JoVE Logo
Auteurs
Contactez-nous

S'identifier

Un abonnement à JoVE est nécessaire pour voir ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre essai gratuit.

Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Cet article présente une méthode impliquant la synthèse et la caractérisation de monocyte-ciblage des micelles peptide amphiphile et le correspondant d’essais pour tester la biocompatibilité et la capacité de la micelle de liaison aux monocytes.

Résumé

L’athérosclérose est un facteur majeur de maladies cardio-vasculaires, la principale cause de décès dans le monde, que réclame 17,3 millions de vies chaque année. L’athérosclérose est également la principale cause de mort subite et infarctus du myocarde, fomentées par des plaques instables qui se rompent et bloquer le vaisseau sanguin sans avertissement. Courant de modalités d’imagerie ne peut pas différencier entre les plaques stables et instables qui se rompent. Micelles de peptides amphiphiles (PAMs) peuvent surmonter cet inconvénient car ils peuvent être modifiés avec une variété de ciblage des moitiés qui se lient spécifiquement à des tissus malades. Monocytes montrent à des marqueurs précoces de l’athérosclérose, tandis que la forte accumulation de monocytes est associée à plaques sujettes à la rupture. Par conséquent, des nanoparticules qui peuvent cibler des monocytes peuvent servir à discriminer les différentes étapes de l’athérosclérose. À cette fin, nous décrivons ici un protocole pour la préparation de monocyte-ciblage PAMs (monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs sont self-assembled par l’intermédiaire de synthèse dans des conditions douces aux nanoparticules forme de 15 nm de diamètre, avec près de charge surface neutre. In vitro, PAMs se sont avérées biocompatibles et avait une affinité élevée pour les monocytes. Les méthodes décrites dans les présentes sont prometteuses pour un large éventail d’applications dans l’athérosclérose ainsi que d’autres maladies inflammatoires.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires restent les principales causes de décès dans le monde avec environ 17,3 millions de décès dans le monde1. Les maladies cardiovasculaires sont fournis par l’athérosclérose, une affection dans laquelle les plaques s’accumuler dans les artères, le sang ainsi inhiber et le débit d’oxygène aux cellules du corps2,3. La progression de l’athérosclérose implique l’épaississement et le durcissement des artères par une réaction inflammatoire, métabolisme lipidique irréguliers et la formation de plaques, conduisant à la plaque risque de rupture ou d’infarctus du myocarde,4,5. Les cellules endothéliales expriment des molécules de cytokines et d’adhérence, incluent des MCP-1 qui se lie au récepteur des chimiokines C-C (CCR2) à la surface des monocytes6,7,8. Cholestérol oxydé convertit monocytes macrophages durant les premiers stades de formation de la plaque, qui amplifie la réponse inflammatoire dans la région et conduit à la lésion des tissus et la formation de plaques instables ou vulnérables9, 10.

Traditionnellement, l’athérosclérose est évaluée en évaluant la sténose luminale par imagerie anatomique à l’aide d’ultrasons ou angiographie11,12. Cependant, ces méthodes ne peuvent déterminer un rétrécissement sévère de la paroi artérielle et pas le stade précoce de l’athérosclérose, car la croissance initiale plaque entraîne un remodelage artériel maintenir la taille de l’artère et le sang écoulement tarifaire12,13, 14. Par conséquent, les angiogrammes sous-représenter la prévalence de l’athérosclérose. En outre, les techniques d’imagerie non invasives comme une émission de photon unique calculé tomographie, tomographie par émission de positons et l’imagerie par résonance magnétique ont récemment été utilisées pour caractériser la morphologie de la plaque car ils peuvent fournir des détails initiaux et caractérisation des plaques. Toutefois, ces modalités sont souvent limitées par le manque de sensibilité, résolution spatiale, ou exigent l’utilisation de rayonnements ionisants, rendant la progression plaque d’imagerie à des stades différents, beaucoup plus difficile de15,16, 17. Un système d’imagerie permettant d’identifier plus précisément les plaques à différents stades de l’athérosclérose reste à développer.

NANOPARTICULES ont montré pour être une plate-forme émergente pour in vivo plaque ciblage et diagnostics18,19,20,21. En particulier, PAMs sont avantageuse en raison de leur diversité chimique et de la capacité d’accueillir une variété de moitiés, compositions, tailles, formes et fonctionnalisation de surface22. Peptides amphiphiles (Fe) se composent d’un peptide « tête hydrophile, » attaché à une queue hydrophobe, qui sont généralement des lipides ; Cette structure amphiphile confère des capacités de l’auto-assemblage et permet un affichage multivalent des peptides sur la surface des particules22,23,24. Le peptide polaires peuvent influer sur la forme des particules par le biais de pliage et de liaisons hydrogènes entre les peptides25. Les peptides qui se replient grâce à l’interaction de feuillet β auraient dû être divulgués afin de former des micelles allongés, tandis que α-hélicoïdale confirmation peut former deux micelles sphériques et allongée22,23,24, 25,26,27. Linkers de polyéthylène glycol (PEG) qui protègent la charge superficielle du peptide peuvent être placés entre le peptidiques hydrophiles et la queue hydrophobe de PAMs, améliorer l’accessibilité de la NANOPARTICULE dans la circulation systémique28, 29 , 30 , 31. PAMs sont aussi avantageuses car elles sont biocompatibles et auraient dû être divulgués d’avoir un large éventail d’applications32,,33. Solubilité dans l’eau des micelles offre un avantage sur les autres systèmes à base de nanoparticules comme certaines nanoparticules polymériques qui ne sont pas solubles dans l’eau et ont dû être suspendu en solubilisants pour injections34. En outre, la possibilité de créer des PAMs qui démonter en réponse à un stimulus spécifique fait PAMs un candidat attrayant pour drogue intracellulaire contrôlée livraison35.

En se liant au récepteur CCR2 et qui s’accumulent dans la crosse aortique, PAMs ont été développées précédemment monocyte visant à surveiller les différents stades de lésions athéroscléreuses dans l' aorte9. Chez les souris- / - de l’ApoE, accumulation de monocytes augmente proportionnellement à la plaque progression36. En outre, il a été constaté que les patients avec des plaques sujettes à rupture, stades contiennent des quantités plus élevées de monocytes37. Par conséquent, la modification des PAMs d’incorporer des MCP-1 est utile car il permet une plus grande précision de ciblage et de différencier les lésions athéroscléreuses et fin-début. Ces études de validation a également vérifié que PAMs sont suffisamment sûres pour être utilisé en préclinique et sont effacées insuffisants38. Monocytes et l’inflammation étant caractéristique à d’autres maladies, MCP-1 PAMs ont le potentiel d’être utilisé pour des applications thérapeutiques et diagnostiques dans d’autres maladies au-delà de l’athérosclérose8,39,40 , 41.

Ici, nous rapportons la fabrication de hautement évolutif et auto-assemblés PAMs de MCP-1 qui fait preuve de la particule taille optimale, charge superficielle et ciblage sélectif aux monocytes pour des applications d’imagerie dans l’athérosclérose.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

Remarque : Lire la fiche signalétique pour réactifs et suivre toutes les mesures de sécurité chimique tel que requis par l’institution locale.

1. préparation du MCP-1 PAMs

  1. Préparation du peptide de MCP-1
    1. Peser 0,25 mmol de Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang dans un réacteur (RV). Rincez le côté de la RV avec 5 mL de dimethylforamide (DMF) sous une hotte chimique.
    2. Charger le RV sur un synthétiseur de peptide de benchtop automatisé. Flacons d’acides aminés charge préemballé, N « - CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C », de la C à l’extrémité N-terminale. Comprend un flacon vide à la fin de l’étape finale de déprotection.
      Remarque : Un peptide brouillé avec séquence, N « - CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C », peut aussi être synthétisé en utilisant le même protocole.
    3. Synthèse terminée, transférer les peptides sur résine de la RV dans le flacon à scintillation avec 2-3 mL de méthanol jusqu'à ce que toutes les résines sont transférées. Après que la résine a coulé vers le bas, retirez le surnageant de méthanol et évaporer le restant à sec. Aspirateur sec pendant 2 h supplémentaires, ou toute la nuit à température ambiante.
    4. Faire 12 mL de solution clivage composé acide (TFA) :ethanedithiol:water:triisopropylsilane à 94:2.5:2.5:1 % en volume dans une hotte chimique. Agiter la solution de clivage pour s’assurer que c’est mélangé uniformément.
      ATTENTION : Triisopropylsilane et éthanedithiol étant sensible à air, argon purge des flacons stocks de triisopropylsilane et éthanedithiol pendant 1 min avant de les remettre.
    5. Placer le récipient de synthèse (SV) sur un agitateur de bras de serrage au bas de la moitié de la SV. Transférer le peptide-résine à la SV avec 2 mL de solution de clivage jusqu'à ce que tous les adsorbants sont transférés.
    6. Laver les côtés de la SV avec 3 mL de solution de clivage. Fermez le bouchon de la SV et l’agiter à 300 oscillations/min pendant 4 h.
    7. Peser avec un tube de centrifugation de vide de 50 mL. Enregistrement de la messe.
    8. Après 4 h, vider la solution de peptide clivés de la SV dans le tube de centrifuger de 50 mL. Rincer la SV plusieurs fois avec la solution restante de clivage.
    9. Évaporer le peptide clivées solution avec de l’azote jusqu'à ce qu’il y a moins de 4 mL restant dans le tube à centrifuger.
    10. Ajouter 36 mL d’éther glacé à la solution de peptide clivée.
    11. Vortex la solution jusqu'à ce qu’il est complètement blanc ou jaune. Centrifuger à 3 000 x g pendant 5 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
    12. Ajouter 40 mL éther glacée dans le tube. Vortex et laisser agir à nouveau. Répétez le processus de centrifugation. Décanter le liquide surnageant.
    13. Sécher le culot PA brut avec azote gaz purge jusqu'à ce que l’éther est visiblement évaporé.
    14. Ajouter 20 mL bidistillée, vortex, l’eau et laisser agir jusqu'à ce que le peptide est complètement dissous dans la solution.
    15. Congeler la solution et lyophiliser jusqu’au sec.
    16. Une fois que le peptide est séché, peser la masse du tube à centrifuger contenant le peptide brut. Dissoudre le peptide brut à 5 mg/mL d’eau.
    17. Dissoudre 25 mg de peptide de MCP-1 brut dans 5 mL d’eau bidistillée à une concentration totale de 5 mg/mL. Purifier le peptide de MCP-1 brut par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) à l’aide de 0,1 % TFA dans de l’eau (solvant A) et 0,1 % TFA dans l’acétonitrile (solvant B) comme des phases mobiles sur une colonne en phase inversée C8. Injecter les 5 mL du peptide dans la CLHP.
      Remarque : La phase mobile initiale était composé de 100 % de solvant A un débit de 9,0 mL/min. diminuer le solvant A lentement à 30 % en 27 min et le tenir à cette composition pendant 3 min. retour du gradient à 100 % de solvant un plus 3 min et maintenez à cette composition pendant 1 min donner une exécution totale de 34 min. maintenir la température de la colonne à 55 ° C. Utiliser le mode de source d’ions positifs pour l’analyse. L’acide formique peut être utilisé à la place de TFA, si TFA est trop acide pour la colonne HPLC. Il est recommandé que la vitesse de rampe de composition du solvant organique ne doit pas dépasser 2%/min pour une meilleure séparation.
    18. Analyser chaque fraction à l’aide de la spectrométrie de masse (MALDI) de désorption-ionisation laser assistée par matrice pour le produit attendu de m/z à 2 890.
      NOTE : Dissoudre l’acide α-cyano-4-hydroxycinnamique à 1 mg/mL dans l’acétonitrile/eau (50 : 50 % en volume) comme la solution de la matrice. Repérez les 0,75 µL de solution de matrice sur la plaque MALDI, suivie de 0,75 µL de chaque fraction. Effectuer l’analyse à l’aide d’un mode positif ion réfléchissant à une gamme de masses de 500-5 000 Da.
    19. Combiner des fractions de produit, souffler dans l’acétonitrile, geler et lyophiliser peptides purifiés à sec.
  2. Préparation de MCP-1 PA
    1. Préparer un excès molaire 1.1 de 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000)-maléimide au peptide dans des flacons séparés à scintillation. Dissoudre les deux composés dans l’eau bidistillée à ~ 15 mg/mL. Laisser agir pendant 15 minutes ou jusqu'à ce que les deux solutions sont tout à fait claires.
      Remarque : Le DSPE-PEG (2000)-Cy5 est synthétisé en utilisant le même protocole avec DSPE-PEG (2000)-amine et Cy5 fonctionnalisés ester N-hydroxysuccinimide (NHS), à l’exception de l’étape 1.2.3, où le pH de la solution est ajusté à 8,5.
    2. Ajouter DSPE-PEG (2000)-maléimide solution à la solution de peptide. Vortex et laisser agir.
    3. Ajouter 1 M NaOH goutte à goutte (1 µL) à la fois jusqu'à ce que le pH de la solution est de 7.
    4. Solution de purge d’azote pendant 5 min. remuer la solution du jour au lendemain.
    5. Congeler la solution et lyophiliser jusqu’au sec.
    6. Une fois que le produit brut est séché, dissoudre le solide à 5 mg/mL d’eau.
    7. Purifier par HPLC, tel que décrit ci-dessus.
      NOTE : Peptide non conjuguée et DSPE-PEG(2000) devraient éluer entre 15-30 % concentration organique (% en volume), tandis que DSPE-PEG (2000)-MCP-1 conjugué doit éluer entre 40-50 % concentration organique.
    8. Analyser chaque fraction à l’aide de la spectrométrie de masse MALDI pour les correspondants m/z DSPE-PEG (2000)-MCP-1 devrait avoir un pic large m/z à 5 760.
      NOTE : acide 2, 5-dihydroxybenzoïque est mieux utilisé comme matrice pour DSPE-PEG (2000)-MCP-1 avec la MALDI.
  3. Assemblée de MCP-1 PAMs
    1. Dissoudre 1,75 mg PAs de MCP-1 avec 3 mL de méthanol dans un flacon 1-dram. Laisser agir jusqu'à dissolution complète de la MCP-1 PA.
      NOTE : Cy5 amphiphiles peut être incorporé à un rapport molaire de 10 : 90 PA de MCP-1 pour les applications d’imagerie.
    2. Evaporer le méthanol en présence d’azote dans un mouvement circulaire tout en rinçant le méthanol restant sur le côté de la cuvette jusqu'à ce qu’un film uniform est formé au fond du flacon. Séchage sous vide le film du jour au lendemain.
    3. Hydrater le film avec 3 mL de tampon phosphate ou de l’eau saline (PBS), afin de préparer une solution de 100 µM de MCP-1 PAMs. Vortex doucement et laisser agir la solution jusqu’au clair. Incuber à 80 ° C pendant 30 min.
      Remarque : La température élevée a été montrée pour accélérer le processus d’auto-assemblage et permet au composant de peptide former la structure secondaire plus stable, tout en réduisant la micellaire critique concentration (CMC)42,43.
    4. Cool la dispersion obtenue à la température ambiante.

2. caractérisation des MCP-1 PAMs

  1. Diffusion dynamique de la lumière (DLS) et potentiel zêta
    1. Place de 100 µM de MCP-1 PAM ou brouillée PAM dans une cuvette conformément aux instructions de l’instrument potentiel DLS ou zeta.
      Remarque : Des cuvettes de potentiel DLS et zeta peuvent être différents selon les instructions de l’instrument.
    2. Equilibrer l’instrument à la température ambiante. Mesurer la taille et la charge superficielle de la PAM.
  2. Microscopie électronique à transmission (TEM)
    1. Ajouter 7 µL de 50 µM MCP-1 PAM ou brouillée PAM vers une grille de TEM suspendu dans une pince fermeture automatique pour 5 min. mèche à la goutte avec une lingette de tâche délicate.
    2. Ajouter 7 µL d’eau pour laver la grille. Mèche à la goutte.
    3. Ajouter 7 µL de 1 wt % l’acide phosphotungstique pour 2 min. mèche à la goutte. Répétez l’étape 2.2.2.
    4. Sécher la grille TEM avant l’analyse TEM.
  3. Spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD)
    1. Allumez l’azote pendant 5-10 min avant l’utilisation de l’instrument.
    2. Déposer 300 µL de vide (eau ou PBS) dans la cuvette.
    3. Mesurer les spectres à 190-265 nm, 0. 2 mm-longueur du chemin avec un temps d’intégration 1 s et une bande passante de 1 nm à température ambiante. Collecter 3 répétitions.
    4. Mesure 100 µM peptide de MCP-1, MCP-1 PAM, brouillés peptidique et brouillés PAM sous la même condition décrite à l’étape 2.3.3. Soustraire de l’essai à blanc.
    5. Ajuster les données à l’aide d’une interpolation linéaire des spectres de base polylysine.
    6. Éteignez l’appareil. Attendre 10 min avant d’éteindre l’azote.

3. l’analyse in Vitro de MCP-1 PAMs

  1. In vitro de biocompatibilité
    1. Culture et développez WEHI 274,1 murines monocytes dans Eagle modifié milieu de Dulbecco additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), 1 % la pénicilline-streptomycine et 0,05 mM 2-mercaptoéthanol à 37 ° C moins de 5 % de CO2 passage 5.
      NOTE : WEHI 274,1 sont des cellules en suspension. Lorsque la mise en culture, les médias devraient être réapprovisionnés tous les 2-3 jours.
    2. Monocytes pipette dans les médias dans un tube à centrifuger stérile de 50 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C.
    3. Aspirer les anciens médias et resuspendre dans 10 mL de milieu frais dans le tube à centrifuger. Mélanger lentement jusqu'à ce que les cellules sont réparties uniformément dans les médias. Compter les cellules à l’aide d’une coloration bleu trypan et un hémocytomètre.
    4. Diluer les cellules telles qu’il y a 4 000 monocytes par 90 µL des médias / puits. Ajouter 90 µL de cellules dans le puits d’une plaque de 96 puits. Incuber pendant 24 h.
      Remarque : Évitez d’utiliser les puits sur le bord extérieur de la plaque pour éviter des différences entre évaporation et des variations thermiques de la plaque. Remplir les puits extérieurs avec 100 µL PBS.
    5. Dissoudre 0,15 µmol de peptide MCP-1, MCP-1 PAM, peptide brouillé ou brouillés-PAM dans 150 µL de PBS dans des tubes de microcentrifuge distinct, stérilisé. Effectuer des dilutions pour faire 65 µL de 1, 10 et 100 µM de chaque échantillon.
    6. Ajouter 10 µL PBS de chacune des concentrations dans les puits contenant WEHI 274,1 (volume total : 100 µL par bien, 6 lignes, total de 96 puits). Incuber pendant 72 h.
    7. Ajouter 10 µL (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) dans chaque puits. Incuber pendant 1 heure.
    8. Analyser l’absorbance à l’aide d’un lecteur à 490 nm ou selon les instructions du fabricant.
  2. Liaison de micelle in vitro
    1. Monocytes graine 500 000 dans chaque puits d’une plaque de 6 puits dans 2 mL de support contenant 100 µM étiquetés Cy5 MCP-1 PAM (10 : 90 rapport molaire du DSPE-PEG (2000)-Cy5 et PA de MCP-1). Incuber pendant 1 heure.
    2. Recueillir WEHI 274,1 par centrifugation à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer les médias.
    3. Resuspendre et laver les cellules dans 2 mL de PBS. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer le PBS. Répétez le processus de lavage avec 2 mL de PBS. Aspirer le PBS.
    4. Ajouter 2 mL de paraformaldéhyde froide de 4 % pour fixer les cellules. Incuber à température ambiante pendant 10 min.
    5. Pipette les cellules fixes sur une lamelle de verre stériles dans les puits d’une plaque de 6 puits. Centrifuger à 400 g pendant 5 min.
    6. Retirez le paraformaldéhyde. Lavez et rincez une fois avec 2 mL de PBS. Remettre en suspension avec 1 mL PB
      Remarque : Lorsque le rinçage, ne pas perturber les cellules sur la lamelle couvre-objet.
    7. Mettez 10 µL de 90 % de glycérol dans du PBS sur une diapositive. Utiliser une aiguille et une pince pour ramasser de la lamelle. Sécher le bord de la lamelle. Placez délicatement la lamelle sur une lame face vers le bas.
    8. Doucement, sceller le bord de la lamelle avec vernis à ongles transparent. Placer au réfrigérateur jusqu’au moment de l’imagerie.
    9. Utiliser un confocal laser scanning microscope (CLSM) installé avec des lasers pour Cy5 à λexcitation = 650 nm.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Préparation du PAM de MCP-1
Le motif de liaison CCR2 (résidus 13-35) de la protéine MCP-1 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] ou un peptide brouillé [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] a été modifié par l’ajout d’un résidu de cystéine sur l’extrémité N-terminale. Le peptide de MCP-1 a été synthétisé par une méthode de phase solide Fmoc-négociée à l’aide d’un synthétiseur de peptide automatisé. Le peptide brut a été purifié par HPLC en phase inversée sur u...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

MCP-1 PAMs sont une plate-forme d’imagerie moléculaire prometteuse, consistant en un peptide ciblage hydrophile et queue hydrophobe qui anime la nature auto-assemblées de la NANOPARTICULE. Ce ciblage monocyte micelle peut être préparé par synthèse simple et étapes de la purification du peptide de MCP-1 et DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs ont de nombreuses caractéristiques bénéfiques en vivo imagerie moléculaire telles que leur auto-assemblage sous des conditions douces, biodégradabilité intrinsèque et...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à souligner l’appui financier de l’University of Southern California, le National Heart, Lung et Blood Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli et Edythe large Innovation Award et la Fondation de Whittier L.K. Non-Cancer Bourse de recherche translationnelle accordée à EJC. Les auteurs remercient le Centre pour la microscopie électronique et microanalyse, Centre d’Excellence en NanoBiophysics, Centre d’Excellence pour la caractérisation moléculaire et translationnelle Imaging Center à l’University of Southern California, de l’assistance configurations instrumentales.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-ethanedithiolVWRE0032for peptide synthesis
10 mL disposable serological pipetsVWR89130-898for cell culture
15 mL centrifuge tubes, polypropyleneVWR89401-566for various applications
2,5-dihydroxybenzoic acid, 99%Fisher ScientificAC165200050for MALDI
25 mL disposable serological pipetsVWR89130-900for cell culture
2-Mercaptoethanol, 50 mMThermoFisher Scientific31350010for cell culture
5 mL disposable serological pipetsVWR89130-896for cell culture
50 mL centrifuge tubesVWR89039-658for various applications
75 cm2 culture flaskFisher Scientific13-680-65for cell culture
75 mL reaction vesselProtein Technologies3000005for peptide synthesis
96-wells cell culture plateVWR40101-346for MTS assay
Acetonitrile, HPLC gradeFisher ScientificA998SK-4for HPLC purification
Borosilicate glass, 1 dramVWR66011-041for PAM synthesis
Borosillicate glass pipet, Long tipsVWR14673-043for various applications
Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mmFisher Scientific12-542Bfor confocal microscopy
Cy5 amineAbcamab146463for peptide conjugation
Diethyl ether, ACS gradeFisher ScientificE138-1for peptide precipitation
Disposable syringes, 20 mLFisher Scientific14-817-54for HPLC purification
Double neubauer ruled hemocytometerVWR63510-13for cell counting
DSPE-PEG(2000) amineAvanti880128Pfor peptide conjugation
DSPE-PEG(2000) maleimideAvanti880126Pfor peptide conjugation
DSPE-PEG(2000)-NHS ester NanocsPG2-DSNS-10Kfor conjugation to Cy5
Dulbecco's modified eagle medium-high glucoseSigma AldrichD5796-500MLfor cell culture
Fetal bovine serum, qualified, heat inactivatedThermoFisher Scientific10438026for cell culture
Fmoc-L-Ala-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Afor peptide synthesis
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-RBFfor peptide synthesis
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-NTfor peptide synthesis
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-CTfor peptide synthesis
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-QTfor peptide synthesis
Fmoc-L-Ile-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Ifor peptide synthesis
Fmoc-L-Leu-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Lfor peptide synthesis
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-KBCfor peptide synthesis
Fmoc-L-Phe-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Ffor peptide synthesis
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-SBfor peptide synthesis
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-TBfor peptide synthesis
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-YBfor peptide synthesis
Fmoc-L-Val-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Vfor peptide synthesis
Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 meshNovabiochem856013for peptide synthesis
Formic acid, optima LC/MS gradeFisher ScientificA117-50for HPLC purification
GlycerolVWRM152-1Lfor confocal microscopy
Hand tally counterFisher ScientificS90189for cell counting
Magnetic stir bars, egg-shapedVWR58949-006for peptide conjugation
Methanol, ACS certifiedFisher ScientificA412-4for PAM synthesis
MTS cell proliferation colorimetric assay kitVWR10191-104for MTS assay
N,N-Dimethylformamide, sequencing gradeFisher ScientificBP1160-4for peptide synthesis
N-MethylmorpholineProtein TechnologiesS-1L-NMMfor peptide synthesis
ParaformaldehydeFisher ScientificAC416780250for fixing cells
PBS, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010049for various applications
Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mLThermoFisher Scientific15140122for cell culture
Peptide synthesis vessel, 25 mL Fisher ScientificCG186011for peptide synthesis
Phosphotungstic acid Fisher ScientificA248-25for TEM
PiperidineSpectrumP1146-2.5LTGLfor peptide synthesis
Plain glass microscope slide 75 x 25 mmFisher Scientific12-550-A3for confocal microscopy
Reagent reservoirs, sterile VWR95128093for cell culture
Self-closing tweezerTedPella515for TEM
TEM support filmTedPella01814Ffor TEM
Trifluoroacetic acid Fisher ScientificBP618-500for peptide cleavage and HPLC purification
TriisopropylsilaneVWRTCT1533-5mlfor peptide cleavage
Trypan blue solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061for cell counting
Tweezer, general purpose-serratedVWR231-SA-SEfor confocal microscopy
WEHI-274.1ATCCATCC CRL-1679murine monocyte
automated benchtop peptide synthesizerProtein TechnologiesPS3 Benchtop Peptide Synthesizer
α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99%Sigma Aldrich476870-2Gfor MALDI

Références

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
  2. Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12 (2006).
  3. Rahmani, M., Cruz, R. P., Granville, D. J., McManus, B. M. Allograft Vasculopathy Versus Atherosclerosis. Circ. Res. 99 (8), 801-815 (2006).
  4. Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
  5. Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature (London, U. K). 473 (7347), 317-325 (2011).
  6. Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature (London). 394 (6696), 894-897 (1998).
  7. Szmitko, P. E., et al. New Markers of Inflammation and Endothelial Cell Activation. Circulation. 108 (16), 1917-1923 (2003).
  8. Deshmane, S. L., Kremlev, S., Amini, S., Sawaya, B. E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. J. Interferon Cytokine Res. 29 (6), 313-326 (2009).
  9. Chung, E. J., et al. Monocyte-Targeting Supramolecular Micellar Assemblies: A Molecular Diagnostic Tool for Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (3), 367-376 (2015).
  10. Chung, E. J. Targeting and therapeutic peptides in nanomedicine for atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 891-898 (2016).
  11. Sanz, J., Fayad, Z. A. Imaging of atherosclerotic cardiovascular disease. Nature (London, U. K.). 451 (7181), 953-957 (2008).
  12. Tarkin, J. M., et al. Imaging Atherosclerosis. Circ. Res. 118 (4), 750-769 (2016).
  13. Hennerici, M., Baezner, H., Daffertshofer, M. Ultrasound and arterial wall disease. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 19-33 (2004).
  14. Nissen, S. E. Application of intravascular ultrasound to characterize coronary artery disease and assess the progression or regression of atherosclerosis. Am J Cardiol. 89 (4A), 24B-31B (2002).
  15. Khalil, M. M., Tremoleda, J. L., Bayomy, T. B., Gsell, W. Molecular SPECT Imaging: An Overview. Int J Mol Imaging. 2011, 796025(2011).
  16. Lerakis, S., et al. Imaging of the vulnerable plaque: noninvasive and invasive techniques. Am J Med Sci. 336 (4), 342-348 (2008).
  17. Sun, Z. H., Rashmizal, H., Xu, L. Molecular imaging of plaques in coronary arteries with PET and SPECT. J Geriatr Cardiol. 11 (3), 259-273 (2014).
  18. Godin, B., et al. Emerging applications of nanomedicine for the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases. Trends Pharmacol. Sci. 31 (5), 199-205 (2010).
  19. Branco de Barros, A. L., Tsourkas, A., Saboury, B., Cardoso, V. N., Alavi, A. Emerging role of radiolabeled nanoparticles as an effective diagnostic technique. EJNMMI Res. 2 (1), 31-39 (2012).
  20. Jayagopal, A., Linton, M. F., Fazio, S., Haselton, F. R. Insights into atherosclerosis using nanotechnology. Curr. Atheroscler. Rep. 12 (3), 209-215 (2010).
  21. Khodabandehlou, K., Masehi-Lano, J. J., Poon, C., Wang, J., Chung, E. J. Targeting cell adhesion molecules with nanoparticles using in vivo and flow-based in vitro models of atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 242 (8), 799-812 (2017).
  22. Trent, A., Marullo, R., Lin, B., Black, M., Tirrell, M. Structural properties of soluble peptide amphiphile micelles. Soft Matter. 7 (20), 9572-9582 (2011).
  23. Hartgerink, J. D., Beniash, E., Stupp, S. I. Peptide-amphiphile nanofibers: A versatile scaffold for the preparation of self-assembling materials. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (8), 5133-5138 (2002).
  24. Missirlis, D., et al. Effect of the Peptide Secondary Structure on the Peptide Amphiphile Supramolecular Structure and Interactions. Langmuir. 27 (10), 6163-6170 (2011).
  25. Zhong, L., Johnson, W. C. Environment affects amino acid preference for secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (10), 4462-4465 (1992).
  26. Shimada, T., Lee, S., Bates, F. S., Hotta, A., Tirrell, M. Wormlike Micelle Formation in Peptide-Lipid Conjugates Driven by Secondary Structure Transformation of the Headgroups. J. Phys. Chem. B. 113 (42), 13711-13714 (2009).
  27. Missirlis, D., et al. Linker Chemistry Determines Secondary Structure of p5314-29 in Peptide Amphiphile Micelles. Bioconjugate Chem. 21 (3), 465-475 (2010).
  28. Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu. Rev. Mater. Sci. 26, 365-394 (1996).
  29. Xue, Y., O'Mara, M. L., Surawski, P. P. T., Trau, M., Mark, A. E. Effect of Poly(ethylene glycol) (PEG) Spacers on the Conformational Properties of Small Peptides: A Molecular Dynamics Study. Langmuir. 27 (1), 296-303 (2011).
  30. Canalle, L. A., Loewik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Polypeptide-polymer bioconjugates. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 329-353 (2010).
  31. Hamley, I. W. PEG-Peptide Conjugates. Biomacromolecules. 15 (5), 1543-1559 (2014).
  32. Acar, H., et al. Self-assembling peptide-based building blocks in medical applications. Adv. Drug Delivery Rev. , (2016).
  33. Busseron, E., Ruff, Y., Moulin, E., Giuseppone, N. Supramolecular self-assemblies as functional nanomaterials. Nanoscale. 5 (16), 7098-7140 (2013).
  34. Barrett, J. C., et al. Modular Peptide Amphiphile Micelles Improving an Antibody-Mediated Immune Response to Group A Streptococcus. ACS Biomater. Sci. Eng. 3 (2), 144-152 (2017).
  35. Toughrai, S., et al. Reduction-Sensitive Amphiphilic Triblock Copolymers Self-Assemble Into Stimuli-Responsive Micelles for Drug Delivery. Macromol. Biosci. 15 (4), 481-489 (2015).
  36. Swirski, F. K., et al. Monocyte accumulation in mouse atherogenesis is progressive and proportional to extent of disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (27), 10340-10345 (2006).
  37. Kashiwagi, M., et al. Association of monocyte subsets with vulnerability characteristics of coronary plaques as assessed by 64-slice multidetector computed tomography in patients with stable angina pectoris. Atherosclerosis (Amsterdam, Neth). 212 (1), 171-176 (2010).
  38. Chung, E. J., Tirrell, M. Recent Advances in Targeted, Self-Assembling Nanoparticles to Address Vascular Damage Due to Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (16), 2408-2422 (2015).
  39. Cassetta, L., Pollard, J. W. Cancer immunosurveillance: role of patrolling monocytes. Cell Res. 26 (1), 3-4 (2016).
  40. Williams, C. B., Yeh, E. S., Soloff, A. C. Tumor-associated macrophages: unwitting accomplices in breast cancer malignancy. NPJ Breast Cancer. 2, (2016).
  41. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and Macrophages in Cancer: Development and Functions. Cancer Microenviron. 6 (2), 179-191 (2013).
  42. Schick, M. J. Effect of temperature on the critical micelle concentration of nonionic detergents. Thermodynamics of micelle formation. J. Phys. Chem. 67 (9), 1796-1799 (1963).
  43. Marullo, R., Kastantin, M., Drews, L. B., Tirrell, M. Peptide contour length determines equilibrium secondary structure in protein-analogous micelles. Biopolymers. 99 (9), 573-581 (2013).
  44. Hilbich, C., Kisters-Woike, B., Reed, J., Masters, C. L., Beyreuther, K. Substitutions of hydrophobic amino acids reduce the amyloidogenicity of Alzheimer's disease βA4 peptides. J. Mol. Biol. 228 (2), 460-473 (1992).
  45. Trevino, S. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. Amino Acid Contribution to Protein Solubility: Asp, Glu, and Ser Contribute more Favorably than the other Hydrophilic Amino Acids in RNase Sa. J. Mol. Biol. 366 (2), 449-460 (2007).
  46. Kim, S. W., Shi, Y. Z., Kim, J. Y., Park, K. N., Cheng, J. X. Overcoming the barriers in micellar drug delivery: Loading efficiency, in vivo stability, and micelle-cell interaction. Expert Opin Drug Delivery. 7 (1), 49-62 (2010).
  47. Rangel-Yagui, C. O., Pessoa, A. Jr, Tavares, L. C. Micellar solubilization of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 8 (2), 147-163 (2005).
  48. Batrakova, E., et al. Fundamental relationships between the composition of pluronic block copolymers and their hypersensitization effect in MDR cancer cells. Pharm. Res. 16 (9), 1373-1379 (1999).
  49. Chen, L. J., Lin, S. Y., Huang, C. C. Effect of Hydrophobic Chain Length of Surfactants on Enthalpy-Entropy Compensation of Micellization. J. Phys. Chem. B. 102 (22), 4350-4356 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Réimpressions et Autorisations

Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demande d’autorisation

Explorer plus d’articles

Bio ing nierienum ro 129Monocytepeptidemicellesath roscl rosenanoparticulesimagerieauto assemblagediagnostic

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Contactez-nous

RECOMMANDER À LA BIBLIOTHÈQUE

NEWSLETTERS JoVE

Recherche

Enseignement

Auteurs

Bibliothécaires

À PROPOS DE JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.