 70, % 95, % 100) çözümleri kısa bir süre içinde bir dizi bölümlerini kurutmak. Her çözüm için yaklaşık 15 slaytları daldırın s. Slaytlar arasında her adım kurumasına izin vermez.
9. Ksilen bölümlerde üç kez, yaklaşık 20 dk temizleyin.
10. 2-3 damla balsam dilimleri koyun sonra coverslips bölümleri yerleştirin.

4. çift floresan BDA ve serebral korteks nöral temel öğeleri için boyama

Not: Buna ek olarak, çift floresan boyama BDA etiketleme korelasyon gözlemleyerek için yapılmıştır ve yukarıdaki bitişik bölümleri üzerinde temel sinir öğelerini streptavidin-AF594 ile kullanılan ve floresan Nisl leke AF500/525 ile counterstained.

1. 0.1 M PBS için yaklaşık 1 dakika bölümlerde durulayın.
2. Streptavidin-AF594 (1:500) ve AF500/525 yeşil flüoresan Nisl leke (1:1, 000) 0.1 M PBS karışık bir çözümde bölümlerini (pH 7,4) içeren %0,3 kuluçkaya Triton X-100 oda sıcaklığında 2 h için.
3. Sonraki bölümlerde 0.1 M PB (pH 7,4) üç kere yıkayın.
4. Bölümler standart histochemical teknikleri kullanarak mikroskop slaytlarda bağlayın. Kuru havada yaklaşık 1 h için bölümler.
5. Coverslips % 50 gliserin gözlem önce distile su ile floresan bölümlerine uygulanır.

5. çift floresan BDA ve Interneurons serebral korteks için boyama

Not: Çift floresan boyama BDA etiketleme ve interneurons streptavidin-AF594 ve PV-İmmünokimya kortikal hedefle temsilcisi bölümlerde Tarih korelasyon gözlemleyerek için gerçekleştirilmiştir.

1. 0.1 M PBS (pH 7,4) yaklaşık 1 dakika için temsilcisi bölümlerde durulayın.
2. % 3 normal keçi serum ve %0,3 içeren bir engelleme çözüm bölümlerde kuluçkaya Triton X-100 0.1 M PBS için 30 dk içinde.
3. Fare monoklonal anti-PV IgG (1:1, 000) 0.1 M PBS (pH 7,4) içeren % 1 normal keçi serum ve %0,3 bir çözüm içine bölümleri transfer Triton X-100 gecede 4 ° C'de için
4. Ertesi gün, sonraki bölümlerde 0.1 M PBS (pH 7,4) üç kere yıkayın.
5. Karışık bir çözüm bölümlerine keçi mouse-AF488 ikincil antikor (1:500), Serumda 0.1 M PBS (pH 7,4) içeren % 1 normal keçi streptavidin-AF594 (1:500) ve 4', 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI, 1:40, 000) ve 0,3 açığa % Triton 1 h için X-100.
6. 4.3-4.5 adımları yineleyin.

6. gözlem

1. VPM, thalamocortical akson ve corticothalamic nöronlar görüntülerini almak.
   1. Hedefleri lensler ile donatılmış bir confocal görüntüleme sistemi ile floresan örnekleri gözlemlemek (4 x, NA: 0,13; 10 x, NA: 0.40; ve 40 x, NA: 0.95). 405 (mavi), 488 (yeşil), uyarma ve emisyon dalga boylarında ve 559 (kırmızı) nm kullanın.
      Not: Burada, confocal iğne deliği 152 µm (4 x, 10 x) ve 105 µm (40 x). Görüntü yakalama Uzaysal çözünürlük 1024 × 1024 piksel (4 x, 10 x) ve 640 × 640 piksel (40 x) olduğunu.
   2. Yirmi görüntüler 40 µm (Z serisi) kalınlığı, her bölüm 2 µm ardışık çerçeveler içinde tutar.
   3. Görüntüleri tek bir odakta görüntü confocal görüntü işleme için aşağıdaki gibi üç boyutlu analiz yazılım sistemi ile entegre: ayarla başlat odak düzlemi → set sonunda odak düzlemi → set adım boyutu → derinlik desen → görüntü yakalama → Z serisi seçin.
2. Bir dijital fotoğraf makinesi ile donatılmış bir ışık mikroskobu tarafından aydınlık alan görüntü alabilir (4 x, NA: 0,13; 10 x, NA: 0.40; ve 40 x, NA: 0.95 lensler). Bir çekim hızı 500 Bayan kullanım fotoğraf düzenleme yazılımı, parlaklık ve kontrast görüntülerin ve etiket eklemek için kullanın.

Sonuçlar

BDA 10 gün sonrası enjeksiyon VPM içine yaşama yoğun nöral karşılık gelen kortikal alanlarda enjeksiyon yüz (Şekil 2) Ipsilateral etiketleme üretmek için yeterli idi. Hem geleneksel ABC ve yordamlar için BDA boyama floresan sinir anterogradely de dahil olmak üzere S1 üzerinde etiketleme benzer desen thalamocortical akson etiketli ve retrogradely (şekil 2C, D corticothalamic nöronlar etiketli ortaya

Tartışmalar

Uygun izleme aygıtı seçme başarılı sinirsel izleme deneme için kritik bir adımdır. BDA, yüksek molekül ağırlıklı BDA ailesi (10.000 moleküler ağırlık) düşük moleküler ağırlıklı BDA (3.000 moleküler ağırlık)^2,3 aksine anterograd sinir yolu ile tercihen taşınması için tavsiye edilir ^{, 11 , 12 , 13}. ancak, birçok çalışma Ayr...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biotinylated dextran amine (BDA)	Molecular Probes	D1956	10,000 molecular weight
Streptavidin-Alexa Fluor 594	Molecular Probes	S32356	Protect from light
500/525 green fluorescent Nissl stain	Molecular Probes	N21480	Protect from light
Brain stereotaxis instrument	Narishige	SR-50
Freezing microtome	Thermo	Microm International GmbH
Confocal imaging	Olympus	FV1200
system
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Sprague Dawley	Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences	SCKX (JUN) 2012-004
Vectastain ABC Kit	Vector Laboratories	PK-4000
superfrost plus microscope slides	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm
Photoshop and Illustration	Adobe	CS5