Preparación de los cultivos disociados ratón neuronas corticales

Resumen

Este video muestra un procedimiento para la generación de cultivos neuronales a partir de finales de embriones y la corteza temprana de ratón postnatal. Estos cultivos pueden ser utilizados para inmunocitoquímica, la bioquímica, la electrofisiología, calcio y sodio de imagen y proporcionar una plataforma para estudiar el desarrollo neuronal de los animales transgénicos que portan una mutación del gen letal después del parto.

Resumen

Este video lo guiará en el proceso de generación de cultivos de neuronas corticales de embrión tardío y temprano del cerebro del ratón postnatal. Estas culturas se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones, incluyendo la inmunocitoquímica, la bioquímica, la electrofisiología, imágenes de calcio y sodio, proteínas y / o aislamiento de ARN. Estas culturas también proporcionan una plataforma para estudiar el desarrollo neuronal de los animales transgénicos que portan una mutación letal del gen embrionario tardío y postnatal. El procedimiento es relativamente sencillo, requiere de cierta experiencia en la técnica de cultivo de tejidos y no debe tardar más de dos o tres horas si está debidamente preparado. Cuidadosa separación de la corteza cortical del tracto de fibras tálamo-corticales se reducirá el número de embarazos no deseados células no neuronales. Para aumentar la producción de las células neuronales triturar las piezas del tejido cortical suavemente después de la etapa de incubación enzimática. Esto es imprescindible, ya que evita daños innecesarios a las células y la muerte prematura de las células neuronales. Debido a que estos cultivos se mantienen en ausencia de células alimentadoras glía, sino que también ofrecen una ventaja adicional de cultivos en crecimiento enriquecido en las neuronas.

Protocolo

Los preparativos antes del día de cultivo:

• Prepare una solución estéril de disección (DS).
• Prepare NBM/B27 (Mediom Neurobasal con suplementos B27).
• Autoclave _ddH2O y esterilizar coversilps vidrio, si es necesario.
• Escudo platos de cultivo de tejidos o cubreobjetos de vidrio con poli-D-lisina.

Poli-D-lisina de revestimiento:

Preparar el día antes de cultivo en condiciones estériles.

• Descongele alícuota del PDL 10 veces y el lugar en el hielo.
• Añadir 9 ml estéril ultra filtrado de agua a 1 ml de PDL y mezclar bien (1X).
• Cubra las superficies con 1X PDL noche a temperatura ambiente de la siguiente manera:
  • vidrio cubreobjetos (Bellco gato de cristal, Inc. # 1943-00012.): 75 l / cubreobjetos
    O
  • 24 placas de cultivo, así: 300 l / pocillo
    O
  • 35 mm placa de cultivo: 1ml/dish
• Enjuague 5X con agua estéril (uso de pipetas Pasteur estéril para aspirar el contenido).
• Eliminar el agua hasta que la superficie esté completamente seca.

Procedimiento de cultivo (que se hace en campana de flujo laminar bajo condiciones estériles)

1. Recorte bloque de agar y péguelo en el bloque de apoyo de la Vibraslicer microtomo (Campden Instruments Ltd.) con pegamento.
2. Cuando se utiliza última etapa embrionaria (E17-18) fetos de ratones, presa de la eutanasia, sin extraer el útero y los fetos individuales de saco embrionario. Fetos lugar en placa de Petri estéril y continuar como se indica a continuación.
3. Decapitar feto de ratón o crías (las directrices aprobadas por seguir a su animal de Atención Institucional y el empleo).
4. Quite la piel y el cráneo y el cerebro el lugar en el disco un papel filtro Whatman en una placa de Petri de 60 mm DS llena de frío.
5. Cortar el cerebelo con una hoja de afeitar estéril.
6. Recoger el cerebro con una espátula y drenar el líquido en exceso en un papel de filtro, a continuación, transferir el cerebro para bloquear el apoyo Vibraslicer y el cerebro de pegamento en el lugar (lado caudal y parte ventral hacia agar).
7. Llene la cámara de frío con síndrome de Down. Selector de velocidad a 8-9.
8. Corte secciones 200-400 micras, a partir de bulbo olfatorio. Una vez que la hoja de la Vibraslicer entra en la corteza, empezar a cortar 600μm secciones coronal. Un cerebro de ratón E17-18 por lo general los rendimientos de 3-4 rebanadas utilizable, mientras que un cerebro de ratón P0 rendimientos 4-5 rebanadas utilizable.
9. Transferencia de las secciones de cerebro de 35 mm placa de Petri marcada DS 2 con punta opuesta de la ONU conectado 10 ml de vidrio con pipeta Pasteur.
10. Diseccionar la corteza y eliminar el uso de agujas de vidrio meninges extraídos de los tubos capilares.
11. Cortar las cortezas corticales en trozos pequeños, 0.5-1 mm de largo.
12. ES filtro a través del filtro de 0,2 micras unida a una jeringa de 5 cc en un 35 mm placa de Petri.
13. Transferencia de las piezas de tejido cortical de placa de Petri que contiene ES filtrada.
14. Se incuba a 37 ° C durante 30 min.

Mientras tanto:

1. Limpieza de campana, Vibraslicer y herramientas de disección.
2. Añadir 5 ml de agua tibia NBM/B27 en un 60 mm placa de Petri.

Después de 30 min. incubación:

1. La transferencia de tejido a 10 ml DS. Dejar reposar durante 1 minuto.
2. La transferencia de tejido al primer remolinos tubo de alta y dejar reposar durante 2-3 min.
3. Hola traslado al segundo. Repita lo anterior.
4. Traslado a la primera Li. Repita lo anterior.
5. Traslado a la segunda batería. Repita lo anterior.
6. Transferencia a terceros Li. Repita lo anterior.
7. La transferencia de tejido para el plato de 60 mm con los medios de comunicación.

Bajo el microscopio de disección:

1. Limpie los residuos de los tejidos y triturar cada pieza con cuidado que pasa a través de una pipeta de vidrio tirado (uso de disminuir el tamaño de diámetro) para aflojar el tejido.
2. Transferencia de suspensión de células a un tubo cónico de 15 ml que contiene el resto de NBM + B27 (hacen un total de 13 ml para una placa de 24 ml o bien 11 para 5 -. Placas de 35 mm Mezclar suavemente y esperar a que grandes pedazos de tejido para resolver).
3. Transferencia de suspensión de células (0,5 ml / pocillo de una placa de 24 pocillos o 2 ml / placa de cultivo de 35 mm).
4. Cuando se utiliza cubreobjetos de vidrio, añadir 80 l de suspensión celular por cubreobjetos y dejar una hora en el cultivo de tejidos incubadora para que las células se adhieran antes de la inundación de la cámara con más NBM/B27 los medios de comunicación.
5. Mantener los cultivos a 37 ° C y 5% CO _2.

Día Siguiente

24 y placa: Feed cada pocillo con 0,5 ml de células no neuronales acondicionado NBM/B27 medio (cNBM/B27; Protocolo para la preparación de cNBM/B27 medio aparece a continuación)

Platos de 35 mm: Vuelva a colocar 0,5 ml con cNBM/B27 medio.

Mantener la cultura mediante la sustitución de 0,5 ml de medio fresco con cNBM/B27 cada 2-3 días.

Aunque los medios de cultivo no promueve la proliferación de células gliales, las culturas pueden ser tratados con 5μM FDU (5-fluoro-2'-desoxiuridina, Sigma F0503) en el día 03/05 en la cultura de reducir aún más el número de células gliales, si es necesario.

JUEGO -UP para la disección y la Cultura

Esterilizar las herramientas de disección en el 70% EtOH o autoclave ellos:

• Tijeras (empresas medianas y pequeñas) Espátulas (empresas medianas y pequeñas)
• Pinzas (empresas medianas y pequeñas) Razor blade
• Hoja de baño Buffer vibraslicer
• Pequeña cuña de metal de hoja de soporte para el cerebro

Otros materiales:

• Placas de Petri (60 mm)
• Placas de Petri (35 mm)
• Papel de filtro
• Pipeta de vidrio de 10 ml
• Pipetas desechables estériles, 5,10 y 25 ml
• Filtro de jeringa de 0,2 micras
• Jeringa de 5 cc
• Tubos de centrifugación de 15 ml
• Pasteur de vidrio estéril pipetas
• PDL placas de cultivo recubiertos o cubreobjetos de vidrio

Etiqueta seis tubos de 15 ml centrífuga y seguir la preparación:

Tubo # 1: La solución de la enzima:

Añadir 50 U de la papaína (Worthington LS 03126) a 5 ml contiene DS:

• 100μl de la L-cisteína (0,8 mg)
• 7 l de NaOH 0,1 N
• 50 l APV (5 mM)

Deje la solución a temperatura ambiente para despejar. Tenga en cuenta que la solución de la enzima aparecerá "nublado" en un primer momento y las necesidades para eliminar antes de su uso.

Tubo # 2 y # 3: Inhibidor de la Enzima de alta:

3 ml DS + 300 l BSA / Ti + 30 l APV (5 mm).

Mezclar con cuidado para evitar las burbujas, y se divide en dos alícuotas de 1,5 ml.

Tubo # 4 - # 6: inhibidor de la enzima de baja:

8 ml DS + 80 l de BSA / Ti + 80 l APV (5 mm).

Mezclar con cuidado para evitar las burbujas, se divide en tres alícuotas de 2,6 ml.

Se colocan los tubos numerados # 2 al # 6 en el hielo. Deja el tubo # 1 (solución enzimática) a temperatura ambiente.

SOLUCIONES y las alícuotas

• Solución A (solución salina tamponada) Sigma Fórmula peso 500 ml [conc.]
• Cloruro de sodio NaCl S-9625 58.45 80.0g 137mm
• Cloruro de Potasio KCl P-4504 74,56 4,0 g 5.4mm
• Fosfato de sodio dibásico anhidro Na ₂ HPO ₄ S-0876 142,0 0,24 g 0,17 mm
• Fosfato de potasio monobásico anhidro KH ₂ PO ₄ P-5379 136,09 0,3 g 0.22mm

Pesar todos los ingredientes y mezcle hasta que se disuelven con 400 ml de agua ultra filtrada. Alcanzar un volumen final de 500 ml. Coloque en un frasco limpio y autoclave. Almacenar a 4 ° C y la etiqueta de "Solución DS A".

• Solución B (Hepes) Sigma Fórmula peso 250 ml [conc.]
• Hepes Hepes H-3375 283,3 9,9 20.97g

Añadir agua ultrafiltrada hasta 200 ml. Mezclar hasta que se disuelva y llevar el volumen final de 250 ml. Coloque en un frasco limpio y autoclave. Almacenar a 4 ° C y la etiqueta de "DS solución B".

• Solución de trabajo de 500 ml [conc.]
• De agua ultra filtrada 400 ml
• Una solución de archivo de 25 ml
• Solución madre B 14 ml
• D (+)-glucosa Sigma G-8270 3,0 g 33.3mM
• Sacarosa Sigma S-0389 7,5 g 43,8 mM

Ajustar el pH a 7.4 con NaOH 1N. Alcanzar un volumen final de 500 ml con agua ultra filtrada. Decantar en un frasco de vidrio limpio y autoclave. Almacenar a 4 ° C. Etiqueta de "Solución de disección".

Poli-D-lisina de preparación:

1. Preparar la solución 10X de poly-D-lisina (PDL; Sigma P-7280) en H ₂ O estéril a 1mg/ml.
2. Hacer 1,0 ml alícuotas. Esta solución puede conservarse a -20 ° C hasta por 3 meses.

MEDIA

1. Añadir 10 ml de B-27 Suplemento (Gibco 17504-044) a 500 ml botella de NBM (Medium Neurobasal, Gibco 21103-049).
2. Hacer alícuotas de 40 ml y almacenar a 4 ° C.

APV

1. Agregar 10 ml _de H2O estéril al vial de 10 mg de APV (2-amino-5-phosphonopentanoic ácido, Sigma A-5282) y mezclar bien.
2. Preparar 180 alícuotas y almacenar a -20 ° C.

BSA / Ti

1. Disolver 1 g de BSA (albúmina bovina. Sigma A-7030) y 1 g de inhibidor de tripsina (Sigma T-9253) en 10 ml DS.
2. Ajustar el pH a 7.4 con NaOH 1N.
3. Esterilizar por filtración a través de filtro de 0,2 micras jeringa.
4. Se dividen en 400 alícuotas y almacenar a -20 ° C.

L-cisteína

En un tubo Eppendorf se disuelven 0,6 mg L-cisteína (Sigma C-7755) en 200 l DS.

AGAR (4%)

1. Disolver 4 g de agar Bacto (Difco 0140-01) en 100 ml de agua estéril. Mantener a 4 ° C hasta que sea necesario para la cultura.
2. Agar microondas para derretir y llenar una caja de Petri de 35 mm. Deje reposar para enfriar y polimerizar.

Papaína (Worthington LS 03126)

e_title "> no neuronales CULTURAS EN BOTELLAS DE CULTURA NUNC

RECUBRIMIENTO frasco de cultivo (4 botellas Nunc)

1. Añadir 9 ml de agua estéril para cada uno de 3 tubos de 10 veces para hacer PDL PDL 1X.
2. Transferencia de 30 ml 1X PDL en la primera botella.
3. Mover ligeramente hasta que todas las superficies están cubiertas de crecimiento. Deje reposar durante 1 minuto.
4. Transferencia 1x PDL a la segunda botella. Deje reposar durante 1 minuto.
5. Repita lo mismo con las botellas de tercera y cuarta.
6. Enjuague todas las cuatro botellas de 150 ml con 2X estéril H ₂ O.

Prepare la solución de enzima (ES):

1. En un peso del tubo 0,6 ml de centrífuga de 0.8 mg L-cisteína (Sigma C7755), añadir DS 150 ml y agitar hasta que los cristales se disuelven.
2. Transferir 5 ml DS a un tubo cónico de 15 ml y añadir 150 ml de L-cisteína.
3. Añadir 50 unidades de papaína. (Worthington LS 03126)
4. Añadir 7 ml NaOH 0,1 N.

PREPARE MEM (GIBCO 11090-081 #)

1. Quitar 65 ml de la botella de 500 ml del MEM. Ahorre 10 ml para preparar la glucosa.
2. Añadir 5 ml de penicilina / estreptomicina (Gibco # 15070-063).
3. Agregar 10 ml de glucosa 1M (Sigma G-8270) (1,8 g / 10 ml MEM)
4. Añadir 50 ml de suero fetal bovino (Gibco # 16140-071) o bovina de suero de ternera (Omega BC-04).
5. Mezclar bien, alícuota y almacenar a 4 ° C.

Neurobasal SUPLEMENTO MEDIUM/B-27 (NBM/B27)
NBM, 500 ml (Gibco # 21103-049), B-27 (50 veces), 10 ml (Gibco # 17504-044)

1. Añadir todo el contenido de B-27 vial a la botella de NBM y mezclar.
2. Alícuota y se almacenan a 4 ° C.

DISECCIÓN de tejido cerebral

1. Seco disección herramientas de EtOH al 70% antes de la disección.
2. Transferir 10 ml DS en cada una de tubo de 3.15 ml.
3. Seleccione crías de ratón (P0 - P3), se necesitan tres cerebros para 4 botellas.
4. Añadir DS fría a 35 mm placa de Petri.
5. Decapitar cría de ratón y diseccionar el cerebro.
6. Lugar en los cerebros de la placa de Petri que contiene DS frío.
7. Picar en trozos de tejido, lo suficientemente pequeño para pasar a través de una pipeta de vidrio.

ENZIMA DISOCIACIÓN

1. Eliminar la mayor DS tanto como sea posible de la antena con una pipeta Pasteur.
2. ES filtro a través de una jeringa de 0,2 micras y filtro de 5 cc.
3. ES lugar en el plato con el tejido.
4. Incubar el tejido a 37 ° C incubadora (CO ₂ libre) durante 30 minutos.

LAVADO DE TEJIDO

1. La transferencia de tejido con una pipeta de vidrio para el primer tubo de DS, el asegurarse de obtener como ES posible.
2. Centrifugar durante 30 segundos a 1500 rpm.
3. Transferencia de tejidos y repetir el procedimiento dos veces más.

TRITURACIÓN

1. Coloque 38 ml de MEM / FBS en un tubo de centrífuga de 50 ml
2. Añadir 3 ml de MEM / FBS a un plato de 35 mm y transferencia de tejido a esta placa de Petri.
3. Disociar el tejido de él con cuidado triturar a través de una punta de la pipeta eppendorf 1000μl.
4. Transferencia de suspensión de células en el tubo que contiene 38 ml de MEM / FBS y mezclar bien.

CHAPA

1. Coloque la botella en posición vertical para obtener la cultura cantidades iguales de la suspensión celular y los medios de comunicación en cada botella.
2. Poner 90 ml de MEM / FBS en cada frasco de cultivo.
3. Agregar 10 ml de suspensión celular en cada botella.
4. Etiqueta: no neuronales, las iniciales y la fecha. Se incuba a 37 ° C y 5% CO _2.

ALIMENTACIÓN

1. El día 3 o 4, alimentación de las celdas con agua tibia MEM / FBS (decantar todos los medios de comunicación y reemplazarlo con 100 ml de MEM / FBS). Los cultivos pueden tardar 7-10 días para confluir.
2. En el Día de 10.7 cambiar los medios de comunicación para NBM/B27.
3. Al día siguiente, recoger los medios de comunicación. Filtro con 0.22μm
4. Hacer alícuotas de 40 ml y se alimentan con la cultura MEM / FBS.
5. Próximos 2 o 3 días, los medios de comunicación para el cambio NBM/B27
6. Al día siguiente, recoger y repetir el procedimiento.
7. Seguir recogiendo los medios de comunicación durante aprox. 2 semanas.

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluoro-2’-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9625
Vibraslicer	Campden Instruments
Potassim Chloride	Sigma-Aldrich	P4504
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	S0876
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
D (+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044
Neurobasal Media (NBM)	Invitrogen	21103-049
2-Amino-5-phosphonopentanoic acid	Sigma-Aldrich	A5282
Bovine Albumin	Sigma-Aldrich	A7030
Trypsin Inhibitor	Sigma-Aldrich	T9253
Sodium Hydroxide, 1N solution	Fisher Scientific	SS266-1
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7755
Bacto Agar	Difco Laboratories	0140-01
Papain	Worthington Biochemical	LS 03126
Sterile 0.2 μm Syringe Filter	Fisher Scientific	DDA02025S0
Glass Coverslips, No1, 12mm	Bellco Glass	1943-00012
Minimum Essential Media (MEM)	Invitrogen	11090-081	with Earle’s saltswithout L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070-063	for non-neuronal culture
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-071	needed for non-neuronal cultures
Nunclon "Triple Flask" Tissue Culture Bottle	Fisher Scientific	12-565-25	Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing "conditioned Neurobasal Media/B27", but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.
Glass bottom "Imaging dishes"	MatTek Corp.	P35G-1.5-10-C	Glass bottomed, 35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!