Вскрытие и подготовка корональных срез развития гипофиза мыши

Резюме

Мы представляем протокол вскрыть гипофиза и подготовить гипофиза коронковой части из развивающихся мышей.

Аннотация

Гипофиза или гипофиза является важным органом эндокринной секреции гормонов, необходимых для гомеостаза. Он состоит из двух желез с отдельным эмбриональное происхождение и функций — neurohypophysis и adenohypophysis. Развивающихся гипофиза мыши маленькие и тонкие с удлиненной овальной формы. Корональных разделе предпочтителен для отображения в adenohypophysis и neurohypophysis в один срез гипофиза мыши.

Целью настоящего Протокола является достижение надлежащего гипофиза корональных секции с архитектурами хорошо сохранившиеся ткани из развивающихся мышей. В этом протоколе мы подробно описывают, как анализировать и обрабатывать гипофиза правильно из развивающихся мышей. Во-первых мыши фиксируются transcardial перфузии формальдегида до вскрытия. Затем три различных рассечения методы применяются для получения нетронутыми гипофиза в зависимости от возраста мышей. Для плода мышей возрасте от новорожденных и эмбриональных дней (E) 17.5-18,5 до 4 дней, разделяются всей Селла регионов, включая клиновидной кости, железы и тройничного нервов. Для щенков возрасте послеродовой (P) 5-14 дней, гипофиза связано с тройничного нервов разделяются в целом. Для мышей более 3 недель гипофиза тщательно расчлененный бесплатно от окружающих тканей. Мы также отображать как внедрять гипофиза в надлежащей ориентации с помощью окружающих тканей как ориентиры для получения удовлетворяющих корональных секций. Эти методы полезны при анализе гистологические и развития функции гипофиза в разработке мышей.

Введение

Гипофиза или гипофиза является важным органом эндокринной секреции гормонов, необходимых для гомеостаза^1,2. Анатомически гипофиз является '' два в одном '' структура, состоящая из neurohypophysis и adenohypophysis. Эти компоненты имеют разные эмбриональное происхождение и функции очень по-разному. Neurohypophysis является производным от нейронных эктодермы и выделяет окситоцина и антидиуретического гормона. Adenohypophysis происходит от Ратке в мешочек и несет ответственность за освобождение гормонов, в том числе гормон роста, пролактина, тиреотропный гормон, фолликулостимулирующего гормона, лютеинизирующего гормона, Адренокортикотропный гормон, и ^3,– меланоцитов, стимулирующий гормон^4,5.

Гипофиз опирается на дорсальной поверхности клиновидной кости (турецкого седла) мыши черепа и прикреплена к полу мозга хрупкий стебель. Он окружен боково тройничного нервов и кпереди от зрительных нервов^6,7. Железы обладает удлиненной овальной формы с его длинной оси, перпендикулярной, головы. На спинной поверхности neurohypophysis и adenohypophysis можно легко быть разграничены, с бывших оккупирующих спинной медиальной региона и последнего расширения боков и вентрально. Во время послеродового развития размер гипофиза увеличивается быстро, в первый месяц после рождения^8,9. Тем не менее гипофиза мыши все еще очень маленький в размер, средний вес 1,9 мг и Лонг ось диаметром ~ 3 мм в взрослых¹⁰, длинные оси диаметром 2-2,5 мм на послеродовой день 21 (P21) и только 1-1,5 мм на P0.

Корональных разделе предпочтителен для отображения adenohypophysis и neurohypophysis в один срез гипофиза мыши. Однако некоторые технические навыки требуются для получения удовлетворяющих коронковой части гипофиза из развивающихся мышей из-за его исключительно небольшой размер и собственный анатомии. В этом видео статьи мы демонстрируем как вскрыть гипофиза мыши и подготовить гипофиза корональных секции на различных этапах.

протокол

мышей C57BL/6 разводят в конкретных условиях возбудителя бесплатно. Всех животных экспериментальные методы в соответствии с руководящими принципами, утвержденными животное уход и Комитета по этике на второй военный медицинский университет.

1. рассечение из послеродового развития гипофиза

1. выполнения анестезии: состоится дробленый лед, чтобы побудить гипотермии новорожденных мышей (P0 - P5). Для мышей старше 5 дней возраста придать 5% уретана (30 мкл/г веса тела) внутрибрюшинно побудить анестезии. Оценка ответов на хвост/мыс щепотки. Только после того, как мышь не реагирует на раздражители вредных.
2. Обеспечения мыши в лежачем положении (лежа на спине с лицом вверх), осторожно лентой передних лапах и hindpaws к рабочей поверхности, которая может быть закреплена (т.е., пенопласт) внутри Химический вытяжной шкаф.
3. Выполнения transcardial перфузии.
   1. Разрезать грудную клетку мыши с Ножницы хирургические подвергать сердца (и других органах грудной клетки).
   2. Безопасный бьющееся сердце с тупым щипцами и вставьте иголку 26G (0,45 мм) левого желудочка. Игла крепится к 10 мл шприц, наполненный гепаринизированным фосфатный буфер (PBS; дополнена нитрит натрия 5 мг/мл и 10 ед/мл гепарина, рН 7,4, нагреть до 37 ° C перед использованием). Немедленно сократить правое предсердие с тонкой ножницы и приступить к perfuse тела с теплым PBS, до тех пор, пока жидкость, выход из правого предсердия ясно.
      Примечание: Приблизительно 5-10 мл, PBS требуется для новорожденных мышей и 10-20 мл PBS для взрослых мышей.
   3. Храните иглу в месте и изменить на другой шприц, наполненный параформальдегида 4% (PFA; рН 7,4). Perfuse 10 мл и 20 мл фиксатором для новорожденных и P21 мышь, соответственно.
      Предупреждение: PFA является токсичным. Это может вызвать кожи и раздражения дыхательных путей и повреждение глаз. Надевайте перчатки и работают под капотом химического.
4. Обезглавить PFA-Исправлена мыши и разрезали кости черепа с ножницами.
   1. Аккуратно снять задний мозг от основания черепа с небольшой щипцами. При первых признаках турецкого седла отмены остановки, но держите задний мозг, вырезать гипофиза стебля и нервных волокон, подключение к основанию мозга с тонкой ножницами. Этот шаг очень важен для обеспечения что гипофиза не ликвидируется прочь с мозгом.
   2. Затем держать подъема мозга и удалите весь мозг полностью подвергать гипофиза. Вырезать весь sella региона, в том числе гипофиза, боковые тройничного нервов и под клиновидной кости с ножницами (примерно 3 x 5 мм ²).
5. Положить Иссеченную ткань в блюдо 35 мм или одной скважиной 6-ну пластины, содержащий 2 мл холодной 4% PFA (рН 7,4). Исправить ткани на 4 ° C для 40 мин для P0 - P7 pituitaries, 1 ч для P14 pituitaries, 1,5 ч за P21 - P28 pituitaries и 3 h для взрослых pituitaries.
6. Дальнейшее диссоциации гипофиза
   1. мыть фиксированной ткани с 10 мл PBS, 5 изменения, 15 мин. Новорожденных гипофиза вместе с его окружающих тканей и под клиновидной кости могут быть обработаны непосредственно к обезвоживанию. Однако, следует отделить гипофиза от мышей старше 5 дней далее под микроскопом стерео.
   2. Поместить фиксированный ткани в блюдо 35 мм, содержащие 1 мл PBS. Для P5 - P14 pituitaries, удалите соединительной оболочки между нервов и костей с тонкой щипцами и ножницы и тщательно изолировать гипофиза вместе с боковыми тройничного нервов в целом, но оставляя турецкого седла. Изолированные железы и нервов связаны соединительной оболочки с " H "-нравится внешний вид ( рис. 1B).
   Pituitaries
   3. за P21 и взрослых, удалить нервы и соединительной мембраны вокруг гипофиза и свободного железа от окружающих тканей. Оберните гипофиза ткани с объективом, очистка папиросной бумаги и положить его в внедрения кассету.
      Примечание: Упаковка крошечные гипофиза с объективом, очистка папиросной бумаги помогает предотвратить любые потенциальные потери образцов и сохранения целостности тканей в следующей процедуре парафин встраивание. Это не может быть необходимо обернуть гипофиза, если оно обрабатывается в маленькую бутылку в процедуре крио встраивание.

2. Парафин встраивание и Sectioning

1. дигидрат образцов в встраивание кассеты с 50%, 65%, 75% и 95% растворы этанола за 15 мин. Впоследствии обезвоживает с 3 изменения чистого этанола, 3 мин для P0 - P4 желез, 4 мин для P5 - P14 желез и 5 мин за P21 и старше желез. Снимите с ксилол 3 изменения, 3 мин для P0 - P4 желез, 4 мин для P5 - P14 желез и 5 мин за P21 и старше желез. Проникнуть в расплавленный парафин, 3 изменения, 7 мин для P0 - P4 желез, и 8 мин дважды следуют 6 мин один раз для P5 и старше желез.
   Примечание: Оптимальные параметры для обработки ткани может быть эмпирически скорректирована. Для получения высокого качества разделы, следует избегать недостаточно или более обезвоживания. То же самое верно для очистки ткани, используя ксилол.
2. Ориентация при внедрении
   1. на ткани, встраивание консоль системы, удалить образцы из кассеты и поместить его в базовой формы наполовину заполненный с расплавленного парафина. Правильной ориентации внедрения гипофиза имеет важное значение для удовлетворения корональных секций.
   2. За P21 и взрослых гипофиза, позиция гипофиза с ее короткой оси перпендикулярно нижней поверхности базовой формы (плоскости сечения). Используйте клиновидной кости и тройничного нервов анатомические ориентиры для P0 - P4 и P5 - P14 pituitaries, соответственно. Ориент образцов с их тройничного нервов или поперечные пластинки клиновидной кости перпендикулярно нижней поверхности базы плесень.
   3. Аккуратно прижмите ткани в нужном положении с утепленным тонкой щипцами, до тех пор, пока воск становится полутвердых на охлаждения пластины. Долейте плесень с расплавленного парафина. Разрешить блок парафином остыть до тех пор, пока воск полностью затвердевшим.
      Примечание: Гипофиза в эмбриональных день 18,5 (E18.5) могут рассматриваться таким же образом как новорожденных гипофиза. Но pituitaries (Ратке ' s Чехлы) моложе E16.5 должны быть внедрены с всю голову и ориентированы с сагиттальной оси (от устья до затылка) перпендикулярно нижней поверхности базы плесень.
3. Chill блоком парафина в-20 ° C для 10-20 мин и затем сократить его на тонкие ломтики (4 мкм толщина предпочтительнее) с микротома. Чтобы получить удовлетворительный корональных секции, тонкой настройки позиции парафиновых блоков при резании. Смонтировать фрагменты тканей на polylysine покрытием стекла слайды для предотвращения отряд срезов в следующих процедурах.
   Примечание: Кроме того, образцы могут быть обезвоженной в 15%, 30% (W/V) сахарозы решения (PBS) при 4 ° C до тех пор, пока они опускаться на дно, встроенных в крио встраивание соединение, используя тот же метод ориентации и быстро заморожены на сухой лед. Затем нарежьте ломтиками 8-10 мкм, с помощью криостата блоков замороженные ткани. Морфология крио секции, однако, уступает часто парафин секций.

3. H & E окрашивание и Этикетировочный иммунофлуоресценции

1. теплый слайды на огне блокировать при 55 ° C и dewax ксилол, 2 изменения, 4 мин. Обезвоживает образцы с дважды этанола 95% и 75% этанола дважды, 3 мин. Вымойте слайды с дистиллированной водой для 5 мин на шейкере.
2. Для H & E окрашивание, краситель разделы в раствор квасцов гематоксилином 6 мин, промойте в РаннING водопроводной воды для 2 мин, дифференцировать с 0,2% аммиачной воды для 45 s и повторно промыть в проточной воде в течение 2 мин. Затем обезвоживает секции с 95% этиловом спирте, за 1 мин и окрашиваются эозином на 2 мин последовательно обезвоживать, очистить и смонтировать.
3. , Этикетировочный иммунофлуоресценции
   1. лечения разделы с метанолом, содержащие 3% H ₂ O ₂ и 0,01% НАН ₃ 20 мин при комнатной температуре для инактивации эндогенной пероксидазы. Извлечение антигены путем кипячения секций в буфере извлечения (ЭДТА 1 мм и 1 мм трис-HCl, рН 7,4) в скороварку на 2 мин инкубировать в разделах с блокирующий буфер (5% козьего сыворотки в PBS) за 30 мин при 37 ° с.
   2. Инкубировать секции с кролик гормон против роста (GH) антитела (1:2, 000) или антител анти глиальных фибриллово кислой белка (СВМС) Кролик (1:2, 000) разводят в блокирующем буфере на ночь в отеле 4 ° C.
   3. Секции с вторичное антитело (коза анти кролик IgG-ПХ, 1: 300 в блокирующем буфере) Инкубируйте 35 мин 37 ° C.
   4. Усилить сигналов с помощью Biotinyl Tyramide (1:50 в буфер Tris физиологического раствора, содержащего 0,3% H ₂ O ₂) для 15 мин при комнатной температуре и визуализировать стрептавидина-Alexa594 или 488 (1: 300 в блокирующем буфере, 30 мин, 37 ° C).
   5. Counterstain ядер с DAPI (50 мг/Л в PBS) за 5 мин при комнатной температуре.
      Примечание: Это не может быть необходимо усилить сигнал с помощью системы Tyramide усиления сигнала (TSA). Кроме того, вторичное антитело проспряганное флуоресценции может использоваться для визуализации сигнала.
4. Получить изображения с помощью микроскопа флуоресценции оснащены × 4/0,13 DAPI, Техас красный и FITC наборы фильтров, чтобы × 40/0,75 цели и 5,0 мегапиксельной камерой. Используйте 360, 488 и 594 Нм лазер длиной волны для визуализации DAPI, Alexa 488 - и Alexa 594-окрашенных участков, соответственно. Оптимизировать мощность лазера (0,8 был использован как правило) и время экспозиции для желаемого уровня для каждого канала. Захватить изображение под контролем образ приобретение программного обеспечения и наложения изображений флуоресценции, впоследствии с помощью программного обеспечения для обработки изображений.

Результаты

Этот протокол предоставляет метод для того чтобы рассечь гипофиза из развивающихся мышей. Для новорожденных мыши, регионов всей Селла, содержащей гипофиза, тройничного нервов и под клиновидной кости были расчленены от основания черепа. Крошечные и деликатный гипофиз...

Обсуждение

Для разработки мышиных pituitaries, он был технически трудно получить правильное корональных секции из-за их маленькие и хрупкие особенности и уникальные анатомические характеристики^6,8. Таким образом, некоторые исследовательские группы выбрал середине саги...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tools/Equipment
Surgical scissors-straight	JinZhong	J21010	can be purchased from other vendors
Fine scissors-strainght	JinZhong	WA1010	can be purchased from other vendors
Blunt forceps	JinZhong	JD1020	can be purchased from other vendors
Fine forceps	Dumont	RS-5015	for isolation of the pituitary
26G (0.45mm) needle	HongDa		for transcardial perfusion
Syringe (1 mL)	BD	300841	can be purchased from other vendors
Syringe (10 mL)	BD		can be purchased from other vendors
35mm dish	Corning	430165	can be purchased from other vendors
Lens cleaning paper	ShuangQuan		can be purchased from other vendors
Anatomical microscope	OLYMPUS	SZX-ILLB2-200	can be purchased from other vendors
Embedding cassette	Thermo Fisher	22-272423	can be purchased from other vendors
Tissue embedding console system	KEDEE	KD-BM11	can be purchased from other vendors
Microtome	Thermo Fisher	HM315R	can be purchased from other vendors
Superfrost-Plus slides	Thermo Fisher	22-037-246	can be purchased from other vendors
Cover glass	Thermo Fisher	12-543	can be purchased from other vendors
Fluorescence microscope	OLYMPUS	BH2-RFCA	can be purchased from other vendors
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Urethane	BBI	EB0448
NaCl	Sigma	S9625	for PBS
KCl	Sigma	P9541	for PBS
Na2HPO4.12H2O	Sigma	71650	for PBS
K2HPO4	Sigma	P2222	for PBS
NaNO2	Sigma	237213
Heparin Sodium Injection	SPH	H31022051	for perfusion saline
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Ethanol	SCR	10009218
Xylene	SCR	10023418
Paraffin	Thermo Fisher	8330
Hematoxylin	Sigma	H9627	for H&E staining
Eosin Y	Sigma	E4009	for H&E staining
rabbit anti growth hormone (GH)	National Hormone		for immunostaining
antibody	Pituitary Program
Rabbit anti-mouse GFAP antibody	Sigma	G9269	for immunostaining
Goat anti-rabbit IgG, HRP	Jackson	111-035-003	for immunostaining
TSA system	NEN Life Science Products	NEL700	for immunostaining
Streptavidin, Alexa Fluor 594	Thermo Fisher	S32356	for immunostaining
Anti-FITC Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11090	for immunostaining