JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo articolo presenta un metodo che coinvolge la sintesi e la caratterizzazione delle micelle di amphiphile peptide monocito-targeting e le corrispondenti saggi per verificare la biocompatibilità e capacità la micella di associare ai monociti.

Abstract

L'aterosclerosi è un contributore importante alla malattia cardiovascolare, la principale causa di morte nel mondo, che sostiene 17,3 milioni di vite ogni anno. L'aterosclerosi è anche la principale causa di morte improvvisa e l'infarto miocardico, istigato da placche instabili che si rompono e occludono il vaso sanguigno senza avviso. Modalità di formazione immagine corrente non può distinguere tra placche stabili e instabili che rottura. Micelle di peptide anfifili (PAMs) possono ovviare a questo inconveniente come possono essere modificati con una varietà di molecole che si legano specificamente a tessuto malato di targeting. I monociti sono stati indicati per essere marker precoce di aterosclerosi, mentre il grande accumulo di monociti è associato con le piastre alla rottura incline. Quindi, nanoparticelle che possono mirare monociti possono essere utilizzate per discriminare le diverse fasi di aterosclerosi. A tal fine, qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di monocito-targeting PAMs (monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) PAMs). MCP-1 PAMs sono auto-assemblate attraverso sintesi in condizioni blande di forma nanoparticelle di 15 nm di diametro con vicino neutro carica superficiale. In vitro, PAMs sono state trovate per essere biocompatibile e aveva una legame ad alta affinità per i monociti. I metodi descritti nel presente documento mostrano la promessa per una vasta gamma di applicazioni nell'aterosclerosi, nonché altre malattie infiammatorie.

Introduzione

Le malattie cardiovascolari rimangono per essere le principali cause di morte a livello mondiale con circa 17,3 milioni di morti in tutto il mondo1. Le malattie cardiovascolari sono fornite da aterosclerosi, una condizione in cui si accumulano le placche nelle arterie, quindi inibente sangue e flusso di ossigeno alle cellule del corpo2,3. La progressione di aterosclerosi coinvolge l'ispessimento e l'indurimento delle arterie da una risposta infiammatoria, metabolismo dei lipidi irregolare e l'accumulazione della placca, che conduce a placca la rottura e l'infarto miocardico4,5. Le cellule endoteliali esprimono molecole di adesione e citochine, che comprendono MCP-1, che si lega al recettore di chemochine C-C (CCR2) presente sulla superficie dei monociti6,7,8. Il colesterolo ossidato converte i monociti macrofagi durante la fase iniziale della formazione di placche, che amplifica la risposta infiammatoria nella regione e porta alla lesione del tessuto e la formazione di placche instabili o vulnerabili9, 10.

Tradizionalmente, l'aterosclerosi viene valutata valutando stenosi luminal da imaging anatomico mediante angiografia o ultrasuono11,12. Tuttavia, questi metodi possono determinare solo lo stringimento severo della parete arteriosa e non lo stadio precoce di aterosclerosi, come crescita iniziale della placca causa rimodellamento arterioso mantenere le dimensioni dell'arteria e sangue flusso tasso12,13, 14. Di conseguenza, gli angiogrammi underrepresent prevalenza di aterosclerosi. Inoltre, tecniche di imaging non invasive come singola emissione del fotone computato tomografia, tomografia a emissione di positroni e la risonanza magnetica recentemente sono state usate per caratterizzare la morfologia della placca come possono fornire informazioni iniziali e caratterizzazione delle placche. Tuttavia, queste modalità sono spesso limitate dalla mancanza di sensibilità, risoluzione spaziale, o richiedono l'uso di radiazioni ionizzanti, rendendo imaging progressione della placca nelle diverse fasi molto più impegnativo15,16, 17. Un sistema di consegna imaging che identificherebbe specificamente placche nelle diverse fasi di aterosclerosi rimane ad essere sviluppato.

Le nanoparticelle hanno dimostrato di essere una piattaforma emergente per in vivo della placca di targeting e diagnostica18,19,20,21. In particolare, PAMs sono vantaggiose grazie alla loro diversità chimica e la possibilità di ospitare una varietà di moiety, composizioni, dimensioni, forme e funzionalizzazione superficiale22. Peptide anfifili (PAs) sono costituiti da un peptide "capigruppo idrofilo," attaccato a una coda idrofobica, che in genere sono i lipidi; Questa struttura anfifilica conferisce la capacità di auto-assemblaggio e consente una visualizzazione multivalente di peptidi sulla superficie delle particelle22,23,24. Il peptide headgroups possono influenzare la forma delle particelle attraverso pieghevoli e legame tra peptidi25dell'idrogeno. Peptidi che piega attraverso l'interazione di β-foglio sono stati indicati per formare micelle allungate, mentre α-elica conferma può formare entrambe micelle sferiche e allungata22,23,24, 25,26,27. Linker di polietilenglicole (PEG) che lo scudo la carica superficiale del peptide può essere collocato tra il peptide idrofilo e la coda idrofobica di PAMs, migliorare la disponibilità della nanoparticella in circolazione sistemica28, 29 , 30 , 31. PAMs sono vantaggiose anche perché sono biocompatibili e hanno dimostrati di avere una vasta gamma di applicazioni32,33. La solubilità in acqua delle micelle offre un vantaggio sopra altri sistemi basati su nanoparticelle come certe nanoparticelle polimeriche che non sono solubili in acqua e devono essere sospese in res per iniezioni34. Inoltre, la possibilità di creare PAMs smontare in risposta a un stimoli specifici rende PAMs un attraente candidato per controllato di farmaci intracellulari di consegna35.

Legandosi al recettore CCR2 e accumulando nell'arco aortico, PAMs precedentemente sono state sviluppate per monocito targeting per monitorare le diverse fasi delle lesioni aterosclerotiche dell'aorta9. In topi ApoE- / - monocito accumulo aumenta proporzionalmente a placca progressione36. Inoltre, è emerso che i pazienti con placche rottura-incline, fase avanzata contengono una maggiore quantità di monociti37. Pertanto, la modifica di PAMs incorporare MCP-1 è utile perché permette una maggiore specificità targeting e differenziazione tra lesioni aterosclerotiche e tardo-fase iniziale. Questi studi di proof-of-concept anche verificato che PAMs sono abbastanza sicura di essere utilizzato preclinicamente e vengono eliminate per via renale38. Poiché i monociti e infiammazione sono caratteristici di altre malattie, MCP-1 PAMs hanno il potenziale per essere utilizzato per applicazioni terapeutiche e diagnostiche in altre malattie oltre l'aterosclerosi8,39,40 , 41.

Qui, segnaliamo la realizzazione di auto-assemblati e scalabile PAMs di MCP-1 che ha dimostrato la dimensione ottimale della particella, carica superficiale e targeting selettivo di monociti per applicazioni avanzate di imaging nell'aterosclerosi.

Protocollo

Nota: Leggere la scheda di sicurezza per i reagenti e seguire tutte le misure di sicurezza chimica come richiesto dall'istituzione locale.

1. preparazione di MCP-1 PAMs

  1. Preparazione del peptide di MCP-1
    1. Pesare 0,25 mmol di Fmoc-L-Lys (Boc)-Wang in un recipiente di reazione (RV). Sciacquare il lato del camper con 5ml dimethylforamide (DMF) in una cappa chimica.
    2. Caricare il camper su un sintetizzatore di peptidi di benchtop automatizzato. Carico pre-confezionato aminoacido fiale, N '- CYNFTINRKISVQRLASYRRITSS - C', dal C a N-terminale. Includere un flaconcino vuoto alla fine per il passo finale deprotezione.
      Nota: Può anche essere sintetizzato un peptide strapazzato con la sequenza, N '- CNNSIIRSKQVLRSTRYFRSATYK - C', usando lo stesso protocollo.
    3. Una volta terminata la sintesi, trasferire i peptidi su resina da RV nella fiala di scintillazione con 2-3 mL di metanolo fino a quando tutti le resine vengono trasferiti. Dopo la resina ha affondato verso il basso, rimuovere il surnatante di metanolo e far evaporare il rimanente fino a secco. Vuoto a secco per ulteriori 2 ore o una notte a temperatura ambiente.
    4. Fare 12 mL di soluzione di clivaggio contenente trifluoracetic acido (TFA):ethanedithiol:water:triisopropylsilane al 94:2.5:2.5:1 vol % in una cappa chimica. Agitare la soluzione di fenditura per assicurarsi che viene miscelato in modo uniforme.
      Attenzione: Poiché triisopropylsilane ed etanditiolo sono aria-sensibile, argon spurgo stock flaconcini di triisopropylsilane ed etanditiolo per 1 min prima di rimetterle.
    5. Posizionare il vaso di sintesi (SV) su un agitatore per braccio di bloccaggio nella parte inferiore metà della SV. Trasferimento del peptide-resina al SV con 2 mL di soluzione di fenditura fino a quando tutti il peptide-resine vengono trasferiti.
    6. Lavare i lati dello SV con 3 mL di soluzione di clivaggio. Chiudere il tappo della SV e agitare a 300 oscillazioni/min per 4 h.
    7. Pesare una provetta vuota 50ml. Registrare la massa.
    8. Dopo 4 h, è possibile scaricare la soluzione peptide fenduto dalla SV nella provetta da centrifuga 50 mL. Sciacquare la SV parecchie volte con la soluzione rimanente di clivaggio.
    9. Evaporare la soluzione peptide fenduto con azoto fino a quando c'è meno di 4 mL restanti la provetta da centrifuga.
    10. Aggiungere alla soluzione di peptide-spaccati 36 mL di etere ghiacciata.
    11. Vortex la soluzione fino a quando è completamente bianca o gialla. Centrifugare a 3.000 x g per 5 min a 4 ° C e decantare il supernatante.
    12. Aggiungere 40 mL di etere ghiacciata al tubo. Vortice e Sonicare nuovamente. Ripetere il processo di centrifugazione. Decantare il supernatante.
    13. Asciugare il pellet PA grezzo con azoto gas spurgo fino a che l'etere è visibilmente volatilizzato.
    14. Aggiungere 20 mL bidistillata acqua, vortice e trattare con ultrasuoni fino a quando il peptide è completamente dissolto nella soluzione.
    15. Congelare la soluzione e lyophilize fino a secco.
    16. Una volta che il peptide è asciugato, pesare la massa della provetta da centrifuga contenente il peptide grezzo. Sciogliere il peptide grezzo in 5 mg/mL di acqua.
    17. Sciogliere 25 mg di greggio MCP-1 peptide in 5 mL di acqua bidistillata per rendere una concentrazione totale di 5 mg/mL. Purificare il peptide grezzo di MCP-1 mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) con 0,1% TFA in acqua (solvente A) e 0,1% TFA in acetonitrile (solvente B) come fasi mobili su una colonna in fase inversa C8. Iniettare 5 mL del peptide in HPLC.
      Nota: La fase mobile iniziale consisteva di solvente al 100% A una portata di 9,0 mL/min diminuire solvente A lentamente al 30% in 27 min e tenere a questa composizione per 3 min ritorno la sfumatura al 100% solvente un oltre 3 min e permanenza a questa composizione per 1 min dare un totale di run-time di almeno 34 mantenere la temperatura della colonna a 55 ° C. Modalità di sorgente di ioni positivi di utilizzo per l'analisi. L'acido formico può essere utilizzato al posto di TFA, se TFA è troppo acido per la colonna HPLC. È consigliabile che la velocità di rampa di composizione solvente organico non deve superare 2%/min per la separazione migliore.
    18. Analizzare ogni frazione usando la spettrometria totale di matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) per il prodotto previsto m/z a 2.890.
      Nota: Sciogliere l'acido α-ciano-4-idrossicinnamico a 1 mg/mL in acetonitrile/acqua (50: 50% in volume) come la soluzione di matrice. Spot 0,75 µ l di soluzione di matrix sulla piastra MALDI, seguita da 0,75 µ l di ciascuna frazione. Eseguire l'analisi utilizzando una modalità ioni positivi riflettente a un intervallo di massa di 500-5.000 Da.
    19. Combinare le frazioni di prodotto, soffiare via acetonitrile, congelare e lyophilize peptidi purificati fino a secco.
  2. Preparazione di MCP-1 PA
    1. Preparare un 1,1 eccesso molare di 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethylene glycol)-2000] DSPE-PEG (2000)-maleimide al peptide in flaconi separati scintillazione. Sciogliere entrambi i composti in acqua bidistillata per rendere ~ 15 mg/mL. Sottoporre ad ultrasuoni per 15 minuti o fino a quando entrambe le soluzioni sono completamente chiare.
      Nota: DSPE-PEG (2000)-Cy5 è sintetizzato utilizzando lo stesso protocollo con DSPE-PEG (2000)-ammina e Cy5 estere-funzionalizzati N-Idrossisuccinimide (NHS), fatta eccezione per passo 1.2.3, dove il pH della soluzione è regolato a 8,5.
    2. Aggiungere DSPE-PEG (2000)-con soluzione alla soluzione del peptide. Vortice e Sonicare.
    3. Aggiungere 1 M NaOH goccia a goccia (1 µ l) alla volta fino a quando il pH della soluzione è 7.
    4. Soluzione di eliminazione dei fogli inceppati di azoto per 5 min, agitare la soluzione durante la notte.
    5. Congelare la soluzione e lyophilize fino a secco.
    6. Una volta essiccato il prodotto grezzo, sciogliere il solido a 5 mg/mL di acqua.
    7. Purificare con HPLC come descritto sopra.
      Nota: Peptide non coniugata e DSPE-PEG(2000) dovrebbe eluire tra 15-30% di concentrazione organica (% vol), mentre DSPE-PEG (2000)-MCP-1 coniugato dovrebbe eluire tra 40-50% di concentrazione organica.
    8. Analizzare ogni frazione utilizzando la spettrometria di massa MALDI per corrispondente m/z DSPE-PEG (2000)-MCP-1 dovrebbe avere un picco di ampia m/z a 5.760.
      Nota: l'acido 2,5-dihydroxybenzoic è meglio utilizzato come la matrice per DSPE-PEG (2000)-MCP-1 con MALDI.
  3. Assemblea di MCP-1 PAMs
    1. Sciogliere 1,75 mg PAs di MCP-1 con 3 mL di metanolo in un flaconcino 1-dram. Sonicare fino alla completa dissoluzione della PA di MCP-1.
      Nota: Cy5 anfifili possono essere incorporato con un rapporto molare di 10:90 MCP-1 PA per applicazioni di imaging.
    2. Far evaporare il metanolo sotto azoto in un movimento circolare durante il risciacquo il metanolo restante fuori il lato del flaconcino fino a formare una pellicola uniforme nella parte inferiore della fiala. Vuoto-il film durante la notte a secco.
    3. Idratare il film con 3 mL di tampone fosfato o acqua salino (PBS) per ottenere una soluzione di 100 µM di MCP-1 PAMs. Delicatamente il vortice e Sonicare la soluzione fino a clear. Incubare a 80 ° C per 30 min.
      Nota: La temperatura elevata è stata indicata per accelerare il processo auto-assemblaggio e consente al componente di peptide formare la struttura secondaria più stabile, riducendo il micellare critica (CMC) concentrazione42,43.
    4. Raffreddare la conseguente dispersione a temperatura ambiente.

2. caratterizzazione di MCP-1 PAMs

  1. Diffusione dinamica della luce (DLS) e potenziale zeta
    1. Posto 100 µM di MCP-1 PAM o strapazzate PAM in una cuvetta secondo le istruzioni dello strumento potenziale DLS o zeta.
      Nota: DLS e zeta cuvette potenziali possono essere diversi in base alle istruzioni dello strumento.
    2. Equilibrare lo strumento a temperatura ambiente. Misurare le dimensioni e la carica superficiale di PAM.
  2. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
    1. Aggiungere 7 µ l di 50 µM MCP-1 PAM o PAM uova strapazzate su una griglia TEM sospeso all'interno di una pinzetta autochiusura per 5 min stoppino via la goccia con un panno delicato compito.
    2. 7 µ l di acqua per lavare la griglia. Stoppino via la goccia.
    3. Aggiungere 7 µ l di acido fosfotungstico di % wt 1 per 2 min. stoppino via la goccia. Ripetere il punto 2.2.2.
    4. Asciugare la griglia TEM prima dell'analisi TEM.
  3. Spettroscopia di dicroismo circolare (CD)
    1. Accendere l'azoto per 5-10 minuti prima dell'uso dello strumento.
    2. Mettere 300 µ l di vuoto (acqua o PBS) nella provetta.
    3. Misurare gli spettri a 190-265 nm, 0.2 mm-lunghezza del percorso con un tempo di integrazione 1 s e una larghezza di 1 banda nm a temperatura ambiente. Raccogliere 3 replicati.
    4. Misura 100 µM peptide di MCP-1, MCP-1 PAM, uova strapazzate peptide e strapazzate PAM sotto la stessa condizione descritta al punto 2.3.3. Sottrarre dallo spazio vuoto.
    5. Adattare i dati utilizzando un'interpolazione lineare di polilisina spettri di base.
    6. Spegnere lo strumento. Attendere 10 minuti prima di spegnere l'azoto.

3. analisi in Vitro di MCP-1 PAMs

  1. Biocompatibilità in vitro
    1. Cultura ed espandere WEHI 274.1 monociti murini in per volta Eagle supplementato di Dulbecco con 10% siero bovino fetale (FBS), 1% di penicillina-streptomicina e 0,05 mM 2-mercaptoetanolo a 37 ° C inferiore al 5% di CO2 al passaggio 5.
      Nota: WEHI 274.1 sono cellule in sospensione. Quando la coltura, i mezzi di comunicazione dovrebbe essere rifornito ogni 2-3 giorni.
    2. Monociti di dispensare in media in una provetta sterile da 50 mL. Centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 ° C.
    3. Aspirare i vecchi media e risospendere in media fresco 10ml nella provetta da centrifuga. Mescolare lentamente fino a quando le cellule sono distribuite uniformemente nei media. Contare le celle usando la macchiatura blu di trypan e un emocitometro.
    4. Diluire le cellule tale che ci sono 4.000 monociti a 90 µ l di media per pozzetto. Aggiungere 90 µ l di cellule nei pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Incubare per 24 h.
      Nota: Non utilizzare i pozzi sul bordo esterno della piastra per evitare differenze di evaporazione e sbalzi termici nella piastra. Riempire i pozzetti esterni con 100 µ l PBS.
    5. Sciogliere 0,15 µmol di peptide MCP-1, MCP-1 PAM, peptide strapazzato o uova strapazzate-PAM in 150 µ l PBS in microcentrifuga separata, sterilizzato. Effettuare diluizioni seriali per rendere 65 µ l di 1, 10 e 100 µM di ciascun campione.
    6. Aggiungere 10 µ l PBS di ciascuna concentrazione in pozzetti contenenti WEHI 274.1 (volume totale: 100 µ l per bene, 6 linee, totale 96 pozzetti). Incubare per 72 h.
    7. Aggiungere 10 µ l (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) (MTS) in ciascun pozzetto. Incubare per 1 h.
    8. Analizzare l'assorbanza utilizzando un lettore di piastra a 490 nm o in base alle istruzioni del produttore.
  2. In vitro associazione micella
    1. Monociti seme 500.000 in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in 2 mL di supporto contenente 100 µM Cy5-labeled PAM di MCP-1 (rapporto molare di 10:90 di DSPE-PEG (2000)-Cy5 e MCP-1 PA). Incubare per 1 h.
    2. Raccogliere WEHI 274.1 mediante centrifugazione a 300 x g per 5 min a 4 ° C. Aspirare i media.
    3. Risospendere e lavare le cellule in 2 mL di PBS. Centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 ° C. Aspirare il PBS. Ripetere il processo di lavaggio con 2 mL di PBS. Aspirare il PBS.
    4. Aggiungere 2 mL di freddo paraformaldeide al 4% per fissare le cellule. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
    5. Dispensare le cellule fissate su un vetrino coprioggetti di vetro sterile all'interno dei pozzetti di una piastra a 6 pozzetti. Centrifugare a 400 x g per 5 min.
    6. Rimuovere il paraformaldeide. Lavare e sciacquare una volta con 2 mL di PBS. Risospendere con 1 mL di PB
      Nota: Durante il risciacquo, evitare di perturbare le cellule sul vetrino coprioggetti.
    7. Mettere 10 µ l di glicerolo 90% in PBS in una diapositiva. Utilizzare un ago e una pinzetta per ritirare il vetrino coprioggetti. Asciugare il bordo del coverslip. Posizionare delicatamente il vetrino coprioggetti in una diapositiva rivolto verso il basso.
    8. Delicatamente e sigillate il bordo del coprivetrino con smalto trasparente. Mettere in frigorifero fino al momento per l'imaging.
    9. Utilizzare un laser confocale scansione microscopio (CLSM) installato con laser per Cy5 a λeccitazione = 650 nm.

Risultati

Preparazione di MCP-1 PAM
Il motivo di CCR2-legante (residui, 13-35) della proteina di MCP-1 [YNFTNRKISVQRLASYRRITSSK] o strapazzato peptide [YNSLVFRIRNSTQRKYRASIST] è stato modificato mediante l'aggiunta di un residuo di cisteina su N-terminale. Il peptide di MCP-1 è stato sintetizzato da un metodo di fase solida Fmoc-mediata utilizzando un sintetizzatore di peptidi automatizzato. Il peptide grezzo è stato purificato mediante HPLC in fase inversa su una colonna C8 ...

Discussione

MCP-1 PAMs sono una promettente piattaforma di imaging molecolare, costituito da un peptide di targeting idrofilo e coda idrofobica che spinge la natura auto-assemblata di nanoparticella. Questa micella monocito-targeting può essere preparato da semplice sintesi e fasi di purificazione del peptide di MCP-1 e DSPE-PEG (2000)-MCP-1. PAMs hanno molte caratteristiche benefiche per in vivo imaging molecolare come loro self-assembly sotto condizioni blande, biodegradabilità intrinseca e diversità strutturali e chim...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori si desidera ringraziare il sostegno finanziario alla University of Southern California, il National Heart, Lung e Blood Institute (NHLBI), R00HL124279, Eli ed Edythe Broad Innovation Award e il L.K. Whittier Foundation Non-cancro Premio di ricerca traslazionale concesso a EJC. Gli autori ringraziano il centro per la microscopia elettronica e microanalisi, centro di eccellenza in NanoBiophysics, centro di eccellenza per la caratterizzazione molecolare e traduzione Imaging Center presso la University of Southern California per assistenza in configurazioni di strumentale.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-ethanedithiolVWRE0032for peptide synthesis
10 mL disposable serological pipetsVWR89130-898for cell culture
15 mL centrifuge tubes, polypropyleneVWR89401-566for various applications
2,5-dihydroxybenzoic acid, 99%Fisher ScientificAC165200050for MALDI
25 mL disposable serological pipetsVWR89130-900for cell culture
2-Mercaptoethanol, 50 mMThermoFisher Scientific31350010for cell culture
5 mL disposable serological pipetsVWR89130-896for cell culture
50 mL centrifuge tubesVWR89039-658for various applications
75 cm2 culture flaskFisher Scientific13-680-65for cell culture
75 mL reaction vesselProtein Technologies3000005for peptide synthesis
96-wells cell culture plateVWR40101-346for MTS assay
Acetonitrile, HPLC gradeFisher ScientificA998SK-4for HPLC purification
Borosilicate glass, 1 dramVWR66011-041for PAM synthesis
Borosillicate glass pipet, Long tipsVWR14673-043for various applications
Coverslip, 0.16-0.19 mm, 22 x 22 mmFisher Scientific12-542Bfor confocal microscopy
Cy5 amineAbcamab146463for peptide conjugation
Diethyl ether, ACS gradeFisher ScientificE138-1for peptide precipitation
Disposable syringes, 20 mLFisher Scientific14-817-54for HPLC purification
Double neubauer ruled hemocytometerVWR63510-13for cell counting
DSPE-PEG(2000) amineAvanti880128Pfor peptide conjugation
DSPE-PEG(2000) maleimideAvanti880126Pfor peptide conjugation
DSPE-PEG(2000)-NHS ester NanocsPG2-DSNS-10Kfor conjugation to Cy5
Dulbecco's modified eagle medium-high glucoseSigma AldrichD5796-500MLfor cell culture
Fetal bovine serum, qualified, heat inactivatedThermoFisher Scientific10438026for cell culture
Fmoc-L-Ala-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Afor peptide synthesis
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-RBFfor peptide synthesis
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-NTfor peptide synthesis
Fmoc-L-Cys(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-CTfor peptide synthesis
Fmoc-L-Gln(Trt)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-QTfor peptide synthesis
Fmoc-L-Ile-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Ifor peptide synthesis
Fmoc-L-Leu-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Lfor peptide synthesis
Fmoc-L-Lys(Boc)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-KBCfor peptide synthesis
Fmoc-L-Phe-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Ffor peptide synthesis
Fmoc-L-Ser(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-SBfor peptide synthesis
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-TBfor peptide synthesis
Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-YBfor peptide synthesis
Fmoc-L-Val-OH /HBTUProtein TechnologiesPS3-H5-Vfor peptide synthesis
Fmoc-Lys(Boc)-wang resin, 100-200 meshNovabiochem856013for peptide synthesis
Formic acid, optima LC/MS gradeFisher ScientificA117-50for HPLC purification
GlycerolVWRM152-1Lfor confocal microscopy
Hand tally counterFisher ScientificS90189for cell counting
Magnetic stir bars, egg-shapedVWR58949-006for peptide conjugation
Methanol, ACS certifiedFisher ScientificA412-4for PAM synthesis
MTS cell proliferation colorimetric assay kitVWR10191-104for MTS assay
N,N-Dimethylformamide, sequencing gradeFisher ScientificBP1160-4for peptide synthesis
N-MethylmorpholineProtein TechnologiesS-1L-NMMfor peptide synthesis
ParaformaldehydeFisher ScientificAC416780250for fixing cells
PBS, pH 7.4ThermoFisher Scientific10010049for various applications
Penicillin/streptomycin, 10,000 U/mLThermoFisher Scientific15140122for cell culture
Peptide synthesis vessel, 25 mL Fisher ScientificCG186011for peptide synthesis
Phosphotungstic acid Fisher ScientificA248-25for TEM
PiperidineSpectrumP1146-2.5LTGLfor peptide synthesis
Plain glass microscope slide 75 x 25 mmFisher Scientific12-550-A3for confocal microscopy
Reagent reservoirs, sterile VWR95128093for cell culture
Self-closing tweezerTedPella515for TEM
TEM support filmTedPella01814Ffor TEM
Trifluoroacetic acid Fisher ScientificBP618-500for peptide cleavage and HPLC purification
TriisopropylsilaneVWRTCT1533-5mlfor peptide cleavage
Trypan blue solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061for cell counting
Tweezer, general purpose-serratedVWR231-SA-SEfor confocal microscopy
WEHI-274.1ATCCATCC CRL-1679murine monocyte
automated benchtop peptide synthesizerProtein TechnologiesPS3 Benchtop Peptide Synthesizer
α- cyano- 4- hydroxycinnamic acid, 99%Sigma Aldrich476870-2Gfor MALDI

Riferimenti

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e60 (2016).
  2. Falk, E. Pathogenesis of atherosclerosis. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (8, Suppl. C), C7-C12 (2006).
  3. Rahmani, M., Cruz, R. P., Granville, D. J., McManus, B. M. Allograft Vasculopathy Versus Atherosclerosis. Circ. Res. 99 (8), 801-815 (2006).
  4. Luis, A. J. Atherosclerosis. Nature. 407 (6801), 233-241 (2000).
  5. Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis. Nature (London, U. K). 473 (7347), 317-325 (2011).
  6. Boring, L., Gosling, J., Cleary, M., Charo, I. F. Decreased lesion formation in CCR2-/- mice reveals a role for chemokines in the initiation of atherosclerosis. Nature (London). 394 (6696), 894-897 (1998).
  7. Szmitko, P. E., et al. New Markers of Inflammation and Endothelial Cell Activation. Circulation. 108 (16), 1917-1923 (2003).
  8. Deshmane, S. L., Kremlev, S., Amini, S., Sawaya, B. E. Monocyte Chemoattractant Protein-1 (MCP-1): An Overview. J. Interferon Cytokine Res. 29 (6), 313-326 (2009).
  9. Chung, E. J., et al. Monocyte-Targeting Supramolecular Micellar Assemblies: A Molecular Diagnostic Tool for Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (3), 367-376 (2015).
  10. Chung, E. J. Targeting and therapeutic peptides in nanomedicine for atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 241 (9), 891-898 (2016).
  11. Sanz, J., Fayad, Z. A. Imaging of atherosclerotic cardiovascular disease. Nature (London, U. K.). 451 (7181), 953-957 (2008).
  12. Tarkin, J. M., et al. Imaging Atherosclerosis. Circ. Res. 118 (4), 750-769 (2016).
  13. Hennerici, M., Baezner, H., Daffertshofer, M. Ultrasound and arterial wall disease. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 19-33 (2004).
  14. Nissen, S. E. Application of intravascular ultrasound to characterize coronary artery disease and assess the progression or regression of atherosclerosis. Am J Cardiol. 89 (4A), 24B-31B (2002).
  15. Khalil, M. M., Tremoleda, J. L., Bayomy, T. B., Gsell, W. Molecular SPECT Imaging: An Overview. Int J Mol Imaging. 2011, 796025 (2011).
  16. Lerakis, S., et al. Imaging of the vulnerable plaque: noninvasive and invasive techniques. Am J Med Sci. 336 (4), 342-348 (2008).
  17. Sun, Z. H., Rashmizal, H., Xu, L. Molecular imaging of plaques in coronary arteries with PET and SPECT. J Geriatr Cardiol. 11 (3), 259-273 (2014).
  18. Godin, B., et al. Emerging applications of nanomedicine for the diagnosis and treatment of cardiovascular diseases. Trends Pharmacol. Sci. 31 (5), 199-205 (2010).
  19. Branco de Barros, A. L., Tsourkas, A., Saboury, B., Cardoso, V. N., Alavi, A. Emerging role of radiolabeled nanoparticles as an effective diagnostic technique. EJNMMI Res. 2 (1), 31-39 (2012).
  20. Jayagopal, A., Linton, M. F., Fazio, S., Haselton, F. R. Insights into atherosclerosis using nanotechnology. Curr. Atheroscler. Rep. 12 (3), 209-215 (2010).
  21. Khodabandehlou, K., Masehi-Lano, J. J., Poon, C., Wang, J., Chung, E. J. Targeting cell adhesion molecules with nanoparticles using in vivo and flow-based in vitro models of atherosclerosis. Exp Biol Med (Maywood). 242 (8), 799-812 (2017).
  22. Trent, A., Marullo, R., Lin, B., Black, M., Tirrell, M. Structural properties of soluble peptide amphiphile micelles. Soft Matter. 7 (20), 9572-9582 (2011).
  23. Hartgerink, J. D., Beniash, E., Stupp, S. I. Peptide-amphiphile nanofibers: A versatile scaffold for the preparation of self-assembling materials. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (8), 5133-5138 (2002).
  24. Missirlis, D., et al. Effect of the Peptide Secondary Structure on the Peptide Amphiphile Supramolecular Structure and Interactions. Langmuir. 27 (10), 6163-6170 (2011).
  25. Zhong, L., Johnson, W. C. Environment affects amino acid preference for secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (10), 4462-4465 (1992).
  26. Shimada, T., Lee, S., Bates, F. S., Hotta, A., Tirrell, M. Wormlike Micelle Formation in Peptide-Lipid Conjugates Driven by Secondary Structure Transformation of the Headgroups. J. Phys. Chem. B. 113 (42), 13711-13714 (2009).
  27. Missirlis, D., et al. Linker Chemistry Determines Secondary Structure of p5314-29 in Peptide Amphiphile Micelles. Bioconjugate Chem. 21 (3), 465-475 (2010).
  28. Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu. Rev. Mater. Sci. 26, 365-394 (1996).
  29. Xue, Y., O'Mara, M. L., Surawski, P. P. T., Trau, M., Mark, A. E. Effect of Poly(ethylene glycol) (PEG) Spacers on the Conformational Properties of Small Peptides: A Molecular Dynamics Study. Langmuir. 27 (1), 296-303 (2011).
  30. Canalle, L. A., Loewik, D. W. P. M., van Hest, J. C. M. Polypeptide-polymer bioconjugates. Chem. Soc. Rev. 39 (1), 329-353 (2010).
  31. Hamley, I. W. PEG-Peptide Conjugates. Biomacromolecules. 15 (5), 1543-1559 (2014).
  32. Acar, H., et al. Self-assembling peptide-based building blocks in medical applications. Adv. Drug Delivery Rev. , (2016).
  33. Busseron, E., Ruff, Y., Moulin, E., Giuseppone, N. Supramolecular self-assemblies as functional nanomaterials. Nanoscale. 5 (16), 7098-7140 (2013).
  34. Barrett, J. C., et al. Modular Peptide Amphiphile Micelles Improving an Antibody-Mediated Immune Response to Group A Streptococcus. ACS Biomater. Sci. Eng. 3 (2), 144-152 (2017).
  35. Toughrai, S., et al. Reduction-Sensitive Amphiphilic Triblock Copolymers Self-Assemble Into Stimuli-Responsive Micelles for Drug Delivery. Macromol. Biosci. 15 (4), 481-489 (2015).
  36. Swirski, F. K., et al. Monocyte accumulation in mouse atherogenesis is progressive and proportional to extent of disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (27), 10340-10345 (2006).
  37. Kashiwagi, M., et al. Association of monocyte subsets with vulnerability characteristics of coronary plaques as assessed by 64-slice multidetector computed tomography in patients with stable angina pectoris. Atherosclerosis (Amsterdam, Neth). 212 (1), 171-176 (2010).
  38. Chung, E. J., Tirrell, M. Recent Advances in Targeted, Self-Assembling Nanoparticles to Address Vascular Damage Due to Atherosclerosis. Adv. Healthcare Mater. 4 (16), 2408-2422 (2015).
  39. Cassetta, L., Pollard, J. W. Cancer immunosurveillance: role of patrolling monocytes. Cell Res. 26 (1), 3-4 (2016).
  40. Williams, C. B., Yeh, E. S., Soloff, A. C. Tumor-associated macrophages: unwitting accomplices in breast cancer malignancy. NPJ Breast Cancer. 2, (2016).
  41. Richards, D. M., Hettinger, J., Feuerer, M. Monocytes and Macrophages in Cancer: Development and Functions. Cancer Microenviron. 6 (2), 179-191 (2013).
  42. Schick, M. J. Effect of temperature on the critical micelle concentration of nonionic detergents. Thermodynamics of micelle formation. J. Phys. Chem. 67 (9), 1796-1799 (1963).
  43. Marullo, R., Kastantin, M., Drews, L. B., Tirrell, M. Peptide contour length determines equilibrium secondary structure in protein-analogous micelles. Biopolymers. 99 (9), 573-581 (2013).
  44. Hilbich, C., Kisters-Woike, B., Reed, J., Masters, C. L., Beyreuther, K. Substitutions of hydrophobic amino acids reduce the amyloidogenicity of Alzheimer's disease βA4 peptides. J. Mol. Biol. 228 (2), 460-473 (1992).
  45. Trevino, S. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. Amino Acid Contribution to Protein Solubility: Asp, Glu, and Ser Contribute more Favorably than the other Hydrophilic Amino Acids in RNase Sa. J. Mol. Biol. 366 (2), 449-460 (2007).
  46. Kim, S. W., Shi, Y. Z., Kim, J. Y., Park, K. N., Cheng, J. X. Overcoming the barriers in micellar drug delivery: Loading efficiency, in vivo stability, and micelle-cell interaction. Expert Opin Drug Delivery. 7 (1), 49-62 (2010).
  47. Rangel-Yagui, C. O., Pessoa, A., Tavares, L. C. Micellar solubilization of drugs. J. Pharm. Pharm. Sci. 8 (2), 147-163 (2005).
  48. Batrakova, E., et al. Fundamental relationships between the composition of pluronic block copolymers and their hypersensitization effect in MDR cancer cells. Pharm. Res. 16 (9), 1373-1379 (1999).
  49. Chen, L. J., Lin, S. Y., Huang, C. C. Effect of Hydrophobic Chain Length of Surfactants on Enthalpy-Entropy Compensation of Micellization. J. Phys. Chem. B. 102 (22), 4350-4356 (1998).

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

Bioingegneriaproblema 129monocitopeptidemicelleaterosclerosinanoparticelleimagingauto assemblaggiodiagnostica

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati