Migliorare l'applicazione di alto peso molecolare del dextrano Biotinylated ammina per proiezione Thalamocortical traccia nel ratto

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo raffinato per rivelare efficacemente biotinilati ammina di destrano (BDA) etichettatura con una colorazione metodo attraverso un reciproco percorso neurale fluorescente. È adatto per analizzare la struttura fine del BDA etichettatura e distinguerlo da altri elementi neurali sotto un microscopio a scansione confocale del laser.

Abstract

Ammina di alto peso molecolare biotinilati destrano (BDA) è stato utilizzato come tracciante neuroanatomical altamente sensibile per molti decenni. Poiché la qualità della relativa etichettatura è stata influenzata da vari fattori, qui, forniamo un protocollo raffinato per l'applicazione ad alto peso molecolare BDA per studiare ottimale etichettatura neurale nel sistema nervoso centrale. Dopo l'iniezione stereotactic del BDA nel nucleo posteromedial ventrale (VPM) del talamo nel ratto mediante una pipetta di vetro delicato, BDA era macchiata con fluorescente streptavidina-Alexa (AF) 594 e controcolorato con fluorescente di Nissl AF500/525. Sullo sfondo di colorazione di Nissl verde, il rosso BDA etichettatura, tra cui corpi delle cellule neuronali e assonali terminali, è stata dimostrata più distintamente nella corteccia somatosensoriale. Inoltre, doppia colorazione fluorescente per BDA e la parvalbumina di proteine leganti il calcio (PV) è stato effettuato per osservare la correlazione di etichettatura BDA e interneuroni PV-positivi nella destinazione corticale, fornendo l'opportunità di studiare il locale neurale circuiti e le loro caratteristiche chimiche. Così, questo metodo raffinato non è solo adatto per la visualizzazione di alta qualità neurali etichettatura con l'alto peso molecolare BDA attraverso percorsi neurali reciproci tra il talamo e la corteccia cerebrale, ma anche permetterà la dimostrazione simultanea di altri marcatori neurali con istochimica fluorescente o immunochimica.

Introduzione

Ad alto peso molecolare BDA (10.000 peso molecolare), un tracciante altamente sensibile, è stato utilizzato per tracciare i percorsi neurali nel sistema nervoso centrale per oltre 20 anni¹. Anche se l'uso del BDA è un comune delle vie neurali, analisi tecnica, la qualità del BDA etichettatura può risentire in animali vari fattori^1,2,3. Il nostro studio recente ha indicato che la struttura ottima del BDA etichettatura è non solo connesso con un tempo di sopravvivenza post-iniezione corretta, ma anche correlata con la colorazione metodo⁴. Fino ad ora, convenzionale complesso avidina-biotina-perossidasi (ABC), streptavidina-isotiocianato di fluoresceina e streptavidina-AF594 sono stati utilizzati metodi di colorazione per rivelare l'etichettatura BDA in precedenti studi^{2,3, 4,5}. In confronto, colorazione fluorescente per BDA può essere facilmente eseguita.

Al fine di estendere l'applicazione ad alto peso molecolare BDA, è stato introdotto un protocollo raffinato nello studio presente. Dopo l'iniezione del BDA in VPM del talamo nel cervello del ratto, BDA etichettatura è stata rivelata dal regolare metodo di macchiatura di ABC standard così come dalla macchiatura fluorescente doppio, che è stato effettuato per osservare la correlazione di etichettatura BDA e base gli elementi neurali o interneuroni nella destinazione corticale con streptavidina-AF594 e fluorescente Nissl istochimica o PV-immunochimica, rispettivamente. Attraverso i percorsi neurali reciproci tra VPM e la corteccia somatosensoriale primaria (S1)^6,7,8, abbiamo focalizzato la nostra osservazione il BDA etichettatura negli assoni thalamocortical proiettata e corticothalamic somas proiettata cellula S1. Da questo processo, ci aspettavamo di fornire non solo un protocollo dettagliato per ottenere l'alta qualità di etichettatura neurali ad alto peso molecolare BDA, ma anche un raffinato protocollo sulla combinazione di contrassegno fluorescente BDA e altri marcatori fluorescenti neurali con l'istochimica o immunochimica. Questo approccio è preferibile per studiare i circuiti neurali locali e le loro caratteristiche chimiche sotto un laser confocale microscopia a scansione.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico presso la Cina cinese medico Accademia (numero di riferimento 20160014). Tutte le procedure sono state condotte in conformità della istituti nazionali di salute Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). In questo studio sono stati utilizzati quattro ratti del maschio adulto (250-280 g di peso). Tutti gli animali erano alloggiati in un ciclo luce/buio di 12 h con temperatura e umidità controllate e consentiti il libero accesso al cibo e acqua. Gli strumenti e i materiali utilizzati nel presente studio sono stati ha mostrati nella Figura 1.  Prima della chirurgia, tutti gli strumenti, come cornice stereotassica e pipetta di vetro, sono stati puliti con etanolo al 70%.

1. interventi chirurgici

1. Determinare l'area delle coordinate di interesse in VPM usando un Atlante stereotassiche⁹ (Figura 2A).
2. Preparare una 1 µ l micro-siringa con una micropipetta di vetro (con un diametro di punta di circa 10-20 µm) (Figura 1) e testarlo con paraffina liquida.
3. Anestetizzare i ratti con 7% cloralio idrato (0,7 mL/100 g) tramite l'iniezione intraperitoneale.
4. Una volta confermata l'anestesia profonda con coda pizzicare e riflesso di ritiro del pedale, radere la parte superiore della testa dell'animale con un rasoio elettrico e strofinare il sito chirurgico 3 volte con iodio povidone 10% seguito da etanolo al 70%, rispettivamente.
5. Inserire il ratto nel dispositivo stereotassica inserendo Barre smussate orecchio nelle orecchie e inserire gli incisivi superiori del ratto nel supporto della bocca (Figura 1E) e quindi applicare unguento oftalmico sugli occhi.
6. Pulire la pelle di testa del sito chirurgico utilizzando etanolo al 70%. Utilizzare guanti chirurgici sterili e asciugamani per mantenere la chirurgia in condizioni sterili.
7. Fare un'incisione sagittale nella pelle con un bisturi lungo la sutura sagittale (Figura 1F).
8. Raschiare il muscolo e il periostio dal cranio con applicatori di cotone con punta sterile durante l'intervento chirurgico per controllare lo spurgo (Figura 1F).
9. Utilizzando le coordinate predefinite da un Atlante (Figura 2A), determinare la posizione (punto di Bregma-3,30 mm, 2.6 mm destra alla linea mediana) del craniotomy (Figura 1).
10. Eseguire una craniotomia con un trapano di bava con un po' di turno-punta (#106) (Figura 1 H) e continuare ad esplorare a circa una profondità di 1 mm in pochi minuti fino a raggiungere le meningi (Figura 1I).
11. Asportare il mater di dura utilizzando Micropinze per esporre la corteccia cerebrale sul sito di iniezione (Figura 1I).
12. Cambiare la paraffina liquida nella micro-siringa con soluzione al 10% BDA (10.000 peso molecolare, in acqua distillata) (Figura 1J).
13. Montare la siringa nell'apparecchio microiniezione e connettersi con micro-pompa (Figura 1 K).
    Nota: Il volume iniettato è dipenda dalla velocità della micro-pompa. Qui è stato registrato a 30 nL/min (Figura 1 L).
14. Sotto un microscopio stereoscopico, inserire una micropipetta di vetro manualmente con l'apparato di microiniezione VPM attraverso la superficie corticale del cervello alla profondità di 5,8 mm (Figura 1 M).
15. Pressione-iniettare un 100 nL 10% BDA in VPM per un periodo di 3 minuti (35 nL/min) con micro-pompa (Figura 1 L, M).
16. Dopo l'iniezione, tenere la pipetta in luogo per altri 5 minuti e poi ritirarsi lentamente.
17. Suturare la ferita con filo sterile (Figura 1N). Seguire le vostre linee guida comitato locale cura degli animali per analgesia pre- e post-chirurgica.
18. Posizionare il ratto in un'area di recupero caldo finché riprende conoscenza ed è completamente recuperato.
19. Riportare il ratto recuperato alla sua gabbia.

2. le aspersioni e sezioni

1. Dopo un tempo di sopravvivenza di in genere 10 giorni, iniettare l'animale con una overdose di uretano 10% (2 mL/100 g) tramite l'iniezione intraperitoneale per indurre l'eutanasia.
2. Irrorare i ratti sperimentali nella cappa (Figura 1O).
   1. Una volta che il respiro si ferma, con delle forbici, pinze, aprire la cavità toracica del ratto per accedere al cuore. Inserire un catetere endovenoso nel ventricolo sinistro verso l'aorta e quindi aprire il auricle di destra.
   2. In primo luogo irrorare con 0,9% tampone fosfato salino (PBS) alla temperatura fisiologica (37 ° C) circa 1-2 minuti fino a quando il sangue esce dal cuore è chiaro e poi continuare con paraformaldeide al 4% di 250-300 mL in tampone fosfato 0,1 M (PB, pH 7.4).
3. Dopo la perfusione, incise la pelle testa e apre il cranio e poi sezionare il cervello del ratto. Post-fissare il cervello sezionato in paraformaldeide al 4% per 2 h a temperatura ambiente (26 ° C), poi cryoprotect nel 30% di saccarosio in 0.1 M PBS (pH 7.4) per 3 giorni a 4 ° C fino a quando il cervello è immerso nella soluzione (Figura 1 P).
4. Una volta che il cervello è immerso nella soluzione, è possibile dividere il cervello in tre isolati in direzione corona sulle matrici del cervello (Figura 1Q). Il blocco centrale contiene il VPM e S1.
5. Tagliare il blocco centrale del cervello a 40 µm su una fase di congelamento microtomo scorrevoli in direzione corona. Raccogliere queste sezioni ordinate in un piatto 6-pozzetti con PBS 0.1 M (pH 7.4) (figure 1R, S).

3. standard ABC macchiatura

Nota: Sezioni galleggiante libera da ogni terza sezione coronale del cervello sono state utilizzate per la visualizzazione l'etichettatura BDA con standard ABC procedura¹⁰.

1. Risciacquare le sezioni in 0.1 M PBS per circa 1 min.
2. Incubare le sezioni in 1% soluzione di ABC in PB 0.1 M (pH 7.4) contenente 0,3% Triton X-100 per 1 h a temperatura ambiente.
3. Lavare le sezioni tre volte in tampone Tris 50 mM (pH 7.4).
4. Macchia le sezioni in una soluzione contenente 0,02% 3, tetrahydrochloride 3'-diaminobenzidina (DAB) e 0,01% H₂O₂ in tampone Tris 50 mM per circa 2-5 min a temperatura ambiente.
5. Lavare le sezioni tre volte in tampone Tris 50 mM (pH 7.4).
6. Montare le sezioni su vetrini da microscopio utilizzando tecniche istochimiche standard (Figura 1T; Vedi Supplemental Video File III, perfusione e sezioni).
7. Asciugare le sezioni nell'aria durante la notte a temperatura ambiente.
8. Disidratare le sezioni brevemente in una serie di soluzioni alcoliche (50%, 70%, 95%, 100%). Immergere i vetrini in ogni soluzione per circa 15 s. Non lasciare i vetrini ad asciugare tra ogni fase.
9. Deselezionare le sezioni in xilene tre volte, circa 20 min.
10. Mettere 2 o 3 gocce di balsamo sulle fette quindi posizionare i vetrini coprioggetti sulle sezioni.

4. doppia colorazione fluorescente per BDA ed elementi base neurali nella corteccia cerebrale

Nota: al contrario, doppia colorazione fluorescente è stato effettuato per osservare la correlazione di etichettatura BDA ed elementi base neurali su sezioni adiacenti al precedente utilizzato con streptavidina-AF594 e controcolorati con fluorescente di Nissl AF500/525.

1. Risciacquare le sezioni in 0.1 M PBS per circa 1 min.
2. Incubare le sezioni in una soluzione mista di streptavidina-AF594 (1: 500) e AF500/525 verde fluorescente di Nissl (1:1, 000) in PBS 0.1 M (pH 7.4) contenente 0,3% Triton X-100 per 2 h a temperatura ambiente.
3. Lavare le sezioni tre volte in PB 0.1 M (pH 7.4).
4. Montare le sezioni su vetrini da microscopio utilizzando tecniche istochimiche standard. Asciugare le sezioni in aria per circa 1 h.
5. Applicare coprioggetti alle sezioni fluorescenti con glicerina 50% in acqua distillata prima dell'osservazione.

5. doppia colorazione fluorescente per BDA e interneuroni nella corteccia cerebrale

Nota: Doppia colorazione fluorescente è stato effettuato per osservare la correlazione di etichettatura BDA e interneuroni sulle sezioni rappresentative nella destinazione corticale con streptavidina-AF594 e PV-immunochimica.

1. Risciacquare le sezioni rappresentative in 0.1 M PBS (pH 7.4) per circa 1 min.
2. Incubare le sezioni in una blocco soluzione contenente siero di capra normale del 3% e lo 0,3% Triton X-100 in 0.1 M PBS per 30 min.
3. Trasferire le sezioni in una soluzione di mouse monoclonale anti-PV IgG (1:1, 000) in 0.1 M PBS (pH 7.4) contenente 1% di capra normale siero e 0,3% Triton X-100 per una notte a 4 ° C.
4. Il giorno seguente, lavare le sezioni tre volte in PBS 0.1 M (pH 7.4).
5. Esporre le sezioni per una soluzione mista di anticorpo di capra anti-mouse-AF488 secondario (1: 500), streptavidina-AF594 (1: 500) e 4', 6-diamidino-2-phenylindole dicloridrato (DAPI, 01:40, 000) in siero di capra normale contenente 1% di 0.1 M PBS (pH 7,4) e 0,3% Triton X-100 per 1 h.
6. Ripetere i passaggi da 4.3 a 4.5.

6. osservazione

1. Prendere le immagini del VPM, thalamocortical assoni e i neuroni corticothalamic.
   1. Osservare i campioni fluorescenti con un sistema di imaging confocale dotato di lenti obiettivi (4x, NA: 0.13; 10 x, NA: 0.40; e 40 x, NA: 0.95). Utilizzare lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione di 405 (blu), 488 (verde) e 559 nm (rosso).
      Nota: Qui, il foro stenopeico confocale è 152 µm (4x, 10x) e 105 µm (40x). La risoluzione spaziale di acquisizione dell'immagine è di 1024 × 1024 pixel (4x, 10x) e 640 × 640 pixel (40x).
   2. Prendere venti immagini in fotogrammi successivi di 2 µm da ogni sezione allo spessore di 40 µm (serie Z).
   3. Integrare le immagini in una singola immagine di messa a fuoco con l'immagine confocale elaborazione sistema software per l'analisi tridimensionale come segue: impostare inizio piano focale → fine set piano focale → istruzione imposta dimensione → scegliere profondità modello → immagine cattura → Z series.
2. Prendere immagini campo chiaro di un microscopio ottico dotato di una fotocamera digitale (4x, NA: 0.13; 10 x, NA: 0.40; e 40 x, NA: 0,95 lenti). Per regolare la luminosità e il contrasto delle immagini e per aggiungere etichette, utilizzare un tempo di esposizione del software di fotoritocco in uso di 500 ms.

Risultati

Sopravvivenza di 10 giorni dopo l'iniezione del BDA nel VPM era sufficiente per la produzione di intenso neurale etichettatura sulle aree corticali corrispondenti ipsilateral al lato di iniezione (Figura 2). ABC sia procedure di colorazione per BDA fluorescenti convenzionali hanno rivelato il modello simile di etichettatura neurale su S1, tra cui anterograda denominata thalamocortical assoni e retrogradely neuroni corticothalamic (Figura ...

Discussione

Selezionando un elemento tracciante corretto è un passo fondamentale per un esperimento di successo analisi neurale. Nella famiglia del BDA, ad alto peso molecolare BDA (10.000 peso molecolare) è stato consigliato di essere preferenzialmente trasportato attraverso il percorso neurale anterograda contrariamente a basso peso molecolare BDA (peso molecolare 3.000)^{2,3 , 11 , 12 ,}

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biotinylated dextran amine (BDA)	Molecular Probes	D1956	10,000 molecular weight
Streptavidin-Alexa Fluor 594	Molecular Probes	S32356	Protect from light
500/525 green fluorescent Nissl stain	Molecular Probes	N21480	Protect from light
Brain stereotaxis instrument	Narishige	SR-50
Freezing microtome	Thermo	Microm International GmbH
Confocal imaging	Olympus	FV1200
system
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Sprague Dawley	Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences	SCKX (JUN) 2012-004
Vectastain ABC Kit	Vector Laboratories	PK-4000
superfrost plus microscope slides	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm
Photoshop and Illustration	Adobe	CS5