Dissezione e preparazione coronale fetta di sviluppare la ghiandola pituitaria del Mouse

Riepilogo

Vi presentiamo un protocollo per sezionare le ghiandole pituitarie e preparare sezioni coronali pituitarie da topi di sviluppo.

Abstract

La ghiandola pituitaria o ipofisi sono un importante organo endocrino che secerne ormoni essenziali per l'omeostasi. Si compone di due ghiandole con origini embrionali separate e funzioni — neurohypophysis e adenohypophysis. Ghiandola pituitaria del mouse in via di sviluppo è molto piccolo e delicato con una forma ovale allungata. Una sezione coronale è preferita per visualizzare sia il adenohypophysis e neurohypophysis in una sola fetta del pituitary del mouse.

L'obiettivo del presente protocollo è quello di ottenere sezioni coronali pituitari corretto con le architetture di tessuto ben conservato da topi di sviluppo. In questo protocollo, descriviamo dettagliatamente come sezionare ed elaborare ghiandole pituitarie correttamente da topi di sviluppo. In primo luogo, topi vengono fissati mediante perfusione perfusione di formaldeide prima della dissezione. Quindi tre diverse tecniche di dissezione vengono applicate per ottenere ghiandole pituitarie intatti a seconda dell'età dei topi. Per topi fetali dai giorni embrionale (E) 17,5-18,5 e neonati fino a 4 giorni, le regioni di sella intera compreso l'osso sfenoidale, ghiandola e nervi di trigeminal vengono sezionate. Per i cuccioli invecchiati giorni postnatali (P) 5-14, ghiandole ipofisi collegati con nervi di trigeminal vengono sezionati nel suo complesso. Per i topi vecchio oltre 3 settimane, le ghiandole pituitaria attentamente vengono sezionate gratis dai tessuti circostanti. Visualizziamo anche come incorporare le ghiandole pituitaria in un orientamento corretto utilizzando i tessuti circostanti come punti di riferimento per ottenere soddisfazione sezioni coronali. Questi metodi sono utili per analizzare le caratteristiche istologiche e dello sviluppo delle ghiandole pituitaria in topi di sviluppo.

Introduzione

La ghiandola pituitaria o ipofisi sono un importante organo endocrino che secerne ormoni essenziali per l'omeostasi^1,2. Anatomicamente, la ghiandola pituitaria è una struttura di ' due-in-one ' costituita neurohypophysis e adenohypophysis. Queste parti hanno diverse origini embrionali e funzione in modo molto diverso. Neurohypophysis è derivato da ectoderma neurale e secerne l'ormone antidiuretico e l'ossitocina. Adenohypophysis proviene da di Rathke ed è responsabile per il rilascio degli ormoni tra cui l'ormone della crescita, prolattina, ormone stimolante la tiroide, ormone follicolo - stimolante, ormone luteinizzante, ormone adrenocorticotropo, e ormone distimolazione^3,4,5.

La ghiandola pituitaria si riposa sulla superficie dorsale dell'osso sfenoidale (sella turcica) del cranio del mouse e viene fissata al pavimento del cervello da un gambo fragile. Lateralmente è circondato dai nervi di trigeminal e anteriormente dal chiasma ottico^6,7. La ghiandola ha una forma ovale allungata con il suo asse perpendicolare a quella della testa. Sulla sua superficie dorsale, neurohypophysis e adenohypophysis può facilmente essere delimitate, con l'ex che occupa la regione dorsale mediale e il quest'ultimo che si estende lateralmente e ventralmente. Durante lo sviluppo postnatale, la dimensione della ghiandola pituitaria aumenta rapidamente nel primo mese dopo la nascita^8,9. Tuttavia, la ghiandola pituitaria del mouse è ancora molto di piccole dimensioni con un diametro assi lunghi di ~ 3 mm e un peso medio di 1,9 mg in adulti¹⁰, diametro assi lunghi 2-2,5 mm al giorno postnatale 21 (P21) e solo l'1-1,5 mm in P0.

Una sezione coronale è preferita per visualizzare sia adenohypophysis e neurohypophysis in una sola fetta del pituitary del mouse. Tuttavia, alcune abilità tecniche sono necessario per ottenere soddisfazione sezioni coronali di ghiandole pituitarie da topi grazie alle sue dimensioni estremamente ridotte e distinta anatomia di sviluppo. In questo articolo dei video, dimostriamo come sezionare ghiandole pituitarie del mouse e preparare sezioni coronali pituitari alle diverse fasi di sviluppo.

Protocollo

topi C57BL/6 sono allevati in condizioni da organismi patogeni specifiche. Tutti i metodi sperimentali animali sono in conformità con le linee guida approvate dal comitato di etica presso Second Military Medical University e cura degli animali.

1. dissezione di postnatale sviluppando ghiandola pituitaria

1. eseguire anestesia: posto topi neonatali (P0 - P5) su ghiaccio tritato per indurre ipotermia. Per topi più di 5 giorni di età, iniettare intraperitonealmente 5% uretano (30 µ l/g di peso corporeo) per indurre l'anestesia. Valutare le risposte per coda/tep pizzichi. Procedere solo dopo che il mouse non risponde agli stimoli nocivi.
2. Secure il mouse nella posizione supina (sdraiato sulla schiena con la faccia verso l'alto) toccando delicatamente le zampe anteriori e si ad una superficie di lavoro che è capace di essere appuntato (cioè, polistirolo) all'interno di una cappa chimica.
3. Eseguire perfusione perfusione.
   1. Tagliare la gabbia toracica del mouse con forbici chirurgiche per esporre il cuore (e altri organi toracici).
   2. Fissare il cuore che batte con il forcipe smussato e inserire un ago da 26G (0,45 mm) nel ventricolo di sinistra. L'ago è collegato a una siringa da 10 mL riempita con soluzione fisiologica eparinizzata tampone fosfato (PBS; completati con nitrito di sodio 5 mg/mL e 10 U/mL eparina, pH 7.4, riscaldare a 37 ° C prima dell'uso). Immediatamente tagliare l'atrio destro con forbice e cominciare a irrorare il corpo con il PBS caldo fino a quando il liquido esce l'atrio di destra è chiaro.
      Nota: Circa 5-10 mL di PBS è necessario per topi neonatali e 10-20 mL di PBS per topi adulti.
   3. Tenere l'ago in posizione e modificare un'altra siringa riempita con paraformaldeide al 4% (PFA; pH 7.4). Irrorare di 10 mL e 20 mL di fissativo per neonatale e P21 mouse, rispettivamente.
      Attenzione: PFA è tossico. Può causare danni agli occhi e irritazioni respiratorie e pelle. Indossare guanti e lavorare sotto una cappa chimica.
4. Decapitare il mouse PFA-fisso e tagliare l'osso del cranio aperto con le forbici.
   1. Sollevare delicatamente il hindbrain dalla base del cranio con piccole pinze. Al primo segno del turcica di sella, fermata di sollevamento, ma tenere il hindbrain, tagliare il gambo pituitario e fibre nervose che collega alla base del cervello con forbice. Questo passaggio è fondamentale per garantire che l'ipofisi non viene sollevato con il cervello.
   2. Quindi mantenere sollevamento cervello e rimuovere l'intero cervello per esporre completamente la ghiandola pituitaria. Tagliare la regione intera sella compreso la ghiandola pituitaria, i nervi di trigeminal laterali e il sotto osso sfenoidale con le forbici (circa 3 x 5 mm ²).
5. Mettere il tessuto dissecato in un piatto di 35 mm o un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti contenenti 2 mL freddo 4% PFA (pH 7.4). Difficoltà il tessuto a 4 ° C per 40 min per P0 - P7 cadaveri, 1h per P14 cadaveri, 1,5 h per P21 - P28 cadaveri e 3 ore per adulti cadaveri.
6. Ulteriore dissociazione del pituitary
   1. lavare il tessuto fisso con 10 mL di PBS, 5 cambi, 15 minuti ciascuno. Ghiandola pituitaria neonatale insieme ai relativi tessuti circostanti e il sotto dello sfenoide possono essere elaborati direttamente alla disidratazione. Tuttavia, dovrebbe essere dissociate ghiandole pituitarie dai topi più di 5 giorni più ulteriormente sotto un microscopio stereo.
   2. Mettere il tessuto fisso in un piatto di 35 mm contenente 1 mL di PBS. Per P5 - P14 cadaveri, rimuovere le membrane connettive tra i nervi e l'osso con una pinzetta e forbici e isolare accuratamente la ghiandola pituitaria insieme ai nervi di trigeminal laterale come un intero, ma lasciando il turcica di sella. La ghiandola isolata e nervi sono collegati da membrane di tessuto connettive con un " H "-l'aspetto ( Figura 1B).
   3. Per P21 e adulto cadaveri, rimuovere i nervi e tessuto connettive membrane intorno l'ipofisi e gratuito della ghiandola dai tessuti circostanti. Avvolgere il tessuto pituitario con carta velina di pulizia delle lenti e metterlo in una cassetta incasso.
      Nota: Avvolgimento l'ipofisi piccolo con carta velina di pulizia aiuta a prevenire qualsiasi potenziale perdita di esemplari e preservare l'integrità del tessuto nella seguente procedura inclusione in paraffina. Potrebbe non essere necessario per avvolgere l'ipofisi se viene elaborato in una piccola bottiglia nella procedura cryo-incorporamento.

2. Embedding e sezionamento di paraffina

1. disidratare gli esemplari in incorporamento cassette con soluzioni di etanolo di 50%, 65%, 75% e 95% per 15 minuti ciascuno. Successivamente disidratare con 3 cambi di etanolo puro, 3 min ciascuno per P0 - P4 ghiandole, 4 min ciascuno per P5 - P14 ghiandole e 5 minuti ciascuno per P21 e ghiandole più anziani. Trasparente con xilene, 3 cambia, 3 min ciascuno per P0 - P4 ghiandole, 4 min ciascuno per P5 - P14 ghiandole e 5 minuti ciascuno per P21 e ghiandole più anziani. Infiltrarsi con cera di paraffina fusa, 3 cambi, 7 min ciascuno per P0 - P4 ghiandole, e 8 min due volte seguito da 6 min una volta per P5 e più grandi ghiandole.
   Nota: I parametri ottimali per l'elaborazione del tessuto possono essere regolati empiricamente. Per ottenere sezioni di alta qualità, disidratazione insufficiente o eccedenza dovrebbe essere evitato. Lo stesso vale per la compensazione del tessuto utilizzando xilene.
2. Orientamento quando si incorpora
   1. su un tessuto che sistema console, rimuovere il campione dal cassetto e inserirlo in uno stampo base riempito a metà con cera di paraffina fusa. Corretto orientamento della ghiandola pituitaria incorporamento è essenziale per soddisfare le sezioni coronali.
   2. Per P21 e adulto ghiandole pituitarie, posizionare la ghiandola pituitaria con suo breve asse perpendicolare alla superficie di fondo di uno stampo base (il piano di sezione). Utilizzare sfenoide ossa e nervi di trigeminal come limiti anatomici per P0 - P4 e P5 - P14 cadaveri, rispettivamente. Orientare gli esemplari con i loro nervi di trigeminal o lamina trasversale delle ossa sfenoide perpendicolare alla superficie di fondo di uno stampo base.
   3. Premere delicatamente il tessuto nella posizione desiderata con una pinzetta riscaldata fino a che la cera diventa semi-solida su una piastra di raffreddamento. Riempire lo stampo con cera di paraffina fusa. Consentire il blocco di paraffina raffreddare fino a quando la cera è completamente solidificata.
      Nota: L'ipofisi al giorno embrionale 18,5 (E18.5) può essere trattata nello stesso modo come l'ipofisi neonatale. Ma i cadaveri (Rathke ' sacchetti s) più giovane di E16.5 dovrebbe essere incorporato con l'intera testa e orientato con l'asse sagittale (dalla bocca all'occipite) perpendicolare alla superficie di fondo di uno stampo base.
3. Chill il blocco di paraffina a-20 ° C per 10-20 min e poi tagliati in sottili fette (4 µm spessore è preferibile) con un microtomo. Per ottenere sezioni coronali soddisfacente, mettere a punto la posizione dei blocchi di paraffina durante il sezionamento. Montare le fette di tessuto su vetrini polilisina-rivestito per evitare il distacco delle fette nelle procedure seguenti.
   Nota: In alternativa, gli esemplari possono essere disidratati in 15%, 30% (P/V) soluzioni di saccarosio (in PBS) a 4 ° C, finché non si depositano sul fondo, incorporato in cryo-incorporamento composto utilizzando lo stesso metodo di orientamento e rapidamente congelato in ghiaccio secco. Quindi tagliare i blocchi di tessuto congelato fette di 8-10 µm utilizzando un criostato. La morfologia del cryo-sezioni, tuttavia, è spesso inferiore a sezioni di paraffina.

3. H & E macchiatura e immunofluorescenza etichettatura

1. caldo le diapositive a fuoco bloccano a 55 ° C e Sparaffinatura con xilene, 2 cambi, 4 min. Disidratare i campioni con etanolo al 95% due volte e due volte, etanolo di 75% 3 min ogni. Lavare i vetrini con acqua distillata per 5 minuti su un agitatore.
2. Per H & E colorazione, macchia le sezioni in soluzione di ematossilina di allume per 6 min, sciacquare in runnl'acqua del rubinetto ing per 2 min, differenziare con acqua ammoniaca 0,2% per 45 s e ri-sciacquare in acqua corrente per 2 min. Quindi disidratare le sezioni con etanolo al 95% per 1 min e macchia con eosina per 2 min in sequenza disidratare, chiaro e montare.
3. Immunofluorescenza etichettatura
   1. trattare le sezioni con metanolo contenente 3% H ₂ O ₂ e 0,01% NaN ₃ per 20 min a temperatura ambiente per inattivare le perossidasi endogene. Recuperare gli antigeni bollendo sezioni nel buffer di recupero (1 mM EDTA e 1 mM Tris-HCl, pH 7.4) in una pentola a pressione per 2 min. Incubare le sezioni con tampone bloccante (5% di siero di capra in PBS) per 30 min a 37 ° C.
   2. Incubare sezioni con anticorpo di coniglio anti-somatotropina (GH) (1:2, 000) o anticorpi di coniglio anti-proteina fibrillare acida (GFAP) (1:2, 000) diluiti in tampone bloccante durante la notte a 4 ° C.
   3. Incubare sezioni con anticorpo secondario (capra anti-coniglio IgG-HRP, 1: 300 in tampone bloccante) 35 min a 37 ° C.
   4. Amplificare i segnali con Biotinyl Tyramide (01:50 in soluzione salina tamponata Tris contenente 0,3% H ₂ O ₂) per 15 min a temperatura ambiente e visualizzare con streptavidina-Alexa594 o 488 (1: 300 in blocco buffer, 30 min, 37 ° C).
   5. Colorante di contrasto i nuclei con DAPI (50 mg/L in PBS) per 5 min a temperatura ambiente.
      Nota: Potrebbe non essere necessario amplificare il segnale usando il sistema di amplificazione del segnale di microarray (TSA). In alternativa, un anticorpo secondario coniugato a fluorescenza può essere utilizzato per visualizzare il segnale.
4. Acquisire immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza dotato di DAPI, Texas Red e set di filtri FITC, × 4/0,13 a × 40/0.75 obiettivi e fotocamera da 5.0 megapixel. Utilizzare il 360, 488 e 594 lunghezze d'onda laser nm per imaging DAPI, Alexa 488 - e sezioni macchiate di Alexa 594, rispettivamente. Ottimizzare la potenza del laser (0.8 è stato utilizzato generalmente) e tempo di esposizione ai livelli desiderati per ogni canale. Acquisire l'immagine sotto il controllo del software di acquisizione immagini e sovrapporre le immagini di fluorescenza successivamente utilizzando software di elaborazione immagine.

Risultati

Questo protocollo presenta un metodo per sezionare ghiandole pituitarie da topi di sviluppo. Per il mouse neonatale, le regioni di sella intera che contiene la ghiandola pituitaria, i nervi di trigeminal e la sottostante osso sfenoidale sono stati sezionati fuori dalla base del cranio. La ghiandola pituitaria piccola e delicata rimasto intatta durante il processo (Figura 1A). Per topi più di 5 giorni, le ghiandole pituitaria collegate ai nervi di trigeminal ...

Discussione

Per lo sviluppo di cadaveri murini, è stato tecnicamente difficile ottenere sezioni coronali corretto a causa della loro piccole e fragile caratteristiche e peculiarità anatomiche^6,8. Alcuni gruppi di ricerca ha così scelto sagittale sezioni per analizzare la morfologia di embrionale e neonatale pituitario^11,12. Però la sezione sagittale del pituitary è anche capace di risultati intermedi, anteriore ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tools/Equipment
Surgical scissors-straight	JinZhong	J21010	can be purchased from other vendors
Fine scissors-strainght	JinZhong	WA1010	can be purchased from other vendors
Blunt forceps	JinZhong	JD1020	can be purchased from other vendors
Fine forceps	Dumont	RS-5015	for isolation of the pituitary
26G (0.45mm) needle	HongDa		for transcardial perfusion
Syringe (1 mL)	BD	300841	can be purchased from other vendors
Syringe (10 mL)	BD		can be purchased from other vendors
35mm dish	Corning	430165	can be purchased from other vendors
Lens cleaning paper	ShuangQuan		can be purchased from other vendors
Anatomical microscope	OLYMPUS	SZX-ILLB2-200	can be purchased from other vendors
Embedding cassette	Thermo Fisher	22-272423	can be purchased from other vendors
Tissue embedding console system	KEDEE	KD-BM11	can be purchased from other vendors
Microtome	Thermo Fisher	HM315R	can be purchased from other vendors
Superfrost-Plus slides	Thermo Fisher	22-037-246	can be purchased from other vendors
Cover glass	Thermo Fisher	12-543	can be purchased from other vendors
Fluorescence microscope	OLYMPUS	BH2-RFCA	can be purchased from other vendors
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Urethane	BBI	EB0448
NaCl	Sigma	S9625	for PBS
KCl	Sigma	P9541	for PBS
Na2HPO4.12H2O	Sigma	71650	for PBS
K2HPO4	Sigma	P2222	for PBS
NaNO2	Sigma	237213
Heparin Sodium Injection	SPH	H31022051	for perfusion saline
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Ethanol	SCR	10009218
Xylene	SCR	10023418
Paraffin	Thermo Fisher	8330
Hematoxylin	Sigma	H9627	for H&E staining
Eosin Y	Sigma	E4009	for H&E staining
rabbit anti growth hormone (GH)	National Hormone		for immunostaining
antibody	Pituitary Program
Rabbit anti-mouse GFAP antibody	Sigma	G9269	for immunostaining
Goat anti-rabbit IgG, HRP	Jackson	111-035-003	for immunostaining
TSA system	NEN Life Science Products	NEL700	for immunostaining
Streptavidin, Alexa Fluor 594	Thermo Fisher	S32356	for immunostaining
Anti-FITC Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A11090	for immunostaining