JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Kirpikler geliştirme için uygun organogenesis hayati önem taşımaktadır. Bu iletişim kuralı etiket ve Zebra balığı siliyer hücreleri görselleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemini açıklar.

Özet

Son yıllarda, Zebra balığı embriyo rahim embriyo gelişimi ve optik şeffaflık gibi özellikleri nedeniyle gelişim biyolojisi eğitim için popüler bir model olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, Zebra balığı embriyo omurgalı böbrek organogenesis yanı sıra multiciliated hücre (mm) gelişimini incelemek için önemli bir organizma haline gelmiştir. Embriyonik Zebra balığı böbrek MCCs görselleştirmek için bütün Dağı Floresan situ hibridizasyon (balık) kombine bir protokol geliştirdik ve tüm yüksek kararlılık düşsel sağlayan ayirt (Eğer) mount. Bu el yazması RNA transkript ve protein birlikte gelişim programları aracılığıyla çeşitli soy faktörleri ifade Yönetmeliği daha iyi anlamak için bir araç olarak yerelleştirme için bizim teknik anlatılmaktadır.

Giriş

Son birkaç on yıl içinde Zebra balığı (Danio rerio) gelişim biyolojisi çalışmak için ana model organizma ortaya çıkmıştır. Embriyoların anne dışında geliştirmek ve optik saydamdır. Ayrıca, göz, böbrek ve ön gibi hayati organların oluşumunu hızla, sadece 24 saat sonrası döllenme tarafından (hpf) oluşan yapılar ile oluşur. Önemlisi, Zebra balığı genom son derece memeliler1,2,3ile korunmuş. Ayrıca, Zebra balığı ve memeli organları benzer anatomisi ve fizyolojisi olması. Zebra balığı embriyonik böbrek veya pronephros, erken nephrogenesis ve korunmuş epitel hücre popülasyonlarının omurgalı nefron4, kader tayini sırasında gen fonksiyon incelenmesi için modeli sistem değerini gösterir 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. benzer şekilde, Zebra balığı embriyo MCCs11,12,13,14,15, ontogeny incelerken giderek daha önemli hale gelmiştir 16 , 17.

Onların adından da anlaşılacağı gibi MCCs epitel hücrelerinin apikal yüzey17tarihinde yer alan hareketli kirpikler bir bohça ile karakterize vardır. Zebra balığı, MCCs sıvı akışı çalışması ve 24 hpf11,12,13,14tarafından, pronephros her nefron yarısı boyunca moda gibi bir "salt-and-pepper" içinde dağınık 15 , 16 , 17. her ne kadar onlar sadece bir avuç dikkat edilmiştir insan böbrek hastalığı18,19,20,21durumlarda, MCCs yaygın beyin gibi memeli diğer dokularda ve deneysel tasarım zorluklar bir dizi pozlar Trakea22,23,24. Zarif Zebra balığı da dahil olmak üzere çeşitli omurgalı modelleri çalışmalarda mm kaderin korunmuş bir patika yol mm geliştirme12,17,25 bir inhibitörü olarak sinyal çentik ile göstermiştir ,26,27. Bu nedenle, Zebra balığı pronephros mm geliştirme vivo içinde11,12,13,14, genetik mekanizmaları incelemek için kolayca erişilebilir modeli sağlar 15 , 16 , 17.

Şeffaflık ve genetik manipülasyon kolay: Zebra balığı embriyoların hücre kaderi, doku büyüme ve gelişme erken embriyo1,2 düzenleyen genetik ve moleküler yolları okurken çok değerli özellikleri olduğu kanıtlanmıştır ,3. Situ hibridizasyon ve bütün Dağı Eğer gibi protein ve gen transkript görselleştirmek, edilmiş uygulanan ve Zebra balığı16,28,29içinen iyi duruma getirilmiş için böyle, geleneksel teknikleri, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. Balık ve eğer için popüler iletişim kuralları birleştirerek, etiket ve MM'ler vivo16,28,37,38analiz etmek mümkündür.

Protokol

Aşağıdaki iletişim kuralı muhafaza ve Merkezi tarafından Zebra balığı araştırma Üniversitesi Notre Dame, bakım Zebra balığı yetişkin kullanır. Zebra balığı yetişkin ve embriyo ile çalışmak için tüm yöntemleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.

1. embriyo fiksasyon

  1. Önceden açıklanan yöntemleri39,40kullanarak Zebra balığı embriyo toplamak. 24 hpf, non-spesifik proteaz karışım çözüm (50 mg/mL) bir embriyo E3 500 µL bulaşık Incubate oda sıcaklığında (RT) ekleyin.
  2. Embriyo koryon patlak başladığınızda, tüm sıvı embriyo çanak kaldırın.
  3. Embriyo 2 - 3 kez ile taze E3 E3 yaklaşık 20 mL ekleyerek, yavaşça dönen E3 tabakta ve akışkan bir sıvı atık kabın decanting yıkayın.
  4. Embriyo düzeltmeden önce ötenazi için E3% 0,2 tricaine 2 mL ekleyin.
  5. Embriyo bir plastik Pasteur pipet kullanarak 5 mL cam şişe aktarın. Embriyo şişeyi altına yerleşmiş sonra pipet kullanarak tricaine/E3 çözüm çoğunu kaldırın.
  6. 24 hpf embriyo ajitasyon olmadan RT, 2-4 h %4 paraformaldehyde (PFA) ile 5 mL fix.
    Dikkat: PFA toksik ve araştırmacı göz koruması, eldiven ve önlük giyiyor iken İngiltere'de yılın çözümleri kimyasal bir başlık altında ele alınmalıdır. Olarak toz PFA statik yük dağıtmak eğilimi PFA sabitleştirici toz PFA toz üzerinden hazırlanması olağanüstü dikkatle yapılmalıdır.
    Not: PFA gecede 4 ° C'de % 4 embriyo düzeltebilirsiniz %4 hazırlamak toz PFA tamamen erimesi için çözüm sürekli karıştırarak 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) kaynatın x Isıtma tarafından İngiltere'de yılın. Çözüm geri RT, 4 İngiltere'de yılın 0,45 µm tek kullanımlık sistem vakum filtrasyonu için buradan geçen sterilize filtre % aşağı soğuduktan sonra sonra ve 15 mL veya 50 mL bölümleri için depolama-20 ° C'de içine bölünmemeli
  7. 4 kaldırmak % PFA ve yıkama embriyo ile iki kez 1 X fosfat tamponlu ara-20 (PBST), dik yıkama embriyo 5 mL % 100 metanol (MeOH) de hemen ile RT. eklemek 5 mL taze % 100 % 0,1 ile serum fizyolojik MeOH embriyo için ve en az 20 dakika-20 ° C'de kuluçkaya.
    Not: Embriyo % 100 saklanabilir-20 ° c kadar embriyo hazırlık için hazır MeOH.

2. embriyo hazırlık ve hibridizasyon

  1. Embriyo 5 mL % 50 de içinde bir kez yıkama tarafından suyla temasa MeOH 1 x PBST embriyo 5 mL % 30 yıkama tarafından RT. devam rehidratasyon, 5 min için MeOH 1 x PBST dik, 5 min için yıkama embriyo 5 mL 1 x PBST 5 dk her için iki kez RT.
  2. Embriyo 5 mL lik 1:1,000 İndinavir K (pK) (10 mg/mL) kuluçka tarafından 1'permeabilize x PBST 2 dk RT. az için
    Not: Yukarıda 5 mg/mL ve kuluçka konsantrasyon zaman ancak az 2 dk pK konsantrasyon 2 dk embriyo 24 genç için önerilen daha uzun büyük embriyo inkübe hpf.
  3. PK çözüm ve yıkama hemen içinde 5 mL 1 x PBST dik, iki kez 5 mL % 4 embriyo düzeltmek de kaldırmak PFA RT için en az 20 dk at.
    Not: PFA gecede 4 ° C'de % 4 embriyo düzeltebilirsiniz
  4. İngiltere'de yılın ve yıkama iki kez içinde 5 mL 1 de kaldırmak x PBST, RT.
  5. 5 mL 1 de embriyo transferi x PBST düz dipli microcentrifuge tüpler içine yerleştirilen dik RT her embriyo ve sonraki hibridizasyon çözüm arasındaki etkileşimler kolaylaştırmak için bir microcentrifuge raf içine.
  6. İki kez 1.5 mL hibridizasyon çözeltisi (Hyb +) embriyo RT. eklemek 1.5 mL taze Hyb + yıkama ve embriyo 70 ° c 4-6 h hibridizasyon fırında kuluçkaya.
  7. Hyb + 1,5 mL sonda çözüm hacmi ile değiştirin (10 µL RNA sonda/500 µL Hyb +) embriyo tam olarak karşılamak yeterli.
    Not: Antisens RNA sonda kullanarak önceden açıklanan yöntemleri39sentez.
  8. 70 ° C'de hibridizasyon fırında gecede sonda ile konumlandırılmış bireysel tüpler dik microcentrifuge rafa sallayarak olmadan melezlemek.

3. sıcak yıkama ve engelleme

Not: Uygun bir çözüm üzerinde embriyo koyarak ve 70 ° C'de hibridizasyon fırında kuluçka sıcak yıkama yapılmaktadır 70 ° C'de yıkama çözümler tutmak için hibridizasyon fırında 50 mL tüpler her çözümün koyun zaman sonda / Hyb + karışımı eklenir.

  1. Sonda kaldırın. İki kez 70 ° C'de % 50 formamide/2 20-30 dk için serum sodyum sitrat (SSC) arabellek x 1,5 ml embriyo yıkayın.
    Not: Sonda Hyb +-20 ° C'de depolanan ve daha sonraki bir tarihte yeniden kullanılır.
  2. Embriyo bir kez 70 ° C 2 1.5 ml yıkayın. x SSC 15 dakika süreyle iki kez 70 ° C'de 0.2 X SSC için 20-30 dk her 1,5 ml embriyo yıkayın. Değiştir 0,2 x SSC ile 1,5 mL engelleme reaktif ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya
    Not: RT, engelleme reaktif bir gecede yerine 4 h için kuluçkaya mümkündür.

4. antikor kuluçka ve Maleik asit arabellek yıkar

Not: embriyo ortam ışığı korumalı tutun.

  1. Anti-DIG-HAZNESİNDEKİ engelleme reaktif 1:1,000 oranında, 0.2 mL engelleme reaktif yerine ve folyo veya başka bir ışık engelleme kapak RT. adlı altında 3 h için kuluçkaya
    Not: Alternatif olarak, antikor gecede 4 ° C'de kuluçkaya
  2. 3 saat sonra embriyo Maleik asit tampon 2 - 4 kez için 10-15 dk her RT. 1,5 ml taze Maleik asit arabellek 4 ° C'de embriyo gecede Incubate az 1,5 mL yıkayın.
    Not: Bu gecede Maleik asit arabellekte kuluçkaya gerekli değildir, ancak yapıyor çok soruşturma arka plan azaltır.

5. sonda algılama ve kaldırma-in peroksidaz

Not: embriyo ortam ışığı korumalı tutun.

  1. Maleik asit arabellek kaldırın ve 1,5 mL 1 x PBS ile değiştirin. Embriyo iki kez 1.5 mL 1 x PBS 5 min için her dik Incubate embriyo 0.2 ml, Cy3, Floresan, RT. 60 dk için çözüm boyama yıkayın
    Not: Farklı probları için kuluçka süresi değişebilir.
  2. Embriyo bir kez ile aşağıdaki yüzde MeOH 1,5 mL 1 X PBS RT, 10 min için yıkayın: % 30 MeOH, %50 MeOH %75 MeOH ve % 100 MeOH.
  3. Dik Yıkama 30 dk için % 1 H2O2 MeOH 1,5 mL ile embriyo embriyo 1,5 mL 1 x PBS RT, 10 min için aşağıdaki MeOH çözümleri ile bir kez kuluçkaya: %75 MeOH, %50 MeOH ve % 30 MeOH. İki kez 5 min için embriyo RT 1,5 mL 1 x PBS yıkayın.
    Not: Embriyo PBS içinde gecede 4 ° C'de saklanabilir

6. ayirt

Not: embriyo ortam ışığı korumalı tutun.

  1. RT. yıkamada embriyo 1.5'bir kez embriyoların bir kez GKD2O 5 min için 1,5 mL 7 dk RT. az yıkamak için embriyo GKD2O 5 min için 1,5 ml önceden soğutulmuş aseton (-20 ° C'de muhafaza) 1,5 ml embriyo RT. yıkamada yıkama 1 mL x PBST RT, 5 min için % 1 DMSO (PBDT) ile
  2. Embriyo PBDT + % 10 fetal sığır serum (FBS) 1,5 ml 2 h için RT, bir rocker üzerinde kuluçkaya.
  3. Kaldır PBDT + FBS ve birincil antikorlar, anti acetylated tübülin (fare üretilen) ve anti-γ-(tavşan üretilen), birlikte 1: 400 PBDT + % 1, seyreltilmiş tübülin 1,5 mL yerine FBS. Gecede 4 ° C'de embriyo kuluçkaya
    Not: Kuluçka kez birincil antikor bağlı olarak değişebilir. Farklı zaman aralıkları ile test etiketleme en iyi duruma getirmek için gerekli olabilir.

7. ikincil antikor

Not: embriyo ortam ışığı korumalı tutun.

  1. PBDT + %1 1,5 mL fazla ilişkisiz antikor embriyo kaldırmak için FBS + 0.1 M NaCl bir rocker üzerinde RT, 1 dk. için yıkayın.
  2. Embriyo yıkama PBDT + %1 1,5 mL 5 kere FBS + 0.1 M NaCl RT. adlı bir rocker üzerinde her 30 dk için embriyo 1.5 mL PBDT + %1 yıkama FBS RT, bir rock'çı üzerinde 30 dk için.
  3. Gecede 4 ° C'de ikincil antikorların 200 µL içinde embriyo kuluçkaya birlikte 1:500 PBDT içinde seyreltilmiş Alexa 488 keçi Anti-fare IgG ve Alexa 647 keçi Anti-tavşan IgG,.

8. DAPI boyama

Not: embriyo ortam ışığı korumalı tutun.

  1. Embriyo hızlı bir şekilde iki kez 1.5 mL PBDT RT yıkayın. PBDT DAPI 1,5 mL ile değiştirin, seyreltilmiş 1 X PBST 1:15000 ve RT, 15 dk bir rocker üzerinde kuluçkaya.
  2. Embriyo 1.5 mL PDBT + %1 yıkama FBS + 0,1 M NaCl üç kez RT 15-20 dk her. Mount ve görüntü için hazır kadar embriyo PBDT 1,5 mL 4 ° C'de depolayın.

9. montaj ve Zebra balığı Pronephros için görüntüleme

  1. Küçük hacimli, PBDT, yaklaşık 10 µL cam slayt üzerinde yatıyordu embriyo lateral.
  2. Embriyo gözlerinin arkasında iyi forseps baş kaldırmak için bir çift ve bazı sarısı topu ile sıkmak.
  3. İyi forseps yavaşça uzakta kalan sarısı topu embriyo vücuttan kazımak için kullanın. Disosiye sarısı ve sıvı ilave ince bir doku ile slayt kaldırın.
  4. Embriyo kalan kuyruğunun medyaya montaj bir damla ekleyin ve kuyruk yanal koydu şekilde yerleştirin. Bir coverslip kuyruk örnek Düzleştir'i, sonra kapalı slayt kutusunda yer için üstüne yerleştirin.
  5. Görüntü aşağıdaki kanallar kullanarak confocal mikroskop üzerinde 60 X büyütme, böbrek kirpikler: DAPI mavi (lazer 408.0 set nm), yeşil FITC (lazer 488.0 set nm), Cy3 boya kırmızı etiketli (lazer 561.0 set nm) ve Alexa 680 beyaz (lazer 637.0 set nm).

Sonuçlar

Vahşi-türü Zebra balığı embriyo 24, sabit hpf ve hemen yukarıda açıklandığı gibi hazır. Şekil 1 seçili resimli aşamaları birlikte deneysel bir iş akışı gösterilmektedir. 1-8 adımda belirtilen iş akışı örnek ihale, fiksasyon ve antianlamlı riboprobes ayirt tarafından takip için etiket protein(s) ilgi ile endojen transkript etiketlemek için sabit doku manipülasyonu süreçleri kapsar. Adım 9 iş akışında montaj ve görselleştirme Zebra balığı embriyonik gövde en iyi duruma getirmek için özel olarak tasarlanmış teknikleri görüntüleme anlamına gelir. Adım 9 eşlik çizimlerde doku bir cam slayt üzerinde konumlandırma için düzenleme yöntemi göstermektedir. Bu adımda, embriyo baş ve sarısı top kaldırıldı, yanal bir cam slayt ve coverslip arasında konumlandırılmış olması için kuyruk bırakarak. Sarısı topu otomatik fluoresces ve montaj işlemi engelleyen kaldırma sarısı topu ve kafa pronephros ikamet mm nüfusun en iyi görüntüleme için önerilmektedir.

Confocal mikroskop kullanılarak elde temsili resimleri 60 X büyütme, aynı vahşi tipi embriyo ve dijital zoom aynı büyütmede gösteren Şekil 2, sağlanır. Alt iki panel kompozit kaplama bu görüntüleme veri iken üst paneller, tek tek her kanal görüntüleri sağlar. Beyaz kutu (sol sütun görüntüde) dijital zoom (sağ sütun görüntü) odak alan özetliyor. Dijital zoom final Masası'nda vurgulanan, çekirdeği içinde DAPI etiketli ve MM'ler burada γ-tübülin antikorlar Bazal organları göstermek ve α-tübülin kirpikler gösterir odf3b, tanımak için tasarlanmış bir antianlamlı riboprobe üzerinde dayalı tespit edildi. Kompozit kaplama dijital yakınlaştırma sarı çizgili daire odf3b Tutanaklar, birden fazla Bazal organları ve kirpikler sahibi nedeniyle tespit edildi bir mm tarafını gösterir. Sarı noktalı daireyle etiketli bitişik mono siliyer hücreyi tek bir Bazal vücut ve tek bir cilium sahip fenotip üzerinde dayalı tespit edilmiştir.

figure-results-2135
Şekil 1: deneysel akış çizelgesinin şematik. Bu deneysel bir iş akışı akış gösterir eşlik tarafından kritik etap kar tanesi soğuk kuluçka gösterir çizimler, üç eğik çizgiler ısı temsil ve uzun bir kuluçka kez saat temsil eder. Bazı adımlar iletişim kuralında belirtildiği gibi daha uzun süreler içinde gerçekleştirilebilir olsa iş akışını en az (sağ üst köşesinde gün sayısını işleminin her aşamasında görmek) 6 gün içinde gerçekleştirilebilir. Montaj işlemi ayrıntılı bir tasviri, cam slayt ve coverslip arasındaki son takılı embriyo kuyruk gösteren çizilir. Siyah bir Kesikli kutu 60 X büyütme oranında görüntüsü alan özetliyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-3095
Şekil 2: temsilcisi sonuçları Zebra balığı pronephros MCCs görüntülenmesi için. Maksimum görüntü projeksiyonları 24 hpf vahşi tipi Zebra balığı embriyo 60 X büyütme yanı sıra confocal, 60 X büyütme aynı embriyo üzerinde dijital zoom. Beyaz kutuları için yakınlaştırma odaklı alanını gösterir. Bireysel lekeleri DAPI (çekirdek), odf3b (MCCs), γ-tübülin (Bazal organları) ve α-tübülin (kirpikler) etiketli ve alttaki iki panellerinde birlikte birleştirilmiş. Dijital zoom, biz aşağıdaki gibi yaklaşımları, hücre konumları sağlar: bir mm Kesikli sarı daire tarafından özetlenen ve noktalı sarı daire mono siliyer bir hücre özetler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Yukarıda ayrıntılı iletişim kuralı pronephros odf3b transkriptler ve α-tübülin içinde 24 hpf Zebra balığı embriyo ile MCCs etiketleme için optimize edilmiştir. En iyi sonuçlar için bu taze sabit ve hazırlanmış embriyo kullanmak için tavsiye edilir. Ama istenmeyen arka plan boyama ile embriyo depolama biriminde tutulur zaman artar olasılığı sabit ve ya MeOH veya Hyb + bir haftadan uzun-20 ° C'de saklanan embriyolar kullanılabilir.

Değişiklikler ve bu tekniğin sorun giderme bu yöntem diğer suites özel işaretleri, örneğin diğer antianlamlı riboprobes ve diğer antikorları için terzi gereklidir. Bütün Dağı in situ hibridizasyon sürecinde adımları parametrelerini ayarlamak için pek çok yöntem olmuştur daha önce31,34,36,38, bizim grup ve diğerleri tarafından belgelenen 39. Aynı şekilde, her protein antikoru bazı kere boyama açısından sorun giderme gerektirecektir ve dilutions ve kuluçka süreleri her birincil antikor için yaklaşık aralıkları en iyi belgelenmiş sonuçları28, değerlendirilmesi tarafından tahmin edilir 35. embriyo 24 genç için hpf, pK tedavi 2 dk kısa olmalıdır nerede embriyo 24 büyük hpf pK 2 dk daha uzun süre ile tedavi. Ayrıca, embriyo 24 büyük hpf pigment pK tedavi öncesi ağartılmış.

Floresan boyama çözüm ile boyama sonra kalan leke, antikor ve peroxidases metanol ve hidrojen peroksit yıkar dizi gerçekleştirerek kaldırmak için önemlidir. Hemen ardından PBS yıkar aşırı metanol embriyo kaldırmak için hayati önem taşımaktadır. Önemlisi, eğer antikorlar ile devam etmeden önce biz daha az bir başka ve/veya santrifüj tüpleri için uygun olasılığı embriyoların yapmak aseton ve deiyonize suyla yıkama bulduk. Bizim deneyim, antikorlar belirli transkripsiyon faktörleri ve diğer genler için onlar verimli çalışabilir olsa Western engelliyor, Zebra balığı Eğer için iyi çalışmıyor. Ancak, α-tübülin ve β-catenin, gibi son derece korunmuş ve bol protein de Zebra balığı Eğer16,37için çalışır.

Balık ile henüz belirli antikor içinde Zebra balığı var mı genler RNA Tutanaklar görselleştirmek mümkündür. Balık Eğer ile birleştirerek, bu iletişim kuralı tarafından gösterildiği gibi protein ve RNA transkript co yerelleştirme görülen vivo içinde (Şekil 2) olabilir. Esnek doğası çeşitli RNA transkriptler ve proteinler arasında çok sayıda doku ve zaman Puan görselleştirme için hızlı sorun giderme sağlar. Zebra balığı embriyo zaten saygın özellikleri ile birleştirildiğinde, bu iletişim kuralı balık + Eğer genler ve proteinler önemli ifade gelişimsel yolu düzenleme için keşfetmek için başka bir araç sağlar.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser kısmen R.A.W. ve Ulusal Bilim Vakfı yüksek lisans araştırma bursu No R01DK100237 grant tarafından desteklenmiştir DGE-1313583 A.N.M. için Ayrıca üniversite, bilim yaz lisans araştırma bursu programı M.U. destek için teşekkür ederiz Bizim Zebra balığı özel onların bakımı için University of Notre Dame, Zebra balığı Araştırma Merkezi teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca Biyolojik Bilimler Bölümü üyeleri laboratuarımızın tüm destek ve değerli bakış açısı için teşekkür etmek istiyoruz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
non-specific protease mixture solutionRoche11459643001, pronase from Streptomyces griseusDilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C
E3 solutionDilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)FlukaA5040-250GTo make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL
embryo dishesVWR351029
5 mL glass vialsWheaton225012
disposable plastic Pasteur pippettesVWR414004-004
4% paraformaldehyde (PFA) solutionElectron Microscopy Services19210Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use.
10X PBSAmerican BioanalyticalAB11072Dilute in distilled water to make a 1X stock
Tween-20 stockAmerican BioanalyticalAB02038Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water.
1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST)SigmaP94160.1% Tween-20 in 1X PBS
methanol (MeOH)Sigma34860-4L
proteinase KRoche3115879001Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C
flat bottom microcentrifuge tubesVWR87003-300; 87003-298
formamideAmerican BioanalyticalAB00600store at -20°C
hybridization solution (HYB+)50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C
hybridization ovenFisher Scientific13-247-10Q
20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solutionAmerican BioanalyticalAB13156dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks
blocking reagent solutionRoche11096176001dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C
maleic acid buffer solutionSigmaM0375 and S7653150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5)
anti-Digoxigenin-POD, Fab fragmentsRoche11207739910store at 4°C
Cy3 fluorescent staining solutionPerkinElmer, Inc.NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 systemstore at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer
Hydrogen peroxide (H2O2)SigmaH1009-500mLstore at 4°C
molecular grade distilled water (ddH2O)Mediatech25-055-CM
acetoneAmerican BioanalyticalAB00636-01000store an aliquot at -20°C
DMSOAmerican BioanalyticalAB00435-01000
fetal bovine serum (FBS)Gibco10438-034aliquot and store at -20°C
monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1Sigma-AldrichT6793aliquot and store at -20°C
anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbitSigma-AldrichT5192aliquot and store at -20°C
odf3b cDNA clone MGC:63985OpenBiosystemsIMAGE:6792478store bacterial glycerol stock at -80°C
NaCLAmerican BioanalyticalAB01915-05000
Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgGLife TechnologiesA21245store at 4°C; protect from light
Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgGLife TechnologiesA11029store at 4°C; protect from light
DAPILife TechnologiesD1306aliquot and store at -20°C
glass slideThermo-Fisher4445
glass coverslipThermo-Fisher12-540A18 x 18 mm
fine forcepsRobozRS-1050Dumont Tweezers Pattern #55
mounting mediaPolysciences, Inc.18606, Aqua-Poly/Mountstore at 4°C
confocal microscope and associated softwareWe use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software
rockerBio-Rad1660710EDU

Referanslar

  1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  2. Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think small: zebrafish as a model system of human pathology. J Biomed Biotechnol. 2012, 817341(2012).
  3. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, 498-503 (2013).
  4. Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).
  5. Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
  6. Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study segmentation. Kindey Int. 73 (10), 1120-1127 (2008).
  7. Wingert, R. A., Davidson, A. J. Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals from retinoic acid and irx3b. Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).
  8. Chambers, B. E., Wingert, R. A. Renal progenitors: roles in kidney disease and regeneration. World J Stem Cells. 8 (11), 367-375 (2016).
  9. Drummond, B. E., Wingert, R. A. Insights into kidney stem cell development and regeneration using zebrafish. World J Stem Cells. 8 (2), 22-31 (2016).
  10. Poureetezadi, S. J., Wingert, R. A. Little fish, big catch: zebrafish as a model for kidney disease. Kidney Int. 89 (6), 1204-1210 (2016).
  11. Kramer-Zucker, A. G., Olale, F., Haycraft, C. J., Yoder, B. K., Schier, A. F., Drummond, I. A. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132, 1907-1921 (2005).
  12. Liu, Y., Narendra, P., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithlelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134, 1111-1122 (2007).
  13. Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-Notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genetics. 3, e18(2007).
  14. Li, Y., Cheng, C. N., Verdun, V. A., Wingert, R. A. Zebrafish nephrogenesis is regulated by interactions between retinoic acid, mecom, and Notch signaling. Dev Biol. 386 (1), 111-122 (2014).
  15. Wang, L., et al. miR-34b regulates multiciliogenesis during organ formation in zebrafish. Development. 140, 2755-2764 (2013).
  16. Marra, A. N., Wingert, R. A. Epithelial cell fate in the nephron tubule is mediated by the ETS transcription factors etv5a and etv4 during zebrafish development. Dev Biol. 411 (2), 231-245 (2016).
  17. Marra, A. N., Li, Y., Wingert, R. A. Antennas of organ morphogenesis: the roles of cilia in vertebrate kidney development. Genesis. 54 (9), 457-469 (2016).
  18. Duffy, J. L., Suzuki, Y. Ciliated human renal proximal tubular cells. Observations in three cases of hypercalcemia. Am J Pathol. 53, 609-616 (1968).
  19. Katz, S. M., Morgan, J. J. Cilia in the human kidney. Ultrastruct Pathol. 6, 285-294 (1984).
  20. Hassan, M. O., Subramanyan, S. Ciliated renal tubular cells in crescentic glomerulonephritis. Ultrastruct Pathol. 19, 201-203 (1995).
  21. Ong, A. C., Wagner, B. Detection of proximal tubular motile cilia in a patient with renal sarcoidosis associated with hypercalcemia. Am J Kidney Dis. 45, 1096-1099 (2005).
  22. Worthington, W. C., Cathcart, R. S. III Ependymal cilia: distribution and activity in the adult human brain. Science. 139, 221-222 (1963).
  23. Cowan, M. J., Galdwin, M. T., Shelhamer, J. H. Disorders of ciliary motility. Am J Med Sci. 321, 3-10 (2001).
  24. Jain, R., et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 731-739 (2010).
  25. Stubbs, J. L., Vladar, E. K., Axlerod, J. D., Kitner, C. Multicilin promotes centriole assembly and ciliogenesis during multiciliate cell differentiation. Nat Cell Biol. 14, 140-147 (2012).
  26. Tan, F. E., et al. Myb promotes centriole amplification and later steps of the multiciliogenesis program. Development. 140, 4277-4286 (2013).
  27. Zhou, F., Narasimhan, V., Shboul, M., Chong, Y. L., Reversade, B., Roy, S. Gmnc is a master regulator of the multiciliated cell differentiation program. Curr Biol. 25, 3267-3273 (2015).
  28. Jowett, T. Analysis of Protein and gene expression. Methods Cell Biol. 59, 63-85 (1999).
  29. Schulte-Merker, S. Chapter 2: Looking at Embryos. Zebrafish: A practical approach. 261, 39-58 (2002).
  30. Brend, T., Holley, S. A. Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (25), (2009).
  31. Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems. BMC Dev Biol. 11, (2011).
  32. Drummond, B. E., Li, Y., Marra, A. N., Cheng, C. N., Wingert, R. A. The tbx2a/b transcription factors direct pronephros segmentation and corpuscle of Stannius formation in zebrafish. Dev Biol. 421 (1), 52-66 (2017).
  33. Jaffe, K. M., Thiberge, S. Y., Bisher, M. E., Burdine, R. D. Imaging cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 97, 415-435 (2010).
  34. Lauter, G., Soll, I., Hauptmann, G. Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain. Neural Dev. 6, (2011).
  35. Sorrells, S., Toruno, C., Stewart, R. A., Jette, C. Analysis of apoptosis in zebrafish embryos by whole-mount immunofluorescence to detect activated caspase 3. J Vis Exp. (82), e51060(2013).
  36. Schumacher, J. A., Zhao, E. J., Kofron, M. J., Sumanas, S. Two-color fluorescent in situ hybridization using chromogenic substrates in zebrafish. Bio Techniques. 57, 254-256 (2014).
  37. Julich, D., et al. beamter/deltaC and the role of Notch ligands in the zebrafish somite segmentation, hindbrain neurogenesis and hypochord differentiation. Dev Biol. 286, 391-404 (2005).
  38. Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biology. 12, (2014).
  39. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization. J Vis Exp. (89), e51604(2014).
  40. Poureetezadi, S. J., Donahue, E. K., Wingert, R. A. A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos. J Vis Exp. (93), e52063(2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im biyolojisisay 129kirpiklerZebra balmulticiliated h creFloresan situ hibridizasyonayirtpronephrosb brek

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır