JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu kağıt malzemelerin ve monosit hedefleme peptid Amfifil micelles içeren bir yöntem sunar ve Biyouyumluluk ve monosit için bağlamak için micelle yeteneğini sınamak için ilgili deneyleri.

Özet

Ateroskleroz hangi 17.3 milyon kişinin hayatına her yıl kalp-damar hastalıkları, dünya çapında, ölüm önde gelen nedenidir için büyük bir katkıda bulunuyor. Ateroskleroz da miyokard infarktüsü, rüptürü ve damar uyarmadan tıkamanın kararsız plaklardan tarafından teşvik ve ani ölüm önde gelen nedenidir. Geçerli görüntüleme yöntemleri rüptürü istikrarlı ve kararsız plaklar arasında ayırt edemez. Özellikle hastalıklı doku için bağlamak moieties hedefleyen çeşitli ile değiştirilebilir gibi peptid amphiphiles micelles (PAMs) bu dezavantaj üstesinden gelebilir. Monosit monosit büyük birikimi rüptürü eğilimli plaklar ile ilişkili olmakla birlikte ateroskleroz, erken işaretler olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, monosit hedefleyebilirsiniz nano tanecikleri ateroskleroz farklı aşamalarında ayırımcılık için kullanılabilir. Bu amaçla, biz burada, monosit hedefleme-PAMs hazırlık için bir protokol tarif (monosit chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs kendinden 15 formu nano tanecikleri için hafif koşullarda sentez yoluyla monte nm ile çapı nötr yüzey şarj yakınındaki. Vitro, PAMs Biyouyumlu bulundu ve monosit için yüksek bağlama ilgi vardı. Burada açıklanan yöntemleri ateroskleroz yanı sıra diğer inflamatuar hastalıklar geniş bir uygulama yelpazesi için umut verici.

Giriş

Kalp-damar hastalıkları önde gelen yaklaşık 17.3 milyon ölüm dünya çapında1ile tüm dünyada ölüm nedenleri olarak kalır. Kalp-damar hastalıkları ateroskleroz, hangi arterler, böylece inhibe kan ve oksijen akışı vücut2,3hücrelere plaklar inşa bir koşul tarafından katkıda bulunmuştur. Ateroskleroz ilerleme bir enflamatuar yanıt, düzensiz lipid metabolizması ve plak birikmesi, plak rüptürü ve miyokard infarktüsü4,5' e lider tarafından kalınlaşma ve damar sertliği içerir. Endotel hücreleri monosit6,7,8yüzeyinde bulunan C-C Kemokin reseptör (CCR2) bağlar MCP-1 dahil sitokinler ve adezyon molekülleri ifade. Oksitlenmiş kolesterolü monosit makrofaj için hangi bölgede inflamatuar yanıt güçlendirir ve doku yaralanması ve kararsız ya da kolay incinir plaklar9, oluşumuna yol açar plak oluşumu erken aşamasında dönüştürür 10.

Geleneksel olarak, ateroskleroz luminal stenoz anjiyografi veya ultrason11,12kullanarak anatomik görüntüleme tarafından değerlendirilmesi tarafından değerlendirilir. Ancak, bu yöntemler sadece ciddi daralma değil ateroskleroz, erken evre ve atardamar duvarının belirleyebilirsiniz arter arter büyüklüğünü korumak ve akış oranı12,13, kan remodeling ilk plak büyüme neden olur 14. Bu nedenle, Anjiyo ateroskleroz yaygınlık underrepresent. Ayrıca, noninvaziv görüntüleme teknikleri gibi tek foton emisyon tomografi, Pozitron emisyon tomografi ve manyetik rezonans görüntüleme son zamanlarda kullanılan ilk ayrıntıları sağlayabilir plak Morfoloji karakterize hesaplanan ve plaklar karakterizasyonu. Ancak, Bu modalities kez duyarlılık, Uzaysal çözünürlük, eksikliği nedeniyle sınırlıdır veya iyonizan radyasyon, görüntüleme plak ilerleme farklı aşamalarında15,16çok daha zorlu hale kullanımını gerektiren, 17. Özellikle plaklar ateroskleroz farklı aşamalarında tanımlamak görüntüleme bir dağıtım sistemi geliştirilecek kalmaya devam eder.

Nano tanecikleri vivo içinde plak hedefleme ve tanılama18,19,20,21için gelişmekte olan bir platform olmasını göstermiştir. Özellikle, PAMs onların kimyasal çeşitlilik ve moieties, besteleri, boyut, şekil ve yüzey functionalization22çeşitli uyum yeteneği nedeniyle avantajlı. "Bir hidrofobik kuyruğuna olan genellikle lipidler; bağlı bir hidrofilik, peptid headgroup" peptid amphiphiles (PAs) oluşur Bu amfifilik yapı kendi kendine montaj yetenekleri confers ve peptidler parçacık22,23,24yüzeyinde multivalent bir görünümünü sağlar. Peptid headgroups parçacık şekil katlama ve peptidler25arasında hidrojen ile etkileyebilir. β-yapraklık etkileşim yoluyla kat peptidler Helisel α onayı hem küresel ve uzun micelles22,23,24, oluşabilir iken uzun micelles, oluşturmak için gösterilmiştir 25,26,27. Hidrofilik peptid ve sistemik dolaşım28, nanopartikül kullanılabilirliği artırmanın PAMs, hidrofobik kuyruk arasında peptid yüzey ücretten kalkan polietilen glikol (PEG) halkalı yerleştirilebilir 29 , 30 , 31. Biyouyumlu ve çok çeşitli uygulamalar32,33için göstermiştir çünkü PAMs da avantajlı. Micelles su çözünürlük bazı polimerik nano tanecikleri suda çözünür olmayan ve solubilizers enjeksiyonları34için askıya zorunda gibi diğer nanoparçacık tabanlı sistemler üzerinde bir avantaj sunuyor. Ayrıca, belirli uyaranlara yanıt olarak sökmeye PAMs oluşturma yeteneği PAMs kontrollü hücre içi uyuşturucu teslim35için çekici bir aday yapar.

CCR2 reseptör bağlama ve aort içinde biriken, PAMs daha önce monosit aort9aterosklerotik lezyonların farklı aşamaları izlemek için hedefleme için geliştirilmiştir. ApoE- / - fareler monosit birikimi plak ilerleme36için orantılı olarak artar. Ayrıca, bu hastalarda rüptür eğilimli, son aşama plaklar monosit37daha yüksek miktarda içerir bulundu. Bu nedenle, PAMs MCP-1 dahil etmek için değişikliği daha fazla hedefleme özgüllük ve farklılaşma ve geç-aşamasındaki aterosklerotik lezyonları arasında izin veren bir yayın için yararlıdır. Bu kanıtı-of-concept çalışmalar Ayrıca PAMs pre-clinically kullanılmak üzere güvenli ve renally38temizlenir doğrulanmadı. Monosit ve inflamasyon karakteristik diğer hastalıklar için olduğundan, MCP-1 PAMs ateroskleroz8,39,40 ötesinde diğer hastalıkların tedavi ve teşhis uygulamalarında kullanılmak üzere potansiyel var , 41.

Burada, biz son derece ölçeklenebilir ve kendi kendine monte MCP-1 gösterdi parçacığın en uygun boyutu, yüzey ücret ve monosit ateroskleroz'Gelişmiş görüntüleme uygulamaları için seçici hedefleme PAMs imalatı raporu.

Protokol

Not: MSDS reaktifler için okumak ve tüm kimyasal güvenlik önlemleri yerel kurum tarafından gerektiği gibi izleyin.

1. MCP-1 PAMs hazırlanması

  1. MCP-1 peptid hazırlanması
    1. Fmoc-L-Lys (Boc) 0,25 mmol tartmak-Wang bir reaksiyon gemi (RV) içinde. 5 mL dimethylforamide (DMF) ile RV tarafında kimyasal duman mahallede durulayın.
    2. RV bir otomatik benchtop peptid synthesizer üzerine yükleyin. Önceden paketlenmiş amino asit şişeleri, N '- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C', c N-terminus yükleyin. Vasıl belgili tanımlık son final deprotection adım için boş bir şişe içerir.
      Not: Şifreli bir peptit dizisi, N '- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C', de sentezlenmiş aynı iletişim kuralını kullanarak.
    3. Sentezi bittiğinde, tüm reçineler transfer edilene kadar peptidler bağlı ölüm mercek şişe 2-3 mL metanol ile aktarın. Sonra reçine altına batırdı, metanol süpernatant çıkarın ve kuru kadar kalan buharlaşır. Vakum kuru bir ek 2 h için ya da gece, oda sıcaklığında.
    4. Trifluoracetic asit (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane 94:2.5:2.5:1 vol % kimyasal duman başlıklı içeren 12 mL bölünme çözüm olun. Eşit olarak karışık emin olmak için bölünme çözüm girdap.
      Dikkat: triisopropylsilane ve ethanedithiol hava duyarlı olduğundan, argon tasfiye triisopropylsilane ve ethanedithiol onları geri koyarak önce 1 dk. için hisse senedi şişeleri.
    5. Sentez taşıyıcıyı (SV) altına ZF yarısı sıkma tarafından bir kol shaker koyun. Tüm peptid reçineler transfer edilene kadar peptid-reçine SV 2 mL bölünme çözeltisi ile aktarın.
    6. Kenarlarına ZF 3 mL bölünme çözüm ile yıkayın. ZF kapağı kapatın ve 300 salınımlarını/dk 4 h için sallamak.
    7. Bir boş 50 mL santrifüj tüpü çıkarmak tartın. Kayıt kitle.
    8. 4 h sonra 50 mL santrifüj tüpüne ZF i ciddi peptid çözümden drenaj. SV birkaç kez kalan bölünme çözüm ile yıkayın.
    9. Santrifüj tüpte kalan daha az 4 mL kadar i ciddi peptid çözüm ile azot buharlaşır.
    10. Buz gibi eter 36 mL peptid i ciddi ekleyin.
    11. Girdap bu kadar tamamen beyaz veya sarı bir çözümdür. 3000 x g 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatle boşaltmak.
    12. 40 mL buz gibi eter tüp ekleyin. Girdap ve tekrar solüsyon içeren temizleyicide. Santrifüjü işlemi yineleyin. Süpernatant dikkatle boşaltmak.
    13. Eter gözle görülür buharlaşan kadar azot gaz tasfiye ile ham PA Pelet kuru.
    14. 20 mL çift distile ekleyin su, girdap ve peptid çözümde tamamen eriyene kadar solüsyon içeren temizleyicide.
    15. Don eriyik ve kuru kadar lyophilize.
    16. Bir kez peptid kurutulur, ham peptid içeren santrifüj tüpü kitle tartın. Ham peptid 5 mg/mL suda çözülür.
    17. Ham MCP-1 peptid toplam konsantrasyonu 5 mg/mL 5 mL çift distile su içinde 25 mg geçiyoruz. %0.1 TFA su (a solvent) ve % 0.1 kullanarak ham MCP-1 peptid yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) tarafından arındırmak TFA Asetonitril (solvent B) bir C8 ters fazlı sütunda mobil aşamaları olarak. Peptid 5 mL HPLC enjekte.
      Not: A 9.0 mL/dak akış hızında azalma çözücü A yavaş yavaş %30 27 min için ve bu kompozisyon 3 dk. dönüş % 100 solvent degradeye tutmak % 100 solvent ilk mobil faz oluşan bir 3 dk ve bu kompozisyon için vermek 1 dk at tutun bir toplam çalışma-saat 34 dk. tutun sütun sıcaklığı 55 ° C'de Pozitif İyon kaynağı modu analizi için kullanın. TFA HPLC sütun için çok asittir formik asit TFA yerine kullanılabilir. Bu organik çözücü kompozisyon rampa hız 2%/min daha iyi ayrılması için aşmaması gerektiğini tavsiye edilir.
    18. Beklenen ürün m/z 2,890 adlı için matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma (maldı) kütle spektrometresi kullanılarak her fraksiyonu analiz.
      Not: α-cyano-4-hydroxycinnamic asit 1 mg/mL Asetonitril/su (50: 50 vol %), matris çözüm olarak geçiyoruz. Matris çözüm her kesir 0,75 µL tarafından takip maldı plaka üzerine 0,75 µL nokta. 500-5000 Da toplu bir mesafeden bir pozitif yansıtıcı iyon modu kullanılarak analiz gerçekleştirmek.
    19. Ürün kesirler birleştirmek, Asetonitril darbe donma ve arıtılmış peptidler kadar kuru lyophilize.
  2. MCP-1 PA hazırlanması
    1. 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000)-maleimide peptid ayrı mercek şişeleri için 1.1 molar fazlalığı hazırlayın. Her iki bileşikler yapmak için çift distile su içinde erimesi ~ 15 mg/mL. 15 dakika veya her iki çözüm de tamamen berraklaşana kadar solüsyon içeren temizleyicide.
      Not: Nerede çözüm pH 8,5 için ayarlanır DSPE-PEG (2000)-Amin ve N-hydroxysuccinimide (NHS) ester functionalized Cy5, adım 1.2.3, dışında aynı iletişim kuralını kullanarak DSPE-PEG (2000)-Cy5 sentezlenir.
    2. DSPE-PEG (2000)-maleimide çözüm peptid ekleyin. Girdap ve solüsyon içeren temizleyicide.
    3. 1 ekleyin M NaOH dropwise (1 µL) çözüm pH 7 kadar bir zamanda.
    4. Azot tasfiye çözüm 5 dakika süreyle gecede çözüm karıştırın.
    5. Don eriyik ve kuru kadar lyophilize.
    6. Bir kez ham ürün kurutulur, katı 5 mg/mL suda çözülür.
    7. HPLC ile yukarıda açıklandığı gibi arındırmak.
      Not: Çekimsiz peptid ve DSPE-PEG(2000) arasında % 15-30 organik konsantrasyonu (vol %), DSPE-PEG elute (2000)-MCP-1 eşlenik % 40-50 arasında organik konsantrasyon elute.
    8. Karşılık gelen m/z. DSPE-PEG (2000)-MCP-1-meli-si olmak geniş m/z tepe 5,760 maldı kütle spektrometresi kullanıyorum her fraksiyonu analiz.
      Not: 2,5-dihidroksibenzoik asit en iyi matris DSPE-PEG için (2000)-MCP-1 maldı ile kullanılır.
  3. MCP-1 PAMs Meclisi
    1. Dağıtılması 1,75 mg 3 mL metanol içinde 1-Dramı şişe ile MCP-1 PAs. MCP-1 PA tamamen eriyene kadar solüsyon içeren temizleyicide.
      Not: Cy5 amphiphiles 10:90 MCP-1 PA görüntüleme uygulamaları için molar oranını, dahil edilebilir.
    2. Metanol azot dairesel bir hareketle altında tek tip bir film şişe dibinde oluşan kadar şişe yan kalan metanol durulama sırasında buharlaşır. Vakum-Kuru filmin gecede.
    3. Film 3 mL su veya fosfat tampon ile hidrat serum (PBS) MCP-1 PAMs bir 100 µM çözüm yapmak. Yavaşça girdap ve temiz kadar çözüm solüsyon içeren temizleyicide. 30 dk 80 ° C'de kuluçkaya.
      Not: Yüksek sıcaklık kendinden montajlı süreci hızlandırmak için gösterilmiştir ve kritik micelle konsantrasyonu (CMC)42,43düşürürken en istikrarlı ikincil yapı oluşturmak peptit bileşeni sağlar.
    4. Elde edilen dağılımı oda sıcaklığında için ne yapıyorsun?

2. MCP-1 PAMs karakterizasyonu

  1. Dinamik ışık saçılma (DL) ve zeta potansiyel
    1. Yer 100 µM MCP-1 PAM veya DLS veya zeta potansiyel enstrümanın talimatlara göre bir küvet içinde şifreli PAM.
      Not: DLS ve zeta potansiyel cuvettes gerecin yönergeler bağlı farklı olabilir.
    2. Oda sıcaklığına enstrüman equilibrate. PAM in yüzey fiyat istemek ve boyutu ölçmek.
  2. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM)
    1. 7 µL eklemek 50 µM MCP-1 PAM veya şifreli PAM TEM ızgara üzerine kendi kendine kapanan bir cımbız 5 dk. fitil uzakta içinde damlacık bir hassas görev bezle askıya alındı.
    2. 7 µL kılavuz yıkamak için su ekleyin. Uzak damlacığı fitil.
    3. 1 wt % phosphotungstic asit 2 dk. fitil uzakta için 7 µL damlacığı ekleyin. 2.2.2 arasındaki adımları yineleyin.
    4. TEM kılavuz TEM analiz önce kuru.
  3. Dairesel dichroism (CD) spektroskopisi
    1. 5-10dk için azot aracı kullanmak için önceden açın.
    2. Boş (su veya PBS) 300 µL küvet içinde yerleştirin.
    3. Spectra 190-265 nm, 0.2 mm yol-uzunluğu 1 s entegrasyon zaman ve oda sıcaklığında bir 1 nm bant genişliği ile ölçmek. 3 çoğaltır toplamak.
    4. Ölçü 100 µM MCP-1 peptid, MCP-1 PAM, peptid şifreli ve PAM 2.3.3. adımda açıklanan aynı koşul altında şifreli. Boş çıkarma.
    5. Polylysine temel spectra ürününün bir doğrusal ilişkilendirme kullanarak veri uygun.
    6. Araç dön. Azot açmadan önce 10 dakika bekleyin.

3. MCP-1 PAMs Vitro analiz

  1. Vitro Biyouyumluluk
    1. Kültür ve WEHI 274.1 Dulbecco'nın modifiye kartal % 10 fetal sığır serum ile (FBS), takıma orta fare monosit genişletin % 1 penisilin-streptomisin ve 37 ° c altında %5 0.05 mM 2-mercaptoethanol CO2 ' ye geçiş 5.
      Not: WEHI 274.1 hücreler süspansiyon. Ne zaman kültür, medya her 2-3 gün doldurulan.
    2. Damlalıklı monosit medya steril 50 mL santrifüj tüpü içine. 4 ° C'de 5 min için 300 x g, santrifüj
    3. Eski medya Aspire edin ve 10 mL taze medyada santrifüj tüpüne resuspend. Hücreler eşit şekilde medyada dağıtılır kadar yavaş yavaş karıştırın. Trypan mavi boyama ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
    4. Böyle medya iyi başına 90 µL başına 4.000 monosit hücreleri oranında seyreltin. Hücre 90 µL 96-şey plaka wells ekleyin. 24 saat kuluçkaya.
      Not: buharlaşma farklılıkları ve plaka ısı değişiklikleri önlemek için plaka dış kenarında kuyuları kullanmaktan kaçının. Dış kuyu 100 µL PBS ile doldurun.
    5. MCP-1 peptid, MCP-1 PAM, şifreli peptid veya 150 µL PBS ayrı, steril microcentrifuge tüpler şifreli PAM 0.15 µmol geçiyoruz. 1, 10 ve 100 µM her örneğinin 65 µL yapmak için seri seyreltme gerçekleştirin.
    6. 10 µL PBS her konsantrasyon WEHI 274.1 içeren wells ekleyin (Toplam birim: şey, 6 satır, 96 toplam kuyu başına 100 µL). 72 h için kuluçkaya.
    7. Eklemek 10 µL (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) her şey içinde. 1s için kuluçkaya.
    8. 490 bir plaka okuyucu kullanarak Absorbans analiz nm veya üreticinin yönergeleri dayalı.
  2. Vitro micelle bağlama
    1. 6-şey plaka 2 ml 100 µM Cy5 etiketli MCP-1 PAM (10:90 molar oranı DSPE-PEG (2000)-Cy5 ve MCP-1 PA) içeren medya her iyi tohum 500.000 monosit. 1s için kuluçkaya.
    2. Santrifüjü 300 x g 4 ° C'de 5 min için de tarafından WEHI 274.1 toplamak Medya Aspire edin.
    3. Resuspend ve 2 mL PBS hücrelerde yıkayın. 4 ° C'de 5 min için 300 x g, santrifüj PBS Aspire edin. 2 mL PBS ile yıkama işlemi tekrarlayın. PBS Aspire edin.
    4. Hücreleri düzeltmek için soğuk % 4 paraformaldehyde 2 mL ekleyin. 10 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    5. Damlalıklı steril cam coverslip 6-şey plaka kuyu içinde üzerine sabit hücreleri. 400 x g 5 min için de santrifüj kapasitesi.
    6. Paraformaldehyde kaldırın. Yıkama ve durulama 2 mL PBS ile bir kez. 1 mL PB ile resuspend
      Not: durulama, coverslip hücrelerdeyse engellemeden kaçının.
    7. % 90 gliserol 10 µL PBS içinde bir slayt koy. Bir iğne ve cımbız coverslip kadar almak için kullanın. Coverslip kenarına kuru. Yavaşça coverslip bir slayt üzerine yerleştirin yüzü koyun.
    8. Yavaşça kenarına açık oje ile coverslip kapatın. Görüntüleme için hazır kadar buzdolabında yerleştirin.
    9. Confocal bir lazer lazerler ile Cy5 için λuyarma yüklü mikroskop (CLSM) tarama kullanın = 650 nm.

Sonuçlar

MCP-1 PAM hazırlanması
MCP-1 protein [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] veya şifreli peptid [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] CCR2-bağlama motif (artıkları 13-35) N-terminus üzerinde bir sistein kalıntı ekleyerek güncellenmiştir. MCP-1 peptid bir Fmoc-aracılı katı faz yöntemiyle bir otomatik peptid synthesizer kullanarak sentez. Ham peptid ters fazlı HPLC C8 sütun kullanarak %0,1 50 ° C'de tarafından saflaştırıldı TFA Asetonitril/su karışımları ve maldı kütl...

Tartışmalar

MCP-1 PAMs bir hidrofilik hedefleme peptid ve nanoparçacık kendi kendine monte doğası sürücüler hidrofobik kuyruk oluşan bir umut verici moleküler görüntüleme platformu vardır. Bu monosit hedefleme micelle basit sentez ve arıtma adımlardan MCP-1 peptid ve DSPE-PEG (2000)-MCP-1 tarafından hazırlanmış olabilir. PAMs vivo içinde gibi moleküler görüntüleme için birçok yararlı özelliklere sahip kendi kendinden montajlı altında hafif koşulları, iç biodegradability ve yapısal ve kimyas...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar mali desteği ile University of Southern California, ulusal kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (NHLBI), R00HL124279, Eli ve Edythe geniş inovasyon ödülü ve L.K. Whittier Vakfı sigara kanser kabul etmek istiyorum EJC için verilen translasyonel araştırma ödülü. Yazarlar Merkezi elektron mikroskobu ve Microanalysis, Center of Excellence NanoBiophysics içinde Center of Excellence için moleküler karakterizasyonu ve Translational görüntüleme Merkezi, University of Southern California için yardım için teşekkür ederiz enstrümantal kurulumları.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-ethanedithiolVWRE0032for peptide synthesis
10 mL disposable serological pipetsVWR89130-898for cell culture
15 mL centrifuge tubes, polypropyleneVWR89401-566for various applications
2,5-dihydroxybenzoic acid, 99%Fisher ScientificAC165200050for MALDI
25 mL disposable serological pipetsVWR89130-900for cell culture
2-Mercaptoethanol, 50 mMThermoFisher Scientific31350010for cell culture
5 mL disposable serological pipetsVWR89130-896for cell culture
50 mL centrifuge tubesVWR89039-658for various applications
75 cm2 culture flaskFisher Scientific13-680-65for cell culture
75 mL reaction vesselProtein Technologies3000005for peptide synthesis
96-wells cell culture plateVWR40101-346for MTS assay
Acetonitrile, HPLC gradeFisher ScientificA998SK-4for HPLC purification
Borosilicate glass, 1 dramVWR66011-041for PAM synthesis
Borosillicate glass pipet, Long tipsVWR14673-043for various applications
Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mmFisher Scientific12-542Bfor confocal microscopy
Cy5 amineAbcamab146463for peptide conjugation
Diethyl ether, ACS gradeFisher ScientificE138-1for peptide precipitation
Disposable syringes, 20 mLFisher Scientific14-817-54for HPLC purification
Double neubauer ruled hemocytometerVWR63510-13for cell counting
DSPE-PEG(2000) amineAvanti880128Pfor peptide conjugation
DSPE-PEG(2000) maleimideAvanti880126Pfor peptide conjugation
DSPE-PEG(2000)-NHS ester NanocsPG2-DSNS-10Kfor conjugation to Cy5
Dulbecco's modified eagle medium-high glucoseSigma AldrichD5796-500MLfor cell culture
Fetal bovine serum, qualified, heat inactivatedThermoFisher Scientific10438026for cell culture
Fmoc-L-Ala-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Afor peptide synthesis
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-RBFfor peptide synthesis
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-NTfor peptide synthesis
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-CTfor peptide synthesis
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-QTfor peptide synthesis
Fmoc-L-Ile-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Ifor peptide synthesis
Fmoc-L-Leu-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Lfor peptide synthesis
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-KBCfor peptide synthesis
Fmoc-L-Phe-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Ffor peptide synthesis
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-SBfor peptide synthesis
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-TBfor peptide synthesis
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-YBfor peptide synthesis
Fmoc-L-Val-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Vfor peptide synthesis
Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 meshNovabiochem856013for peptide synthesis
Formic acid, optima LC/MS gradeFisher ScientificA117-50for HPLC purification
GlycerolVWRM152-1Lfor confocal microscopy
Hand tally counterFisher ScientificS90189for cell counting
Magnetic stir bars, egg-shapedVWR58949-006for peptide conjugation
Methanol, ACS certifiedFisher ScientificA412-4for PAM synthesis
MTS cell proliferation colorimetric assay kitVWR10191-104for MTS assay
N,N-Dimethylformamide, sequencing gradeFisher ScientificBP1160-4for peptide synthesis
N-MethylmorpholineProtein TechnologiesS-1L-NMMfor peptide synthesis
ParaformaldehydeFisher ScientificAC416780250for fixing cells
PBS, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010049for various applications
Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mLThermoFisher Scientific15140122for cell culture
Peptide synthesis vessel, 25 mL Fisher ScientificCG186011for peptide synthesis
Phosphotungstic acid Fisher ScientificA248-25for TEM
PiperidineSpectrumP1146-2.5LTGLfor peptide synthesis
Plain glass microscope slide 75 x 25 mmFisher Scientific12-550-A3for confocal microscopy
Reagent reservoirs, sterile VWR95128093for cell culture
Self-closing tweezerTedPella515for TEM
TEM support filmTedPella01814Ffor TEM
Trifluoroacetic acid Fisher ScientificBP618-500for peptide cleavage and HPLC purification
TriisopropylsilaneVWRTCT1533-5mlfor peptide cleavage
Trypan blue solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061for cell counting
Tweezer, general purpose-serratedVWR231-SA-SEfor confocal microscopy
WEHI-274.1ATCCATCC CRL-1679murine monocyte
automated benchtop peptide synthesizerProtein TechnologiesPS3 Benchtop Peptide Synthesizer
α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99%Sigma Aldrich476870-2Gfor MALDI

Referanslar

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
  2. Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12 (2006).
  3. Rahmani, M., Cruz, R. P., Granville, D. J., McManus, B. M. Allograft Vasculopathy Versus Atherosclerosis. Circ. Res. 99 (8), 801-815 (2006).
  4. Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
  5. Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature (London, U. K). 473 (7347), 317-325 (2011).
  6. Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature (London). 394 (6696), 894-897 (1998).
  7. Szmitko, P. E., et al. New Markers of Inflammation and Endothelial Cell Activation. Circulation. 108 (16), 1917-1923 (2003).
  8. Deshmane, S. L., Kremlev, S., Amini, S., Sawaya, B. E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. J. Interferon Cytokine Res. 29 (6), 313-326 (2009).
  9. Chung, E. J., et al. Monocyte-Targeting Supramolecular Micellar Assemblies: A Molecular Diagnostic Tool for Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (3), 367-376 (2015).
  10. Chung, E. J. Targeting and therapeutic peptides in nanomedicine for atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 891-898 (2016).
  11. Sanz, J., Fayad, Z. A. Imaging of atherosclerotic cardiovascular disease. Nature (London, U. K.). 451 (7181), 953-957 (2008).
  12. Tarkin, J. M., et al. Imaging Atherosclerosis. Circ. Res. 118 (4), 750-769 (2016).
  13. Hennerici, M., Baezner, H., Daffertshofer, M. Ultrasound and arterial wall disease. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 19-33 (2004).
  14. Nissen, S. E. Application of intravascular ultrasound to characterize coronary artery disease and assess the progression or regression of atherosclerosis. Am J Cardiol. 89 (4A), 24B-31B (2002).
  15. Khalil, M. M., Tremoleda, J. L., Bayomy, T. B., Gsell, W. Molecular SPECT Imaging: An Overview. Int J Mol Imaging. 2011, 796025 (2011).
  16. Lerakis, S., et al. Imaging of the vulnerable plaque: noninvasive and invasive techniques. Am J Med Sci. 336 (4), 342-348 (2008).
  17. Sun, Z. H., Rashmizal, H., Xu, L. Molecular imaging of plaques in coronary arteries with PET and SPECT. J Geriatr Cardiol. 11 (3), 259-273 (2014).
  18. Godin, B., et al. Emerging applications of nanomedicine for the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases. Trends Pharmacol. Sci. 31 (5), 199-205 (2010).
  19. Branco de Barros, A. L., Tsourkas, A., Saboury, B., Cardoso, V. N., Alavi, A. Emerging role of radiolabeled nanoparticles as an effective diagnostic technique. EJNMMI Res. 2 (1), 31-39 (2012).
  20. Jayagopal, A., Linton, M. F., Fazio, S., Haselton, F. R. Insights into atherosclerosis using nanotechnology. Curr. Atheroscler. Rep. 12 (3), 209-215 (2010).
  21. Khodabandehlou, K., Masehi-Lano, J. J., Poon, C., Wang, J., Chung, E. J. Targeting cell adhesion molecules with nanoparticles using in vivo and flow-based in vitro models of atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 242 (8), 799-812 (2017).
  22. Trent, A., Marullo, R., Lin, B., Black, M., Tirrell, M. Structural properties of soluble peptide amphiphile micelles. Soft Matter. 7 (20), 9572-9582 (2011).
  23. Hartgerink, J. D., Beniash, E., Stupp, S. I. Peptide-amphiphile nanofibers: A versatile scaffold for the preparation of self-assembling materials. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (8), 5133-5138 (2002).
  24. Missirlis, D., et al. Effect of the Peptide Secondary Structure on the Peptide Amphiphile Supramolecular Structure and Interactions. Langmuir. 27 (10), 6163-6170 (2011).
  25. Zhong, L., Johnson, W. C. Environment affects amino acid preference for secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (10), 4462-4465 (1992).
  26. Shimada, T., Lee, S., Bates, F. S., Hotta, A., Tirrell, M. Wormlike Micelle Formation in Peptide-Lipid Conjugates Driven by Secondary Structure Transformation of the Headgroups. J. Phys. Chem. B. 113 (42), 13711-13714 (2009).
  27. Missirlis, D., et al. Linker Chemistry Determines Secondary Structure of p5314-29 in Peptide Amphiphile Micelles. Bioconjugate Chem. 21 (3), 465-475 (2010).
  28. Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu. Rev. Mater. Sci. 26, 365-394 (1996).
  29. Xue, Y., O'Mara, M. L., Surawski, P. P. T., Trau, M., Mark, A. E. Effect of Poly(ethylene glycol) (PEG) Spacers on the Conformational Properties of Small Peptides: A Molecular Dynamics Study. Langmuir. 27 (1), 296-303 (2011).
  30. Canalle, L. A., Loewik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Polypeptide-polymer bioconjugates. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 329-353 (2010).
  31. Hamley, I. W. PEG-Peptide Conjugates. Biomacromolecules. 15 (5), 1543-1559 (2014).
  32. Acar, H., et al. Self-assembling peptide-based building blocks in medical applications. Adv. Drug Delivery Rev. , (2016).
  33. Busseron, E., Ruff, Y., Moulin, E., Giuseppone, N. Supramolecular self-assemblies as functional nanomaterials. Nanoscale. 5 (16), 7098-7140 (2013).
  34. Barrett, J. C., et al. Modular Peptide Amphiphile Micelles Improving an Antibody-Mediated Immune Response to Group A Streptococcus. ACS Biomater. Sci. Eng. 3 (2), 144-152 (2017).
  35. Toughrai, S., et al. Reduction-Sensitive Amphiphilic Triblock Copolymers Self-Assemble Into Stimuli-Responsive Micelles for Drug Delivery. Macromol. Biosci. 15 (4), 481-489 (2015).
  36. Swirski, F. K., et al. Monocyte accumulation in mouse atherogenesis is progressive and proportional to extent of disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (27), 10340-10345 (2006).
  37. Kashiwagi, M., et al. Association of monocyte subsets with vulnerability characteristics of coronary plaques as assessed by 64-slice multidetector computed tomography in patients with stable angina pectoris. Atherosclerosis (Amsterdam, Neth). 212 (1), 171-176 (2010).
  38. Chung, E. J., Tirrell, M. Recent Advances in Targeted, Self-Assembling Nanoparticles to Address Vascular Damage Due to Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (16), 2408-2422 (2015).
  39. Cassetta, L., Pollard, J. W. Cancer immunosurveillance: role of patrolling monocytes. Cell Res. 26 (1), 3-4 (2016).
  40. Williams, C. B., Yeh, E. S., Soloff, A. C. Tumor-associated macrophages: unwitting accomplices in breast cancer malignancy. NPJ Breast Cancer. 2, (2016).
  41. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and Macrophages in Cancer: Development and Functions. Cancer Microenviron. 6 (2), 179-191 (2013).
  42. Schick, M. J. Effect of temperature on the critical micelle concentration of nonionic detergents. Thermodynamics of micelle formation. J. Phys. Chem. 67 (9), 1796-1799 (1963).
  43. Marullo, R., Kastantin, M., Drews, L. B., Tirrell, M. Peptide contour length determines equilibrium secondary structure in protein-analogous micelles. Biopolymers. 99 (9), 573-581 (2013).
  44. Hilbich, C., Kisters-Woike, B., Reed, J., Masters, C. L., Beyreuther, K. Substitutions of hydrophobic amino acids reduce the amyloidogenicity of Alzheimer's disease βA4 peptides. J. Mol. Biol. 228 (2), 460-473 (1992).
  45. Trevino, S. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. Amino Acid Contribution to Protein Solubility: Asp, Glu, and Ser Contribute more Favorably than the other Hydrophilic Amino Acids in RNase Sa. J. Mol. Biol. 366 (2), 449-460 (2007).
  46. Kim, S. W., Shi, Y. Z., Kim, J. Y., Park, K. N., Cheng, J. X. Overcoming the barriers in micellar drug delivery: Loading efficiency, in vivo stability, and micelle-cell interaction. Expert Opin Drug Delivery. 7 (1), 49-62 (2010).
  47. Rangel-Yagui, C. O., Pessoa, A., Tavares, L. C. Micellar solubilization of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 8 (2), 147-163 (2005).
  48. Batrakova, E., et al. Fundamental relationships between the composition of pluronic block copolymers and their hypersensitization effect in MDR cancer cells. Pharm. Res. 16 (9), 1373-1379 (1999).
  49. Chen, L. J., Lin, S. Y., Huang, C. C. Effect of Hydrophobic Chain Length of Surfactants on Enthalpy-Entropy Compensation of Micellization. J. Phys. Chem. B. 102 (22), 4350-4356 (1998).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendisliksay 129monositpeptidmicellesateroskleroznanopartik lg r nt lemekendinden montajl tan

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır