JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz hipofiz bezleri teşrih ve fareler gelişmekte olan hipofiz koronal bölümleri hazırlamak için bir protokol mevcut.

Özet

Önemli bir endokrin organ homeostazı için gerekli hormonlar salgılayan hipofiz bezi veya hypophysis olduğunu. O oluşmak-in iki bezleri ile ayrı embriyonik kökenleri ve görev — nörohipofiz ve adenohipofiz. Küçük ve narin bir uzun oval şekli ile gelişmekte olan fare hipofiz bezi bulunmaktadır. Koronal bir bölümü adenohipofiz ve nörohipofiz fare hipofiz tek bir dilim içinde görüntülemek için tercih edilir.

Bu iletişim kuralı uygun hipofiz koronal bölümleri fareler gelişmekte olan iyi korunmuş doku mimarileri ile ulaşmak hedeftir. Bu protokol için ayrıntılı olarak incelemek ve hipofiz bezlerinin düzgün üzerinden fare geliştirme işlemek nasıl açıklar. İlk olarak, fare transcardial perfüzyon formaldehit diseksiyon önce tarafından sabitlenir. Daha sonra üç farklı diseksiyon teknikleri sağlam hipofiz bezlerin fareler yaş bağlı olarak elde etmek için uygulanır. Fetal farelerin embriyonik gün (E) 17,5-18,5 ve Yenidoğan Bebeklerin yukarı 4 gün olarak yaşları için ense kemiği, bezi ve trigeminal sinir de dahil olmak üzere tüm sella bölgeleri kesmiştim. Yavrular için bir bütün olarak trigeminal sinir ile bağlı yaşında doğum sonrası gün (P) 5-14, hipofiz bezleri disseke. 3 hafta boyunca fareler için hipofiz bezleri dikkatle ücretsiz çevre dokulardan disseke. Ayrıca nasıl koronal bölümleri tatmin elde etmek için simge çevre dokular kullanarak uygun yönde hipofiz bezleri katıştırmak için görüntüler. Bu yöntemleri fareler gelişmekte olan hipofiz bezlerinin histolojik ve gelişimsel özellikleri analiz yararlıdır.

Giriş

Önemli bir endokrin organ homeostazı1,2için gerekli hormonlar salgılayan hipofiz bezi veya hypophysis olduğunu. Anatomik olarak, hipofiz bezi, nörohipofiz ve adenohipofiz oluşan bir '' iki-in-one'' yapısıdır. Bu parçaların farklı embriyonik kökenleri ve işlev farklı var. Nörohipofiz sinirsel ektoderm türetilmiştir ve oksitosin ve Antidiüretik hormon salgılar. Adenohipofiz Rathke'nın çantası kaynaklı ve dahil olmak üzere büyüme hormon, prolaktin, tiroid - uyarıcı hormon, folikül - uyarıcı hormon, Lüteinizan, adrenocorticotropic hormon, hormon serbest bırakmak için sorumludur ve melanosit - uyarıcı hormon3,4,5.

Hipofiz bezi fare kafatası ense kemiği (sella turcica) dorsal yüzeye aittir ve beynin tabanına kırılgan bir SAP tarafından eklenir. Yanal trigeminal sinir tarafından ve anteriorly optik hemisferlerine6,7ile çevrilidir. Bezinin uzun ekseni başı dik bir uzun oval şekil vardır. Dorsal yüzeyi nörohipofiz ve adenohipofiz kolayca, dorsal orta bölge ve yanal ve ventrally ikinci uzanan işgal eski ile demarcated. Postnatal geliştirme sırasında ilk ay sonra doğum8,9hipofiz boyutunu hızla artar. Yine de, fare hipofiz hala çok küçük boyutu 1,9 mg bir ortalama ağırlığı ve uzun eksen çapı ~ 3 mm ile yetişkin10, postnatal gün 21 (P21) 2-2.5 mm ve P0 yalnızca 1-1.5 mm uzun eksen çapı.

Koronal bir bölümü adenohipofiz ve nörohipofiz fare hipofiz tek bir dilim içinde görüntülemek için tercih edilir. Ancak, bazı teknik becerileri fareler son derece küçük boyutu ve farklı anatomi nedeniyle gelişmekte olan hipofiz bezlerinin koronal bölümleri tatmin elde etmek için gereklidir. Video bu makalede, biz nasıl fare hipofiz bezleri teşrih ve hipofiz koronal bölümleri farklı geliştirme aşamalarında hazırlayın göstermek.

Protokol

C57BL/6 fareler özel patojen-Alerjik durumlar yetiştirilmiş. Tüm hayvan deneysel hayvan bakım ve ikinci askeri Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış yönergelere uygun yöntemlerdir.

1. diseksiyon, Postnatal gelişmekte olan hipofiz bezi

  1. gerçekleştir anestezi: yenidoğan fareler (P0 - P5) hipotermi ikna etmek için ezilmiş buz koyun. 5 günden büyük fareler için %5 üretan (30 µL/g vücut ağırlığının) anestezi ikna etmek için intraperitoneally enjekte et. Kuyruk/Pinch ayak yanıt-e doğru değerlendirmek. Sadece fare için zararlı uyaranlara yanıt vermemesine neden olur sonra devam.
  2. Yavaşça forepaws taping tarafından fare (yüz yukarı arkasında yatan) sırtüstü pozisyonda güvenli ve hindpaws olma yeteneğine sahip bir çalışma yüzeyinin için pinned (Yani, strafor) bir kimyasal duman başlık içinde.
  3. Transcardial perfüzyon gerçekleştirmek.
    1. Fare kafesi kalp (ve torasik diğer organlara) ortaya çıkarmak için cerrahi makasla kesti.
    2. Kalbi künt Forseps ile güvenli ve 26 G (0,45 mm) iğne sol ventrikül yerleştirin. İğne heparinized fosfat tamponlu tuz ile dolu bir 10 mL şırınga bağlı olduğu (PBS; 5 mg/mL sodyum nitrit ve 10 U/mL heparin ile desteklenmiş, pH 7.4, sıcak kullanmadan önce 37 ° c). Hemen sağ atrium iyi makasla kesmek ve sağ Kulakçık çıkmadan sıvı temizlenene kadar sıcak PBS ile vücut sıvı başlar.
      Not: yaklaşık 5-10 mL PBS yenidoğan fareler için gereklidir ve 10-20 mL PBS yetişkin fareler için.
    3. İğne tutmak ve % 4 paraformaldehyde (PFA; pH 7,4) dolu bir şırınga için değiştirin. 10 mL ve sabitleştirici için 20 mL sıvı yenidoğan ve P21 fare, sırasıyla.
      Dikkat: PFA zehirlidir. Cilt ve solunum tahrişleri ve göz zarar neden olabilir. Eldiven ve iş bir kimyasal başlık altında.
  4. PFA-sabit fare başını kesmek ve kafatası kemik makasla kesip.
    1. Yavaşça küçük Forseps ile arka beyin kafatası tabanından kaldırın. Sella turcica ilk belirtisinde durağı kaldırma ama tutun arka beyin, kesme hipofiz sapı ve sinir lifleri beynin tabanına iyi makas ile bağlanma. Bu hipofiz uzakta beyinle kaldırdı değil emin olmak için kritik bir adımdır.
    2. Sonra beyin kaldırma tutmak ve tüm beyin hipofiz bezi tam olarak ortaya çıkarmak için kaldırın. Hipofiz bezi, yanal trigeminal sinir, dahil olmak üzere tüm sella bölge kesmek ve makas (yaklaşık 3 x 5 mm 2) ile ense kemiği altında.
  5. Disseke doku içine bir 35 mm çanak ya da bir şey 2 mL soğuk %4 içeren 6-şey plaka koymak PFA (pH 7,4). Saptamak için P0 - P7 pituitaries, P14 pituitaries, P21 - P28 pituitaries ve yetişkin pituitaries için 3 h için 1,5 saat için 1 saat 40 dk 4 ° C'de doku.
  6. Daha fazla ayrışma, hipofiz
    1. sabit doku 10 mL PBS, 5 değişiklikleri, 15 dk ile yıkayın. Yenidoğan hipofiz bezi ile birlikte onun çevre dokular ve ense kemiği altında aşırı su kaybına doğrudan işlenebilir. Ancak, hipofiz bezlerin fareler 5 günden daha eski üzerinden ayrışmış başka bir stereo mikroskop altında.
    2. Sabit doku 1 mL PBS içeren bir 35 mm çanak içine koymak. P5 - P14 pituitaries, için sinirler ve iyi forseps ve makas ile kemik arasındaki bağ membranlar kaldırmak ve dikkatle yanal trigeminal sinir birlikte hipofiz bezi sella turcica bırakarak ancak bir bütün izole. İzole bezi ve sinirler ile bağ membranlar tarafından bağlı bir " H "-hangi tarihlerde görünüm ( şekil 1B).
    3. İçin P21 ve yetişkin pituitaries, sinirler ve hipofiz etrafında bağ membranlar kaldırmak ve bezi çevre dokular üzerinden ücretsiz. Hipofiz bezi doku kağıt mendil temizlik lens ile sarın ve gömme bir kaset koy.
      Not: küçük hipofiz lens temizleme kağıt mendil ile kaydırma örneklerin herhangi bir olası kaybını önlemek ve parafin katıştırma aşağıdaki yordamdaki doku bütünlüğünün korunması için yardımcı olur. Cryo-gömme yordamdaki küçük bir şişe içinde işlense hipofiz kaydırılmasına gerek kalmayabilir.

2. Katıştırma ve Sectioning alkol

  1. 15 dk için % 50, % 65, %75 ve % 95 etanol çözümleriyle kaset katıştırma olarak numuneler kurutmak. Daha sonra saf etanol, 3 dakikadır her P0 - 3 değişikliklerle P4 bezleri, P5 - P14 bezleri ve 5 min için her 4 dk P21 ve büyük bezleri için kurutmak. Ksilen ile net, 3, 3 dakikadır her P0 - P4 bezleri, P5 - P14 bezleri ve 5 min için her 4 dk P21 ve büyük bezleri için değiştirir. Erimiş parafin mum, 3 değişiklikleri, 7 dk P0 - P4 bezleri, sızmak ve 8 min iki kez izledi tarafından 6 dk bir kez P5 ve büyük bezleri için.
    Not: Doku işleme için en uygun parametreler ampirik olarak ayarlanabilir. Yüksek kaliteli bölümler elde etmek için yaşında veya yetersiz dehidrasyon kaçınılmalıdır. Aynı Ksilen kullanarak doku temizlenmesi için geçerlidir.
  2. Katıştırırken yönlendirme
    1. konsol sistemi, gömme bir doku üzerinde örnek kaset çıkarın ve yarı erimiş parafin mum ile dolu temel bir kalıp içine yerleştirin. Gömme hipofiz bezinin uygun yönlendirmeyi koronal bölümleri tatmin edici esastır.
    2. İçin P21 ve yetişkin hipofiz bezleri, hipofiz bezi temel kalıp (bölüm uçak) alt yüzeyine dik kısa ekseni ile getirin. Ense kemikler ve trigeminal sinir anatomik yerlerinden P0 - P4 ve P5 - P14 pituitaries, sırasıyla kullanın. Numuneler ile onların trigeminal sinir ya da enine lamina ense kemik bir temel kalıp alt yüzeyine dik orient.
      3. Balmumu soğutma tabağa yarı katı hale gelene kadar
    3. yavaşça doku istenen konumda ısıtılmış ince Forseps ile tutun. Kalıp erimiş parafin mum ile kontör. Balmumu tamamen katılaşmış kadar soğumasını parafin blok izin.
      Not: Hipofiz (E18.5) embriyonik gün 18,5 yenidoğan hipofiz olarak aynı şekilde tedavi edilebilir. Ama pituitaries (Rathke ' s torbalar içinde) E16.5 ile tüm baş gömülü ve temel bir kalıp alt yüzeyine dik sagittal eksen (ağzından occiput) ile odaklı daha genç değil.
  3. Sonra kesti ve parafin blok için 10-20 dk-20 ° C'de soğuk içine ince dilimleri (4 µm kalınlık tercih edilir) ile bir microtome. Tatmin edici koronal bölümler elde etmek için ince kesit sırasında parafin blok konumunu ayar. Doku dilimleri dilimleri aşağıdaki yordamlar dekolmanı önlemek için polylysine kaplı cam slaytlar üzerine monte.
    Not: Alternatif olarak, örneklerin % 15, susuz %30 (W/V) Sükroz çözümlerinde (PBS) aynı yönlendirme yöntemini kullanarak bileşik cryo katıştırma katıştırılmış ve hızlı bir şekilde kuru buzda donmuş alt lavabo kadar 4 ° C'de. O zaman donmuş doku bloklar bir cryostat kullanarak 8-10 µm dilimler halinde kesin. Cryo-kesitler, Morfoloji ancak, sık sık alkol bölümleri aşağı kalır yanı yok.

3. H & E boyama ve ayirt etiketleme

  1. , sıcak bir ısı slaytlarda blok 55 ° C'de ve dewax Ksilen, 2 değişiklik, 4 dk ile her. % 95 etanol iki kez ve % 75 etanol iki kez, 3 dk örnekleriyle kurutmak. Slayt üzerinde bir shaker 5 min için distile su ile yıka.
  2. H için & E boyama, şap Hematoksilen çözüm için 6 dk bölümlerde leke, durulama runn içindeIng musluk suyu 2 dakika, 45 s ve durulama akan suyun 2 dakika içinde yeniden için % 0,2 amonyaklı su ile ayırt etmek. 1 dk ve leke için 2 min. Eozin ile sırayla kurutmak, Sil ve mount için % 95 etanol bölümlerle kurutmak.
    1. Ayirt etiketleme bölümleri % 3 H 2 O 2 ve % 0,01 NaN 3 endojen peroxidases devre dışı bırakabilirsiniz için oda sıcaklığında 20 dakika içeren metanol ile tedavi. 37 30 dk için engelleme arabellek (%5 keçi serum içinde PBS) bölümlerle bir düdüklü tencere 2 dk. Incubate alma arabellek (1 mM EDTA ve 1 mM Tris-HCl, pH 7,4) bölümlerinde kaynatılarak antijenleri almak ° C.
    2. Engelleme arabellekte gecede 4'te seyreltilmiş bölümleri tavşan Anti-büyüme hormonu (GH) antikor (1:2, 000) veya tavşan anti-gliyal fibrillary asidik protein (GFAP'nin) antikor (1:2, 000) ile kuluçkaya ° C.
    3. 35 dk. 37 için ikincil antikor (keçi Anti-tavşan IgG-HRP, 1:300 engelleme arabelleği) bölümlerle kuluçkaya ° C.
    4. 15 dakika oda sıcaklığında Biotinyl Tyramide (1:50 Tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik içeren %0,3 H 2 O 2) kullanarak sinyalleri yükseltmek ve Streptavidin-Alexa594 veya 488 (kapatmaktır tampon, 30 dk, 37 ° C 1:300) ile görselleştirmek.
    5. Counterstain DAPI (50 mg/L PBS) ile çekirdeği oda sıcaklığında 5 min için.
      Not: Tyramide sinyal güçlendirme (TSA) sistemi kullanarak sinyali yükseltmek gerekli olmayabilir. Alternatif olarak, Floresans Birleşik ikincil antikor sinyal görselleştirmek için kullanılabilir.
  4. Floresan mikroskop kullanarak edinme görüntüleri 40/0,75 hedefleri ve 5,0 megapiksel kamera DAPI, Texas kırmızı ve FITC filtre setleri, × 4/0,13 × ile donatılmıştır. 360, 488 ve 594 nm lazer dalga boyu görüntüleme DAPI, Alexa 488 - ve kesitler, Alexa 594 lekeli için sırasıyla kullanın. Lazer güç en iyi duruma getirme (0,8 genellikle kullanıldı) ve her kanal için istenilen düzeylere çekim hızı. Görüntü alma yazılımı kontrol altında görüntü yakalama ve daha sonra görüntü işleme yazılımı kullanarak floresan görüntü.

Sonuçlar

Bu iletişim kuralı fareler gelişmekte olan hipofiz bezleri incelemek için bir yöntem sunuyor. Yenidoğan fare, hipofiz bezi, trigeminal sinir ve iç çamaşırım içeren tüm sella bölgelerin ense kemik kafatası tabanından dışarı disseke. Küçük ve narin hipofiz bezi (şekil 1A) işlemi sırasında olduğu gibi kaldı. 5 günden daha eski fareler için yanal trigeminal sinir bağlı hipofiz bezleri o zamanlar izole. Fare iyi korunmuş P7 izole h...

Tartışmalar

Fare pituitaries geliştirmek için bu küçük ve kırılgan özellikleri ve benzersiz anatomik özellikleri6,8nedeniyle uygun koronal bölümler elde etmek teknik olarak zor oldu. Bazı araştırma grupları böylece embriyonik ve neonatal hipofiz11,12morfolojisi çözümlemek için orta-sagittal bölümleri seçti. Yine de hipofiz orta-sagittal bölümünü de anterior, orta gösterilen yeteneğine sah...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser hibe Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31201086, 31470759 ve 31671219) ve Şangay doğal Bilim Vakfı (12ZR1436900) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Tools/Equipment
Surgical scissors-straightJinZhongJ21010can be purchased from other vendors
Fine scissors-strainghtJinZhongWA1010can be purchased from other vendors
Blunt forcepsJinZhongJD1020can be purchased from other vendors
Fine forcepsDumontRS-5015for isolation of the pituitary
26G (0.45mm) needleHongDafor transcardial perfusion
Syringe (1 mL)BD300841can be purchased from other vendors
Syringe (10 mL)BDcan be purchased from other vendors
35mm dishCorning430165can be purchased from other vendors
Lens cleaning paperShuangQuancan be purchased from other vendors
Anatomical microscopeOLYMPUSSZX-ILLB2-200can be purchased from other vendors
Embedding cassetteThermo Fisher22-272423can be purchased from other vendors
Tissue embedding console systemKEDEEKD-BM11can be purchased from other vendors
MicrotomeThermo FisherHM315Rcan be purchased from other vendors
Superfrost-Plus slidesThermo Fisher22-037-246can be purchased from other vendors
Cover glassThermo Fisher12-543can be purchased from other vendors
Fluorescence microscopeOLYMPUSBH2-RFCAcan be purchased from other vendors
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
UrethaneBBIEB0448
NaClSigmaS9625for PBS
KClSigmaP9541for PBS
Na2HPO4.12H2OSigma71650for PBS
K2HPO4SigmaP2222for PBS
NaNO2Sigma237213
Heparin Sodium InjectionSPHH31022051for perfusion saline
Paraformaldehyde (PFA)SigmaP6148
EthanolSCR10009218
XyleneSCR10023418
ParaffinThermo Fisher8330
HematoxylinSigmaH9627for H&E staining
Eosin YSigmaE4009for H&E staining
rabbit anti growth hormone (GH)National Hormonefor immunostaining
antibodyPituitary Program
Rabbit anti-mouse GFAP antibodySigmaG9269for immunostaining
Goat anti-rabbit IgG, HRPJackson111-035-003for immunostaining
TSA systemNEN Life Science ProductsNEL700for immunostaining
Streptavidin, Alexa Fluor 594Thermo FisherS32356for immunostaining
Anti-FITC Alexa Fluor 488Thermo FisherA11090for immunostaining

Referanslar

  1. Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. Hidden face of the anterior pituitary. Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).
  2. Haedo, M. R., et al. Regulation of pituitary function by cytokines. Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).
  3. Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks. Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).
  4. Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. Pituitary gland development: an update. Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).
  5. Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse. Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).
  6. Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa. Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).
  7. Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland. AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).
  8. Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period. Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).
  9. Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification. Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).
  10. Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis. J Vis Exp. (46), (2010).
  11. Budry, L., et al. Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).
  12. Wilson, D. B., Wyatt, D. P. Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice. Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).
  13. Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device. J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).
  14. Cao, D., et al. ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification. Nat Commun. 7, 11121 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im biyolojisisay 129hipofiz bezianatomidoku b l mleriMorfolojigeli tirmefareler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır