Grubuyla Fare Kortikal Nöron Kültürler hazırlanması

Özet

Bu video geç embriyo ve erken postnatal fare kortekste nöronal kültürlerin üretmek için bir prosedür gösterir. Bu kültürler immünsitokimya, biyokimya, elektrofizyoloji, kalsiyum ve sodyum görüntüleme için kullanılan ve doğum sonrası ölümcül bir gen mutasyonu taşıyan transgenik hayvanlar nöronal geliştirme çalışması için bir platform sağlamak olabilir.

Özet

Bu video geç embriyo ve erken postnatal fare beyin kortikal nöronal kültürlerin üretmek için süreç boyunca size rehberlik edecektir. Bu kültürler immünsitokimya, biyokimya, elektrofizyoloji, kalsiyum ve sodyum görüntüleme, protein ve / veya RNA izolasyon da dahil olmak üzere çok çeşitli uygulamalar için de kullanılabilir. Bu kültürler de, geç embriyonik ya da doğum sonrası ölümcül bir gen mutasyonu taşıyan transgenik hayvanlar nöronal gelişim çalışması için bir platform sağlar. Bu prosedür, nispeten düz ileri doku kültürü tekniği biraz tecrübe gerektirir ve düzgün bir şekilde hazırlanır 2-3 saat daha uzun sürmemelidir. Talamo-kortikal fiber kanaldan kortikal kabuklu dikkatli olarak ayrılması istenmeyen non-nöronal hücrelerin sayısını azaltacaktır. Nöronal hücrelerin verimi enzim inkübasyon adımdan sonra yavaşça kortikal doku parçalarını çiğnemek artırmak için. Hücreleri ve erken nöronal hücre ölümü gereksiz hasarı önlediğini Bu zorunludur. Bu kültürlerin glia besleyici hücrelerin yokluğunda korunur, aynı zamanda nöronlarda zenginleştirilmiş büyüyen kültürlerin ilave bir avantaj sağlayacaktır.

Protokol

Kültür gün önce hazırlıklar:

• Steril diseksiyon çözüm (DS) hazırlayın.
• NBM/B27 (B27 takviyeleri ile Neurobasal Mediom) hazırlayın.
• Gerekirse Otoklav GKD ₂ O ve cam coversilps sterilize edin.
• Poli-D-lizin ile Coat doku kültürü yemekler ya da cam lamelleri.

Poly-D-Lizin Kaplama:

Steril koşullar altında kültür bir gün önce hazırlayın.

• 10X PDL ve buz üzerinde yer çözülme kısım.
• PDL 1 ml 9 ml steril ultra-filtrelenmiş su ekleyin ve iyice karıştırın (1X).
• 1X PDL ile aşağıdaki gibi oda sıcaklığında gece Coat yüzeyler:
  • cam lamelleri (Bellco Cam, Inc Kedi # 1.943-00.012): 75 ul / lamel
    VEYA
  • 24 kuyu kültür plaka: 300 ul / iyi
    VEYA
  • 35mm kültür çanak: 1ml/dish
• 5X steril su (sıvı aspirat steril Pasteur pipetler) ile durulayın.
• Yüzey tamamen kuruyana kadar su çıkarın.

Kültürleme prosedürü (steril koşullar altında laminer akış kaput yapılan)

1. Süper yapıştırıcı kullanarak mikrotom Vibraslicer (Chipping Instruments Ltd) destek blok üzerine agar blok ve tutkal bu kesin.
2. Geç embriyonik evre (E17-18) fare fetusların euthanise baraj kullanırken, embriyonik çuval rahim ve ücretsiz bireysel fetusların çıkarın. Steril Petri kabı içine yerleştirin fetus ve devam aşağıda özetlendiği gibi.
3. Başını kesmek fare fetüs veya yavru (Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış takip esaslar).
4. Soğuk DS ile dolu bir 60mm petri Whatman filtre kağıdı diske deri ve kafatası yer ve beyin çıkarın.
5. Steril bir jilet kullanarak beyincik kesti.
6. Spatula kullanarak beyin Pick up ve filtre kağıdı üzerinde aşırı sıvı drenaj yerinde Vibraslicer destek blok ve tutkal beyin (kaudal tarafında ve karın kısmı karşı karşıya agar), daha sonra beyin transfer.
7. Odasının soğuk DS ile doldurun. Hız seçici 8-9 ayarlayın.
8. Koku alma ampul itibaren, 200-400 mikron bölümden kesin. Vibraslicer bıçak korteks içeri girdiğinde, 600μm koronal bölümleri kesme başlar. P0 fare beyin kullanılabilir 4-5 dilim verimleri E17-18 fare beyin, genellikle, 3-4 kullanışlı dilim verir.
9. 10 ml cam yeniden süspanse un-takılı ters ucunu kullanarak DS 2 etiketli 35 mm petri beyin dilimleri aktarın.
10. Korteks inceleyin ve kılcal tüpler çıkarılmış cam iğneler kullanarak meninksler kaldırmak.
11. Kortikal kabuklar, 0.5-1 mm uzunluğunda küçük parçalara kesin.
12. Süzülür ES 0.2 mm, 35 mm petri içine 5 cc şırınga bağlı filtre.
13. Kortikal doku parçaları süzülmüş ES içeren petri kabına aktarın.
14. 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.

Bu arada:

1. Davlumbaz, Vibraslicer ve kesme araçları temizleyiniz.
2. 60 mm petri içine sıcak NBM/B27 5 ml ekleyin.

30 dakika sonra. inkübasyon:

1. 10 ml DS doku transferi. 1 dakika dinlendiriniz.
2. Ilk Merhaba tüp swirls doku transferi ve 2-3 dk razı bekleyin.
3. İkinci Hi aktarın. Yukarıdaki gibi tekrarlayın.
4. İlk Li aktarın. Yukarıdaki gibi tekrarlayın.
5. İkinci Li aktarın. Yukarıdaki gibi tekrarlayın.
6. Üçüncü Li aktarın. Yukarıdaki gibi tekrarlayın.
7. Medya ile 60 mm çanak doku transferi.

Diseksiyon mikroskobu altında:

1. Temizlik doku enkaz ve doku hafifçe gevşetmek için çekti damlalıklı cam (delik boyutlarını azaltarak kullanabilirsiniz) geçerek her bir parça çiğnemek.
2. 15 ml konik tüp NBM + B27 dinlenme (- 35 mm yemekleri hafifçe karıştırın ve yerleşmek için büyük doku parçaları için bekleyin 5 için 24 plaka ya da 11 ml, 13 ml toplam olun) içeren hücre süspansiyonu aktarın.
3. Transfer hücre süspansiyonu (24 plaka ya da 2 ml / 35 mm kültür çanak / de 0,5 ml).
4. Cam lamelleri kullanırken, lamel başına 80 ul hücre süspansiyonu ekleyin ve 1 saat içinde doku kültürü inkübatör izin hücreleri NBM/B27 medya ile daha odasına sel önce uyması için.
5. 37 ° C ve% 5 CO ₂ kültürler koruyun.

Sonraki Gün

24 plaka: NBM/B27 orta klimalı 0.5 ml nöronal olmayan hücre ile her iyi besleyin (cNBM/B27 cNBM/B27 orta hazırlanması için protokol altında görüntülenir)

35mm yemekler: cNBM/B27 orta ile 0,5 ml değiştirin.

0.5 ml taze cNBM/B27 2-3 günde bir orta yerine kültür koruyun.

Kültür ortamı glia hücre çoğalması teşvik olmamasına rağmen, kültürler gerekirse glial hücrelerin sayısını azaltmak için kültür günde 3-5 5μM FDU (5-Fluoro-2'-dezoksiuridin, Sigma F0503) ile tedavi edilebilir.

SET -UP Diseksiyon ve Kültür

% 70 EtOH diseksiyon araçları sterilize veya onlara otoklavda:

• Makas (med. küçük) Spatula (med. ve küçük)
• Cımbız (med. ve küçük) jilet
• Blade vibraslicer Tampon banyo için
• Beyin için bıçak Destek için küçük metal kama

Diğer malzemeler:

• Petri kapları (60 mm)
• Petri kapları (35 mm)
• Filtre kağıdı
• Cam pipetlemeyin 10 ml
• Steril tek kullanımlık pipetler, 5,10 ve 25 ml
• Şırınga filtre 0.2 mikron
• Şırınga 5 cc
• Santrifüj tüpleri, 15 ml
• Steril Pasteur cam pipetler
• PDL kaplı kültür kaplarına veya cam lamelleri

Etiket altı 15 ml santrifüj tüplerine ve hazırlık uygulayın:

Tüp # 1: Enzim çözüm:

Içeren 5 ml DS papain (Worthington LS 03.126) 50 U ekleyin:

• L-sistein 100μl (0.8mg)
• 7 ul 0,1 N NaOH
• 50 ul APV (5mM)

Temizlemek için, oda sıcaklığında çözüm bırakın. Bu enzim çözeltisi ilk 'bulutlu' görünür ve kullanmadan önce temizlemek gerekir.

Tüp # 2 # 3: Merhaba Enzim İnhibitörü:

3 ml DS + 300 ul BSA / Ti + 30 ul APV (5mM).

Kabarcıkları önlemek için yavaşça karıştırın, daha sonra iki 1.5ml alikotları bölmek.

Tüp # 4 - # 6: Düşük Enzim İnhibitörü:

8 ml DS + 80 ul BSA / Ti + 80 ul APV (5mM).

Kabarcıkları önlemek için yavaşça karıştırın, üç 2.6 ml alikotları bölmek.

Yeri tüpleri, buz üzerinde # # 6 üzerinden 2 sayılı. Tüp # 1 (Enzim Çözüm) oda sıcaklığında bekletin.

Çözümler VE Alikot

• Çözüm A (Tuzlu Tamponlanmış) Sigma Formula wt 500 ml [kons.]
• Sodyum Klorür NaCl S-9625 58.45 80.0g 137mm
• Potasyum klorid KCl P-4504 74,56 4.0g 5.4mM
• Sodyum Fosfat Dibazik susuz Na ₂ HPO _4, S-0876 142,0 0.24g 0.17mM
• Potasyum Fosfat mono susuz KH ₂ PO ₄ P-5379 136,09 0.3g 0.22mm

400 ml ultra filtre edilmiş su ile çözülür kadar tüm malzemeyi ve karıştırın tartılır. Son hacim 500 ml getirin. , Temiz bir şişe ve otoklav yerleştirin. Mağaza, 4 ° C ve etiket "DS Çözümü".

• Çözüm B (HEPES) Sigma Formula wt 250 ml [kons]
• HEPES HEPES H-3375 283.3 20.97g 9,9

200 ml ultra-filtrelenmiş su ekleyin. Eriyene kadar karıştırın ve son hacim 250 ml getirmek. , Temiz bir şişe ve otoklav yerleştirin. Mağaza, 4 ° C ve etiket "DS Çözüm B".

• Çalışma Çözüm 500 ml kons.]
• Ultra süzülmüş su 400 ml
• Stok çözelti 25 ml
• Stok Çözüm B 14 ml
• D-Glukoz (+) Sigma G-8270 3.0 g 33.3mM
• Sakkaroz Sigma G-0389 7.5 g 43.8 mM

1N NaOH ile pH 7.4 'e ayarlayın. Ultra filtre edilmiş su ile 500 ml son hacim kazandırın. Temiz bir cam şişe ve otoklav içine süzün. 4 ° C saklayınız Etiket, "Diseksiyon Çözüm".

Poly-D-Lizin Hazırlanışı:

1. 1mg/ml steril H ₂ O; 10x stok solüsyonu poli-D-lisin (Sigma P-7280 PDL) hazırlayın.
2. 1.0 ml alikotları olun. Bu çözüm için -20 ° C'de 3 aya kadar saklanabilir.

MEDYA

1. 10ml B-27 Supplement (Gibco 17.504-044), 500 ml NBM şişe (Neurobasal Orta, Gibco 21.103-049).
2. 4 40 ml alikotları ve mağaza olun ° C

APV

1. APV 10 mg flakon 10 ml steril H ₂ O (2-Amino-5-phosphonopentanoic asit, Sigma A-5282) ekleyin ve iyice karıştırın.
2. -20 ° C'de 180 ul alikotları ve mağaza hazırlayın

BSA / Ti

1. 1 g BSA (Bovine Albumin. Sigma A-7030) ve 1 g tripsin inhibitörü (Sigma T-9253) 10 ml DS eritin.
2. 1N NaOH ile pH 7.4 'e ayarlayın.
3. 0.2 mikron şırınga filtresi ile filtreleme ile sterilize edin.
4. -20 ° C'de 400 ul alikotları ve mağaza içine Böl

L-sistein

Eppendorf tüp 200 ul DS 0.6 mg L-Sistein (Sigma C-7755) çözülür.

AGAR (% 4)

1. 100 ml steril su Bacto Agar 4 g (Difco 0140-01) eritin. Kültür için gerekli 4 ° C kadar tutun.
2. Mikrodalga Agar 35 mm petri eritebilir ve doldurun. Soğumasını ve polimerize bekletin.

Papain (Worthington LS 03.126)

Nunc Kültür şişelerde E_TITLE "> nöronal olmayan KÜLTÜRLER

KAPLAMA Kültür ŞİŞE (4 Nunc şişe)

1. 1X PDL yapmak için 3 tüplerin 10X PDL her birine 9 ml steril su ekleyin.
2. İlk şişe 30 ml 1X PDL aktarın.
3. Tüm büyüme yüzeyleri kaplıdır kadar hafifçe hareket ettirin. 1 dakika boyunca bekletin.
4. Ikinci şişe 1x PDL aktarın. 1 dakika boyunca bekletin.
5. Üçüncü ve dördüncü şişe ile tekrarlayın.
6. Durulama 150 ml steril H ₂ O. ile 2X dört şişe

ENZİM ÇÖZÜM (ES) HAZIRLANMANIZI:

1. Kristalleri eriyene kadar 0,6 ml santrifüj tüpüne ağırlığı 0.8 mg L-Sistein (Sigma C7755) dışarı, 150ml DS ve vorteks eklemek.
2. 15 ml konik tüp 5 ml DS aktarın, sonra L-Sistein 150ml ekleyin.
3. 50 ünite Papain ekleyin. (Worthington LS 03.126)
4. 7ml 0.1N NaOH ekleyin.

PREPARE MEM (Gibco # 11.090-081)

1. 65 ml, 500 ml MEM şişeden çıkarın. Glikoz hazırlamak için 10 ml kaydedin.
2. 5 ml Pen / Strep (Gibco # 15.070-063) ekleyin.
3. 10 ml 1M Glikoz (Sigma G-8270) (1.8 g / 10 ml MEM)
4. 50 ml fetal Bovine Serum (Gibco # 16.140-071) veya Sığır Buzağı Serumu (Omega BC-04).
5. Iyice karıştırınız, 4 kısım ve mağaza ° C

NEUROBASAL MEDIUM/B-27 EKİ (NBM/B27)
NBM, 500 ml (Gibco # 21.103-049), B-27 (50X), 10 ml (Gibco # 17.504-044)

1. NBM şişe ve karıştırmak için B-27 flakon tüm içeriği ekleyin.
2. 4 ° C'de kısım ve mağaza

BEYİN DOKU VE DİSEKSİYON

1. Kuru araçları diseksiyon diseksiyon önce% 70 EtOH.
2. 3-15 ml tüp her 10 ml DS aktarın.
3. Fare yavrular (P0-P3) seçin, 4 şişe üç beyinleri gerekecektir.
4. 35 mm petri soğuk DS ekleyin.
5. Fare yavru başını kesmek ve beynini teşrih.
6. Soğuk DS içeren petri içine yerleştirin beyinleri.
7. Doku bir cam pipet geçmesine kadar küçük parçalar halinde doğrayın.

ENZİM AYRILMA

1. Tabak Pasteur pipeti ile mümkün olduğu kadar çok DS kaldırın.
2. 0.2 mikron filtre ve 5cc şırınga ES süzülür.
3. ES doku ile tabak koyun.
4. 37 ° doku inkübe dakika süreyle 30 ° C inkübatör (CO ₂ ücretsiz).

DOKU YIKAMA

1. İlk DS tüp cam pipet ile transfer doku, mümkün olduğunca az ES olarak elde etmek için emin olun.
2. 1500 devirde 30 saniye boyunca santrifüjleyin.
3. Doku ve tekrar işlem iki kez daha aktarın.

Öğütme

1. 50ml santrifüj tüpü içine 38 ml MEM / FBS yerleştirin.
2. Bu petri 35 mm çanak ve transfer dokusu, MEM / FBS 3 ml ekleyin.
3. 1000μl Eppendorf pipetlemeyin ucu ile hafifçe triturating tarafından doku ayrıştırmaları.
4. MEM / FBS içeren tüp 38ml hücre süspansiyonu aktarın ve iyice karıştırın.

KAPLAMA

1. Her şişe eşit miktarda hücre süspansiyonu ve medya kültürü şişeleri dik durun.
2. Her kültürün şişe 90 ml MEM / FBS koyun.
3. Her şişede 10 ml hücre süspansiyonu ekleyin.
4. Etiket: Sigara Nöronal, baş harflerini ve tarih. 37 ° ° C ve% 5 CO ₂ inkübe edin.

BESLEME

1. Gün 3 veya 4, sıcak MEM / FBS (süzün tüm medya ve MEM / FBS 100 ml) ile beslenirler hücreleri,. Kültürler konfluent olmak için 7-10 gün sürebilir.
2. Gün 7-10 NBM/B27 için ortam değiştirin.
3. Ertesi gün, medyanın toplamak. 0.22μm Filter
4. 40 ml hacimde ve MEM / FBS ile kültürü beslemek.
5. Sonraki 2 ya da 3 gün, NBM/B27 ortamı değiştirmek
6. Ertesi gün, toplamak ve işlemi tekrarlayın.
7. Yaklaşık medya toplama tutun. 2 hafta.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluoro-2’-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9625
Vibraslicer	Campden Instruments
Potassim Chloride	Sigma-Aldrich	P4504
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	S0876
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
D (+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044
Neurobasal Media (NBM)	Invitrogen	21103-049
2-Amino-5-phosphonopentanoic acid	Sigma-Aldrich	A5282
Bovine Albumin	Sigma-Aldrich	A7030
Trypsin Inhibitor	Sigma-Aldrich	T9253
Sodium Hydroxide, 1N solution	Fisher Scientific	SS266-1
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7755
Bacto Agar	Difco Laboratories	0140-01
Papain	Worthington Biochemical	LS 03126
Sterile 0.2 μm Syringe Filter	Fisher Scientific	DDA02025S0
Glass Coverslips, No1, 12mm	Bellco Glass	1943-00012
Minimum Essential Media (MEM)	Invitrogen	11090-081	with Earle’s saltswithout L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070-063	for non-neuronal culture
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-071	needed for non-neuronal cultures
Nunclon "Triple Flask" Tissue Culture Bottle	Fisher Scientific	12-565-25	Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing "conditioned Neurobasal Media/B27", but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.
Glass bottom "Imaging dishes"	MatTek Corp.	P35G-1.5-10-C	Glass bottomed, 35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!