JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

DFS70 otoantikorlar doğru yorumu geleneksel HEp-2 yüzeylerde kullanırken zorlu yapma ortak enerjiye antikor hastalık ilişkili kalıpları taklit. Protokol üzerinden geleneksel HEp-2 eleme ve hem monospecific hem de karma ANA olumlu durumlarda yüksek güven ile DFS70 desenleri ayırt ANA'roman mühendislik HEp-2 substrat avantajları açıklar.

Özet

Sistemik otoimmün bağ dokusu bozuklukları (ANA) enerjiye antikorlar dolaşan tarafından karakterize edilmektedir. Eleme ANA için kullanılabilir çeşitli teknolojiler olmakla dolaylı ayirt (IIf) insan epitel hücreleri-2 (HEp-2) substrat kullanarak üstün hassasiyeti nedeniyle birincil ve önerilen yöntem kalır. HEp-2 yüzeylerde antikor bağlama çekirdek ve hücre sitoplazma dağıtılan çeşitli protein ve nükleik asit autoantigens ortaya çıkan desenler çok sayıda algılayabilir. Monospecific ve karışık desenler de olumlu tepkiler HEp-2 yüzey üzerinde kaynaklanan büyük çeşitlilik yorumu ve Doğruluk Raporlama karmaşık hale. Azami dikkat son zamanlarda alınan belirli bir örnek lens epitel elde edilen büyüme faktörü (LEDGF) adı verilen bir protein için özel olarak bağlayan otoantikorlar kaynaklanan yoğun iyi benekli 70 (DFS70) kalıptır. Belirli sistemik otoimmün hastalığı ve yüksek yaygınlık sağlıklı nüfus ile açık ilişkisi eksikliği DFS70 desen doğru yorumlanması önemli yaptık. DFS70 modeli gelen hastalık ilişkili desenleri geleneksel HEp-2 substrat kullanarak doğru ayrım zordur. Ayrıca, DFS70 desen homojen, benekli ve karışık homojen benekli desenleri gibi hastalık ilişkili desenleri ile birlikte sık ortak olay IIf yorumu karmaşık hale. Bu kağıt amacı bir romanın yardımcı programı aynı anda DFS70 desen hem de yüksek güven ile ayırt etmek olanağı sağlarken geleneksel HEp-2 substrat tüm avantajlarını korur HEp-2 IIf substrat mühendislik göstermektir monospecific ve karışık ANA olumlu örnekler. Yeni alt katman daha fazla hastalık ilişkili ANA desen daha önce gizlenmiş bir desen DFS70 meydana çıkarmak yapabiliyor.

Giriş

ANAs otoimmün aracılı sistemik bağ dokusu hastalıkları1damgasını vardır. Birkaç yöntem tarama ve ANAs onayı için istihdam edilmektedir. IIf tekniği HEp-2 substrat kalır en yaygın olarak kullanılan ve sık sık tavsiye edilen ANAs1,2süzmek için yöntem. Katı faz teşhis tahlil yöntemleri enzim bağlantılı immunosorbent assay (ELISA), enzim immunoassay (ÇED), Kemiluminesan immunoassay (CLIA) ve boncuk tabanlı multiplex deneyleri gibi gelişmeler rağmen IIf HEp-2 en yaygın tarama olduğu. yöntemi tanı kullanışlılığı ve maliyet etkinliği1,2,3. HEp-2 hücre monolayer hazırlıkları üzerinde cam slayt kuyu autoantigens geniş bir yelpazede kendi doğal formunda mevcut ise rekombinant autoantigens arasında dağıtılmış veya yukarıda belirtilen tahlil teknolojileri sınırlı miktarda saflaştırılmış yerli güvenmeyin çekirdek ve sitoplazma, bu hasta sera veya pozitif denetimleri, çeşitli otoimmün koşullarıyla ilişkili desen çok sayıda sonuçlanan otoantikorlar ile tepki. Bu kalıpları hücreler antijen konumunu temel alan nükleer, sitoplazmik ve Mitotik desenleri göre sınıflandırılır. Her model ve ilişkili antijen/antijenleri ve hastalık durumlarında de karakterize4vardır. IIf yönteminde, hasta ve kontrol sera uygun sabit autoantigens doğal yapılandırmalarında çok sayıda korumak için HEp-2 hücreleri monolayer kültürünün mevcut cam slayt wells üzerinde inkübe. Hasta sera veya pozitif denetimlerin otoantikorlar kuluçka sırasında belgili tanımlık substrate (cam kaymak iyi) üzerinde HEp-2 hücreleri tarafından sunulan autoantigens bağlamak için izin verilir. Sonrası kuluçka, ilişkisiz antikorlar yıkanır ve ilişkili antikorlar IgG sınıfının floresein/floresein isothiocyanate (FITC) konjuge Anti-insan ile IgG reaktif tespit edilir. İlişkisiz rapor eşlenik yıkadı ve cam coverslips, tepkiler koruyan ve gözlem floresan mikroskop altında kolaylaştırır bir montaj orta kullanarak slaytlar üzerine monte edilir. Kullanılan muhabir göre yapılandırılmış uygun uyarma-emisyon filtre kombinasyonu ile donatılmış bir floresan mikroskop altında gözlenen tepkiler (FITC muhabir için tanılama mikroskop genellikle filtreleri 467 uyarma yelpazesi ile kullanır -498 nm ve emisyon çeşitte 513-556 nm). Parlak yeşil floresan hücreleri belirli yapıların ANA varlığı gösterilmiştir. Otomatik tahlil platformlar, IIf metodoloji zahmetli seri sera ve önemli ölçüde kullanıcı uzmanlık5,6gerektiren görsel olumlu belirlenmesi boyama desenleri sulandrarak üzerinde dayanır. Bu sınırlamalar rağmen IIf HEp-2 tarafından en çok kullanılan kalır ve desenler (ICAP) Komitesi ANA uluslararası birliğine tarafından ANAs taraması nedeniyle Standartlaştırma çabaları desen yorumu ve adlandırma yöntemi önerilir, artırılmış kullanılabilirlik IIf slayt işleme ve sonuç yorumu3için otomasyon çözümleri.

Desen çok sayıda arasında HEp-2 IIf yöntemi, (LEDGF/p75/DFS70 da bilinir) psip1 gen ürünü hedefleme otoantikorlar tarafından algılanan, faiz önemli birkaç nedeni4,5 için son yıllarda kazanmıştır ,6,7,8,9,10. DFS70 otoantikorlar yüksek titreleri sağlıklı kontrol yok ve çalışmalar defa DFS70 otoantikorlar7,8,9 varlığı için ayrı bir klinik Derneği göstermek başarısız oldu ,10,11,12,13. Çeşitli hastalık durumlarında ve sağlıklı tabur yaygın olarak çeşitli çalışmalar6,8,9,10arasında,14 DFS70 otoantikorlar için bildirilen olumlu sonuçlar oranları ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Monospecific DFS70 desen de homojen veya benekli desenli karışık desenler homojen benekli yorumlanması ama gelen farklılaşmış ve diğer ANAs ile birlikte meydana gelen anti-DFS70 antikor bile uzman okuyucular için zor. Tarama yöntemleri ve DFS70 belirli katı faz deneyleri IIf şimdiki nesil bir monospecific karışık desenler (şekil 1A, algoritma sarı gölgeli alan) DFS70 tepki ayırt yeteneğine sahip değildir. DFS70 desen olarak homojen, benekli, veya karma desen veya tersi, yanlış yorumlanmasına hasta bakımı üzerinde ciddi etkileri olabilir. Geçerli sık kullanılan iletişim kuralı aşağıdaki gibidir: Klinik Laboratuvarları katı faz doğrulama testleri çok sayıda hastalık ilişkili ANAs için işe ve/veya DFS70/LEDGF (AC-2) desen yoğun güzel benekli zaman için bir immunoadsorption yöntemi (şekil şüpheleniliyor 1a)4,5.

Bu iletişim kuralının amacı yardımcı programı bir romanın mühendislik HEp-2 IIf substrat göstermektir (HEp-2 ELITE/DFS70 nakavt (KO), anılacaktır HEp-2 ELITE) bu ANAs iken aynı anda eleme için geleneksel HEp-2 tüm avantajlarını korur DFS70 desen monospecific ve karışık ANA olumlu durumlarda (şekil 1B, sarı gölgeli alan algoritma)5yüksek güven ile ayırt etme. HEp-2 ELITE substrat değiştirilmemiş geleneksel HEp-2 hücreleri ve LEDGF/p75/DFS70 antijen 1:9 oranı5yoksun mühendislik hücreleri yaklaşık bir karışımı oluşur. HEp-2 elit için IIf yordamı için geleneksel HEp-2 yöntemi aynıdır. HEp-2 ELITE substrat benzersiz yapılandırma sadece geleneksel HEp2 tüm avantajlarını korur ama DFS70 desen başlangıç tarama veya örneği (şekil 1B test homojen, benekli ve karışık tepki desenleri ayırt )5. HEp-2 IIf substrat bulunan slaytlarda tepki için hasta sera seyreltilmiş 1:40 seyreltme eleme ile ya da aynı derecede bireysel laboratuar kriter olmalıdır. 1:40 ya da daha yüksek titresi belirli bir tepki pozitif olarak kabul edilir.

Bu çalışma, homojen, benekli, şeması, genelde, sitoplazmik Retiküler/AMA ve orta olumlu sinyal (göre negatif kontrol ve paketi tarafından sağlanan olumlu ANA denetimi) gösterimde üretilen DFS70 desenler için olumlu sera 1:40 seyreltme mono özgü ve karışık desenler HEp-2 yüzeyler üzerinde simüle için seçildi (konvansiyonel ve HEp-2 elit). 1:40 1:40 ile seyreltilmiş DFS70 olumlu sera karıştırıldı bireysel hastalık ilişkili ANA dilutions kontroller (homojen, benekli, şeması, genelde, veya sitoplazmik Retiküler AMA) çeşitli oranları (100:0, 80:20, 50: 50, kontrol: DFS70 yılında desen. 20:80 ve 0:100) ve geleneksel olarak değerlendirilir ve HEp-2 ELITE yüzeylerde takip IIf prosedür ana hatlar aşağı.

Protokol

Protokol Trinity biyoteknoloji kurumsal insan araştırma Etik Komitesi kuralları izler.

1. örnek ve yüzey hazırlama

  1. Substrat slaytları içeren torbalar içinde izin (cam HEp2 ya da HEp içeren her bir slayt üzerinde 12 kuyu ile slaytlar-2 + HEp2 KO hücre karışımı) oda sıcaklığında en iyi performans için equilibrate ve nem önce slayt yüzeyinde yoğunlaşma önlemek için örnek eklenmesi. Bu yaklaşık 10-15 dakika arasında sürer.
  2. Sonra oda sıcaklığında equilibrated, onlara dokunmadan kese kenarlarında parmak kullanarak substrat slaytları dikkatli bir şekilde çıkarın.
  3. Slaytları etiket ve örnek ve eşlenik kuluçka sırasında slayt kurutma önlemek için su ile nemlendirilmiş kağıt havlu ile kaplı bir kuluçka Odası (oda sıcaklığında) içinde koyun.
    Not: Non-spesifik boyama kuru kuyulardan neden olabilir; bir ıslak kağıt havlu kuluçka odası içinde nem sağlar ve iyi kuruluk engeller.

2. ek denetimleri ve örnekleri

  1. Yaklaşık 50 µL negatif/pozitif kontrollerin DFS70-ANA olumlu sera kombinasyonları bu çalışma veya hasta serum numuneleri üzerine tek tek slayt wells açıklandığı gibi dağıtmak.
  2. Control(s) ve örnekleri slayttaki her kuyuya dağıtmak.
  3. İyi çapraz kontaminasyonu önlemek için kuyuları yavaşça kaçının. Kuyu yavaşça değil, süre iyi yüzey komple kapsama sağlamak ve hava kabarcıkları kaçının.
    Not: Adım 2.1 göre 50 µL önerilen birimdir.
  4. Kuluçka odası kapağı yerleştirin ve oda sıcaklığında 30 dk slaytlarını kuluçkaya. Herhangi bir ANA hastanın serum içinde mevcut ise, bu kuluçka döneminde her kuyuya mevcut hücreleri bağlayacaksınız.
  5. Kuluçka süresi bittikten sonra slayt kuluçka odasından kaldırın. Slayt sekmesini sonunda tutun ve yavaşça bir pipet kullanarak Seti'nde sağlanan yaklaşık 10 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) yıkama arabellek ile durulayın ya da 10-15 s. için PBS ile dolu bir ölçek slayt hemen PBS yıkama arabellek ve yıkama (bir Coplin kavanoza aktarın 10 dk. tekrar süreci ile tüm kalan slaytlar için emmek).
    Not: birden fazla slayt Coplin kavanoza koyarak sağlamak zaman slayt hücre tarafında başka bir slayt ile değil bu da yol açar gibi hücreleri zarar cam slayt üzerinde yapıştırılır.

3. floresan eşlenik eklenmesi

  1. Tek bir slayt teker teker Coplin kavanozdan kaldırın. Aşırı PBS yıkama arabellek slaytından kaldırmak için hafifçe dokunun veya slayt kağıt havlu üzerinde leke. Her kit Anti-insan IgG floresan eşlenik etiketli FITC ile sağlanır. Her şey üstünde-e doğru yavaşça 1 damla (yaklaşık 50 µL) sağlanan eşlenik uygulanır.
  2. Slaytlar için 30 dk kapalı boyama kuluçka odasında kuluçkaya.
    Not: Fc belirli IgG eşlenik kullanılması önerilir. ANA herhangi bir hasta serum içinde mevcut ise, mevcut her kuyuya wells mevcut hücrelerin belirli Floresans sonuçlanan bu kuluçka döneminde hücrelere eşlenik olmasını bağlayacaksınız. Eşlenik olmasını ışığa duyarlıdır. Kapalı kuluçka odası ışık her kuyuya mevcut hücrelerin eşlenik tepki ile etkilenmemesi için yardımcı olacaktır.
  3. Kuluçka süresi bittikten sonra slayt kuluçka odasından kaldırın. Slayt sekmesini sonunda tutun ve yavaşça yaklaşık 10 mL PBS yıkama arabellek kullanarak bir pipet seti veya PBS ile dolu bir ölçek ile durulayın. 10 dk. tekrarlamak için kalan tüm slaytlar işlemine slayt hemen PBS yıkama tamponu ve yıkama (emmek) bir Coplin kavanoza aktarın.
    Not: birden fazla slayt Coplin kavanoza koyarak sağlamak zaman slayt hücre tarafında başka bir slayt ile değil bu da yol açar gibi hücreleri zarar cam slayt üzerinde yapıştırılır.
  4. Sağlanan coverslips kuru kağıt havlu seti yerleştirin. Montaj media kit ile sağlanır. 3-4 damla bir çizgi montaj medya arasında coverslip alt kenarına uygulayın.
  5. Bir kaymak dışarı bir zamanda yıkama arabellek içeren Coplin kavanozdan almak. Fazla yıkama arabellek kaldırmak için hafifçe dokunun veya slayt kağıt havlu üzerinde leke.
  6. Sürgüyü yavaşça üstünde-e doğru coverslip coverslip kenarına slayt alt kenarına yerleştirerek indirin. Bu slayt üst kenarına akmaya alt kenar coverslip montaj medya sağlar ve her şey bir slaydın okuma ile girişime neden olabilir hava kabarcıklarının oluşumunu en aza indirir.
    Not: En az basınç kapağı slayt slayt üzerine takmak için kullanılır. Herhangi bir aşırı basınç kapağı kâğıdını yanal hareket neden olabilir. Bu hücreler ve sonuç monolayer hazırlanması bozulma zarar verebilir.
  7. 2-8 ° C'de karanlıkta slaytları depolama En kısa zamanda onlar monte edilir ya da 48 saat içinde slaytları inceleyin.
    Not: Uzun depolama desen ve floresan sinyal bozulmasına neden olabilir.

4. olumlu ve olumsuz sonuçları tanımlaması

  1. Karanlık bir odada bulunan bir FITC filtre kümesini kullanarak floresan mikroskop ile slaytları görüntülemek.
  2. Belirli parlak yeşil Floresans 200 X veya pozitifliği ile ilgili son yorumu yapmak ve desen daha büyük bir büyütmede floresan mikroskop altında incelemek. Pozitif ve negatif denetimleri gözlemlemek.
    Not: Olumlu denetim parlak yeşil Floresans çekirdeği (şekil 2A, homojen) görüntüler. Negatif kontrol hiçbir belirli yeşil Floresans floresan mikroskop altında görüntüler.
  3. Her şey için pozitif/negatif sonucu kaydedebilir ve ANA desen olumlu durumlar için.

Sonuçlar

Hepatit-2 ELITE/DFS70 KO substrat klasik ANA desen korur ve DFS70 desen açık ayrım kolaylaştırır:

LEDGF/p75 hariç tüm autoantigens koruyarak ELITE/DFS70 HEp-2 KO substrat geleneksel ve mühendislik hücrelerdeyse aynıdır. Kit ile sağlanan negatif kontrol temel floresan sinyal kurar. Pozitif denetimlere HEp-2 ELITE şeması, homojen, benekli, genelde ve mitokondrial modelleri için bir desen beklenen kalıpları geleneksel HEp-2 IIf substrat (şekil 2A) üzerinde aynı üretmek. Bu başvuru desenleri her desen'ın antijen ve hastalığı Derneği ile birlikte ayrıntılı olarak tarif var daha önce4,29. Şekil 2A gözlenen desenleri hakkında kısa bir açıklama Tablo 1' de temin edilmektedir.

HEp-2 elit DFS70 desen:

Her hücre yaklaşık yüzde 10'u de yoğun bir iyi benekli desen göstermek (adlandırma atanan ICAP: AC-2) Interphase çekirdeği üzerinde görülebilir ve ilişkili Kromatin boyama (2B rakam) Mitotik çekirdeği görülür. Geleneksel HEp-2 yüzey üzerinde tüm hücreleri bu deseni ile DFS70 olumlu örnek tepki olacaktır. HEp-2 hücreleri kalan % ~ 90 nakavt LEDGF antijen kodlama psip1 gen vardır ve bu nedenle bir sinyal veya ne zaman bir monospecific DFS70 olumlu serum (şekil 2B) ile tepki desen üretmek değildir. HEp-2 hücreleri yüzde 10'u daha parlak floresan DFS70 desen ve hücreleri mevcut ek desenleri (Örneğin, para cezası benekli veya genelde) geri kalanı için karşılık gelen varsa, bu karışık desenler varlığını gösterir. Böyle desen daha yakından incelendiğinde DFS70 desen yanı sıra mevcut tüm antikor özelliklerine onaylamak için esastır. HEp-2 ELITE substrat, sera örnekleri ile oluşturulmuş bir panel yeteneğini göstermek için çeşitli DFS70 ve ANA pozitif konsantrasyonları sera kontrol ve geleneksel hem de test ve standart IIf kullanarak HEp-2 ELITE yüzeylerde (şekil 3 protokol , 4 rakam, 5 rakam, 6 şekil, Şekil 7).

DFS70 Monospecific ve konvansiyonel ve hepatit-2 elit yüzeyler üzerinde karışık tepkiler yorumlanması:

İçin belirli her hastalık ilişkili ANA desen (3 rakam, 4 rakam, 5 rakam, 6 şekil, Şekil 7), bir monospecific ANA desen sol tarafta çoğu sütun ve bir monospecific DFS70 desen sağ tarafta çoğu sütun görülebilmektedir. Orta üç sütun çeşitli hastalık ilişkili oranları ve DFS70 desen olumlu kontrolünü temsil eden. Elde edilen karma desenler geleneksel HEp-2 substrat (şekil 3, şekil 4, şekil 5, şekil 6, Şekil 7, üst satır) üzerinde ayırt etmek zor. Ancak, örnekleri, çoğunda roman Hep-2 ELITE substrat ile yoğunluklarda unmodified ve mühendislik hücreleri arasındaki farkı (daha az parlak hücrelere daha parlak oranını olduğunda hangi sadece DFS70 otoantikorlar varlığını doğruluyor farklıdır 1:9) ama aynı zamanda bir ikincil ANA deseni ortaya koymaktadır. DFS70 homojen veya benekli DFS70 tepkiler karışık, güvenle ek deneyleri (şekil 1A) bir dizi çalıştırmak için gözle labs açan doğru deseni tahmin etmek mümkün değildir. Karışık tepkiler, DFS70 pozitif çok zordur şüphelenen (şekil 5, şekil 6) şeması-DFS70 ve DFS70 genelde durumunda. Sera oranı % 50 ulaşıncaya kadar genelde ve sitoplazmik Retiküler/AMA tepkiler ile DFS70 desen baskın değil. Tüm örneklerde HEp-2 ELITE substrat DFS70 desen sunabilir ve temel ikincil desen yoğunluğu daha geniş bir yelpazesi üzerinde düzeyleri ve böylece daha doğru bir ANA yorumu kolaylaştırır.

Karışık desenler, çeşitli 50: 50 kombinasyonları ANA ve DFS70 büyütülmüş (şekil 8) için hem geleneksel ve HEp-2 ELITE yüzeylerde denetimleri vardı olumlu sonuçlar yakından gözlemlemek için. Interphase ve Mitotik yorumu ve bildirilen model doğruluğunu geliştirmek için DFS70 HEp-2 yüzeyler üzerinde de dahil olmak üzere tüm ANA desen için boyama gözlemlemek için teşvik edilir. Ancak, karışık desenler için hücre çekirdek bölünmesi ile sunulan farklı desen doğru yorumlanmasını kolaylaştırmak için yeterli olmayabilir. Kırmızı oklar (şekil 8), mühendislik ve konvansiyonel hücredeki Mitotik hücre çekirdeği gösterir. Bu reaksiyonlar hücre bölünmesi üzerinde uygun DFS70 ile kurulan küme kurallar, hastalık ilişkili yorumlanması için ANA desenleri karışık görülebilmektedir. Sarı ve mavi oklar unmodified ve mühendislik (DFS70 KO) HEp-2 hücre çekirdeği, sırasıyla gösterir. Tüm kombinasyonlar içinde (şekil 8), değiştirilmemiş hücre nükleer boyama (~ % 10) ve mühendislik hücre nükleer (~ %90) desen bir açık yoğunluk farkı aynı mikroskobik görüş alanı içinde eş zamanlı tarama sağlayan görülmektedir ve DFS70 desen onay.

figure-results-5715
Şekil 1: geleneksel HEp-2 ve HEp-2 ELITE/DFS70 KO IIf yöntemlerle algoritmaları eleme ANA. (A)şematik unravels geleneksel HEp-2 IIF içinde monospecific ve karışık DFS70 olumlu desenleri tarama aşamasında (sarı gölgeli alan) belirlenmesi eksikliği ve bir ikincil hastalık ilişkili ANA desen ekarte etmek için onun yetersizlik olabilir DFS70 desenine göre karşı daha fazla. , DFS70 belirli katı faz doğrulayıcı deneyleri için ek doğrulama sınama ANAs için yol monospecific DFS70 pozitifliği onaylamak mümkün değildir şimdiki nesil daha fazla. (B) şematik ANAs, monospecific ve karışık DFS70 tepkiler, eşzamanlı ayrım ile taranması için HEp-2 ELITE yeteneklerini açığa çıkarır ve katı faz DFS70 ihtiyacını ortadan kaldırarak deneyi onay. HEp-2 ELITE önemli ölçüde kullanarak algoritma eleme ANA basitleştirir ve onay deneyleri süreyi azaltır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-6918
Şekil 2: ELITE/DFS70 HEp-2 KO substrat klasik ANA ve DFS70 desenine. (A)ELITE/DFS70 HEp-2 KO substrat klasik ANA desen korur. Klasik homojen tepki ve DFS70 olumlu tepkiler kit tarafından sağlanan olumlu denetimlerini kullanarak üretildi. Diğer tepkiler daha önce kurulan olumlu denetim sera benekli, şeması, genelde ve sitoplazmik Retiküler/AMA reaksiyonlar5kullanılarak üretildi. (B) ELITE/DFS70 HEp-2 KO substrat sağlar geleneksel ve mühendislik hücreleri, hangi kolay ayrım DFS70 desen kolaylaştırır. Şematik elde edilen DFS70 monospecific tepki ve desen Interphase boyama ve hücre çekirdeği hem geleneksel hem de mühendislik (DFS70-KO) hücrelerin bölünmesi gösterir. Mühendislik HEp-2 DFS70 antikor reaksiyonu geleneksel HEp-2 yüzeyler üzerinde tarafından genellikle gizli ikincil desenleri aynı anda tespiti sağlar LEDGF/p75/DFS70 antijen yoksun hücrelerdir. Oklar (sarı), Mitotik hücre çekirdeği örnekleri gösterir. Ölçek çubukları temsil 20 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-8257
Şekil 3: DFS70 ve homojen sera birlikte. DFS70 monospecific sera çeşitli oranları (100:0, 80:20, 50: 50, 20:80 ve 0:100) pozitif homojen desen denetiminde ile birlikte ve geleneksel ve mühendislik (DFS70-KO) HEp-2 yüzeyler üzerinde test edilmiştir. Ölçek çubukları temsil 20 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-8865
Şekil 4: DFS70 ve benekli sera birlikte. DFS70 monospecific sera çeşitli oranları (100:0, 80:20, 50: 50, 20:80 ve 0:100) pozitif benekli desen denetiminde ile birlikte ve geleneksel ve mühendislik (DFS70-KO) HEp-2 yüzeyler üzerinde test edilmiştir. Ölçek çubukları temsil 20 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-9473
Şekil 5: DFS70 ve şeması sera birlikte. DFS 70 monospecific sera bir pozitif şeması desen denetiminde çeşitli oranları (100:0, 80:20, 50: 50, 20:80 ve 0:100) ile birlikte ve geleneksel ve mühendislik (DFS70-KO) HEp-2 yüzeyler üzerinde test edilmiştir. Ölçek çubukları temsil 20 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-10084
Şekil 6: DFS70 ve birlikte genelde sera. DFS 70 monospecific sera çeşitli oranları (100:0, 80:20, 50: 50, 20:80 ve 0:100) pozitif genelde desen denetiminde ile birlikte ve geleneksel ve mühendislik (DFS70-KO) HEp-2 yüzeyler üzerinde test edilmiştir. Ölçek çubukları temsil 20 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-10693
Şekil 7: DFS70 ve sitoplazmik Retiküler/AMA sera birlikte. DFS70 monospecific sera çeşitli oranları (100:0, 80:20, 50: 50, 20:80 ve 0:100) pozitif mitokondrial desen denetiminde ile birlikte ve geleneksel ve mühendislik (DFS70-KO) HEp-2 yüzeyler üzerinde test edilmiştir. Ölçek çubukları temsil 20 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-11324
Şekil 8: geleneksel olarak üretilen modelleri (50: 50 oranı) karışık ve HEp-2 ELITE yüzeylerde. İki yüzeylerde arasındaki farklar ortaya çıkar. Kırmızı oklar, her iki yüzeylerde mühendislik ve konvansiyonel hücrelerinde Mitotik hücre çekirdeği gösterir. Bu birleşimleri için hücre çekirdeği geleneksel HEp-2 substrat olarak bölünmesi ile sunulan farklı desen karışık desenler doğru yorumlanması için yeterli değildir. Hücre bölünmesi üzerinde karışık DFS70 tepkiler kural hastalık ilişkili yorumlanması için kurulan kümesinin ANA desen huzursuz ki görülebilmektedir. Sarı ve mavi oklar unmodified ve mühendislik (DFS70 KO) HEp-2 hücre çekirdeği, sırasıyla gösterir. Tüm kombinasyonlar için elde edilen sonuçlar üzerinde mühendislik substrat test: ait Interphase nükleer desen net yoğunluk farkı değiştirilmemiş hücreleri (~ %10) ve mühendislik hücreleri (~ %90) gözlenen, etkin eş zamanlı DFS70 desen ile ve algılama. Ölçek çubukları temsil 20 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

ANA desenAçıklama
HomojenTüm çekirdeği eşit olarak diffüz boyama desen fluoresces.
BenekliAyrık, speckles, ince ayar yapmak için kaba çekirdeği bulabilsem.  İyi benekli ve kaba benekli desenleri anlatmıştık.
GeneldeÇekirdek içinde birden çok katı veya benekli organları olarak nükleulus leke. Alt türlerinden daha önce anlatmıştık.
ŞemasıBüyük speckles sonlu numarası. Reaktif antijen ile yoğun kromozomlar mitoz geçiren hücrelerdeki harmanlama.
Sitoplazmik Retiküler/AMASitoplazma olumlu mitokondri boyama ile taneli görünür.
DFS70•24V HEp-2 hücreleri: yoğun iyi benekli desen Interphase çekirdeği ve ilişkili Kromatin boyama Mitotik hücre çekirdeği üzerinde görülür görülmektedir.
•Engineered hücre DFS70 KO: Anti-DFS70 antikor üretmek negatif boyama
HEp-2 Elite / DFS70 KO geleneksel ve mühendislik (DFS70 KO) hücrelerinde yaklaşık 1:9 oranı vardır. Geleneksel hücreler tipik DFS70 deseni üretmek ve bir DFS70 monospecific/izole olumlu tepkiler ile tepki zaman olumsuz bir desen mühendislik hücreleri üretirler.

Tablo 1: açıklama ANA desen.

Tartışmalar

Otoantikorlar nükleer ve sitoplazmik antijenleri için sistemik otoimmün hastalıklarda son derece yaygındır. Yok tek tahlil en iyi olası duyarlılık ve özgüllük sağlasa da, IIf HEp-2 yaygın sistemik otoimmün hastalıklar2,3,4 için son derece hassas ve maliyet-etkin tarama yöntemi olarak kabul edilir . 50 yıldan fazla için IIf Protokolü yaygınlığı rağmen IIf tahlil doğruluğunu son derece teknisyen, dikkatli yürütülmesi iletişim kuralının tek tek adımları ve sonuçları bir bakımlı kullanarak doğru yorumlanması yeteneklerinize bağlıdır Floresan mikroskop. Sistemik otoimmün hastalığı tanısı IIf gibi tek bir serolojik test sonuçlarını HEp-2 tarafından dayalı olmamalıdır.

Yüksek kaliteli kullanarak reaktifler sulandırma (/ deiyonize distile) su, Standart kit bileşenleri (slayt HEp-2 hücre monolayers, örnek seyreltici, pozitif ve negatif kontrol eder, önceden seyreltilmiş en iyi duruma getirilmiş FITC eşlenik ve montaj orta) kullanın sonuçları üzerinde olumlu bir etkiye sahip. Denetimleri veya örnekleri eklenmesi wells atlama yanlış negatif Yorumlar teşvik edebilir. Herhangi bir noktada slaytların örnek veya denetimi eklenmesi manipülasyonun yanlış olumlu tepkiler ve/veya uygunsuz desenleri neden olabilir sonra kurutma. Çok fazla yıkama arabellek olan slayttan yaptı veya slayt Wells montaj orta ve öncesinde kurutma aktarımında neden olabilir. Orta montaj veya bir coverslip yerleştirerek önce slayt yüzeyinde kabarcıklar üreten yeterli miktar ekleme bulanık ya da mikroskop altında gözlenen odak dışı tepkiler neden olabilir. Bağlı slayt 2-8 ° C'de depolanan ve zaman yanlış negatif veya manipülasyonun sonuçları en aza indirmek için önerilen penceresi içinde analiz gerekir.

Hangi uygun bir LED/Hg/Xenon ışık kaynağı ve hasar görmemiş uyarma ve emisyon filtreleri de dahil olmak üzere temiz optik bileşenleri evler bakımlı bir epi-floresan mikroskop kullanarak doğru IIf sonuç elde etmek için önemlidir. Son kullanıcı eğitim ayrımcılık pozitif/negatif reaksiyon yoğunluklarda ve desenler yorumlanması için önemlidir. HEp-2 IIf deneyleri belirli yordamlar, mikroskop yapılandırma ve son kullanıcı eğitimi veya beceri için güvenlik açığından etkilenir. Fikir birliği isimlendirme ve temsilcisi desen ve çeşitli üreticilerin kullanarak alınan görüntüleri örnekleri ICAP tarafından kullanılabilir yapılır (< www.ANApatterns.org>) eğitim amaçlı4için. ICAP tarafından sağlanan çeşitli nükleer, sitoplazmik ve Mitotik desenler için HEp-2 hücre desen sınıflandırma ağaç eğitimsiz gözler4' e benzer görünebilir çeşitli desenler arasındaki ince farkları öğrenmek için değerli bir kaynaktır. Ayrıca otoimmün bir koşulu ile ayrı bir dernek yoksun DFS70 zorlu bir desen birincil örneklerinden biridir ve sağlıklı nüfus5' te önceki bölümlerde açıklandığı gibi bu model son derece yaygındır.

Çalışma bağlı olarak anti-DFS70 otoantikorlar yaygınlığı değişir sağlıklı kohort arasında ANA tarama nüfus ve ANA olumlu bireyler ile sistemik Otoimmün hastalık9,16,20 izine rastlanmadı ,30,31. DFS70 otoantikorlar yalıtım yanı sıra diğer hastalık ilişkili ANA desenleri ile oluştuğu bildirilmiştir. İzole veya monospecific DFS70 desen 2-%22 sağlıklı kontrol ama otoimmün romatizmal hastalık32olan olguların % 1'den daha az bildirilmektedir. Bu eğilimleri üzerinde bağlı olarak, DFS70 mono-pozitif desen otoimmün romatizmal hastalıklarda dışlamak için ölçüt olarak ICAP Komitesi3,31,32tarafından önerilmiş. Antikor testi adlandırma uyumlaştırılması ve yorumu DFS70 pozitifliği ANA sırasında bildirdiği önerir HEp-2 IIf sonuçlarının tanıtmak için kurulan ICAP komite sonuçları4eleme.

Sistemik Otoimmün hastalık DFS70 mono-pozitif üzerinde dayalı dışarı iktidar önce geçerli tarama ve onay yöntemleri (özellikle bu özel DFS70 için) durumunu gözden geçirmek için hayati önem taşımaktadır. DFS70 HEp-2 IIf ve katı faz doğrulayıcı deneyleri Yani ELISA pozitifliği, CLIA ve satır immunoassay/nokta leke yöntemleri arasındaki anlaşma) yaygın olarak çeşitli çalışmalar13,22,25arasında,33 çeşitli . Daha önce tartışılan5,13,34IIf yorumu ve doğrulayıcı tahlil bu anlaşmazlık için katkıda parametreleri olmuştur. Anti-DFS70 antikor onay son zamanlarda önerilen immunoadsorption yaklaşım bazı geçerli katı faz deneyleri eksiklikleri (DFS70 için) adresleri ama IIf yordam şüpheli örnekleri üzerinde ek bir adım gerçekleştirmek için labs gerektirir hangi sonuçları13bildirdiği için maliyet ve geri dönüş süresi artar. ELITE/DFS70 HEp-2 KO hücreleri rutin ANA tarama için kullanıldığında ek bu adım gerekli değildir. Bu toplam maliyeti azaltır ve ayrıca işte gerçekleştirme süresi üzerinde hiçbir etkisi DFS70 desen başlangıç tarama ayırt gibi adım27. Geleneksel HEp-2 IIf yöntemi kullanarak ek bir dezavantaj ile diğer ANA desen tarama aşamasında işbirliği meydana gelen DFS70 desen ayırt edemiyor olmasıdır. Ancak, bu dezavantajı ELITE/DFS70 HEp-2 KO hücreleri27kullanımı ile üstesinden olduğunu.

Geleneksel HEp-2 ve yeni tasarlanmış HEp-ANA pozitif kontrol eder ve onların birleştirme bir mono-pozitif DFS70 denetimle kullanarak 2 (ELITE/DFS70 HEp-2 KO) karşılaştırmalı değerlendirme göstermek yeni alt katman'ın yetenek-e doğru belgili tanımlık yarar aynı anda ANAs için ekran ve DFS70 desen (şekil 1) onaylayın. Yeni alt katman için IIf protokolü için geleneksel HEp-2 IIf yöntemi aynıdır. Tüm hastalık ilişkili ANA desen için yorumu şeması DFS70 desen (Tablo 1) dışında aynıdır. Mono-pozitif ve karışık DFS70 desenleri yorumlanması yeni yöntemle nispeten daha kolay ve ek deneyleri (şekil 1B) garanti etmez. Klinik laboratuvar bu yeni yöntemin uygulanması DFS70 desen yorumu ile ilişkili meydan basitleştirir ve hastalık ilişkili daha fazla ifşa tarafından ANA tarafından daha önce gizlenmiş desenleri eleme ANA genel doğruluğunu artırır DFS70 (desenleri karışık).

Açıklamalar

Yazarlar Kishore Malyavantham ve Lakshmanan Suresh Trinity biyoteknoloji, ABD, çalışanlardır.

Teşekkürler

Andrew Zenger IIf deneyler yapmak ve görüntüleri toplama için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 Well Slide sealed individually in pouchTrinity Biotechpart of kit# 1108, 1108-120, 1108-240
ANA positive controlTrinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
DFS70 antibody positive controlTrinity Biotechpart of kit# 1108, 1108-120, 1108-240
Negative controlTrinity Biotechpart of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Anti-human IgG FITC conjugate containing Evan's blue counterstainTrinity Biotechpart of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Buffer diluent for serumTrinity Biotechpart of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Phosphate buffered saline (PBS)Trinity Biotechpart of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Mounting mediumTrinity Biotechpart of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Coverslips Trinity Biotechpart of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 well slide sealed individually in pouchTrinity Biotechpart of kit# 1103, 1103-240
NameCompanyCatalog NumberComments
Materials used in the study but not provided by the kits
Diagnostic fluorescent microscopeNikon Eclipse 50iEquipped with a spot dignostic camera, model 2.2.1
Incubation chamberTrinity Biotechprovided for customers (no catalog #)
Coplin jarn/aGeneral labware
Paper towelsn/aGeneral lab supplies
distilled/deionized watern/aGeneral lab supplies

Referanslar

  1. American College of Rheumatology. Position Statement. Methodology of testing for antinuclear antibodies. , Available from: https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf (2011).
  2. Meroni, P. L., Schur, P. H. ANA screening: an old test with new recommendations. Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).
  3. Agmon-Levin, N., et al. International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies. Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).
  4. Chan, E. K., et al. Report of the First International Consensus on Standardized Nomenclature of Antinuclear Antibody HEp-2 Cell Patterns 2014-2015. Front Immunol. 6, 412(2015).
  5. Malyavantham, K., Suresh, L. Analysis of DFS70 pattern and impact on ANA screening using a novel HEp-2 ELITE/DFS70 knockout substrate. Auto Immun Highlights. 8 (1), 3(2017).
  6. Sperotto, F., Seguso, M., Gallo, N., Plebani, M., Zulian, F. Anti-DFS70 antibodies in healthy schoolchildren: A follow-up analysis. Autoimmun Rev. , (2017).
  7. Ayaki, M., et al. Detection of cytotoxic anti-LEDGF autoantibodies in atopic dermatitis. Autoimmunity. 35 (5), 319-327 (2002).
  8. Ochs, R. L., et al. Autoantibodies to DFS 70 kd/transcription coactivator p75 in atopic dermatitis and other conditions. J Allergy Clin Immunol. 105 (6 Pt 1), 1211-1220 (2000).
  9. Watanabe, A., et al. Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers. Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).
  10. Yamada, K., et al. Humoral immune response directed against LEDGF in patients with VKH. Immunol Lett. 78 (3), 161-168 (2001).
  11. Seelig, C. A., Bauer, O., Seelig, H. P. Autoantibodies Against DFS70/LEDGF Exclusion Markers for Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases (SARD). Clin Lab. 62 (4), 499-517 (2016).
  12. Ochs, R. L., et al. The significance of autoantibodies to DFS70/LEDGFp75 in health and disease: integrating basic science with clinical understanding. Clin Exp Med. 16 (3), 273-293 (2016).
  13. Bizzaro, N., et al. Specific chemoluminescence and immunoasdorption tests for anti-DFS70 antibodies avoid false positive results by indirect immunofluorescence. Clin Chim Acta. 451 (Pt B), 271-277 (2015).
  14. Bizzaro, N., et al. Antibodies to the lens and cornea in anti-DFS70-positive subjects. Ann N Y Acad Sci. 1107, 174-183 (2007).
  15. Daniels, T., et al. Antinuclear autoantibodies in prostate cancer: immunity to LEDGF/p75, a survival protein highly expressed in prostate tumors and cleaved during apoptosis. Prostate. 62 (1), 14-26 (2005).
  16. Dellavance, A., et al. The clinical spectrum of antinuclear antibodies associated with the nuclear dense fine speckled immunofluorescence pattern. J Rheumatol. 32 (11), 2144-2149 (2005).
  17. Gundin, S., et al. Measurement of anti-DFS70 antibodies in patients with ANA-associated autoimmune rheumatic diseases suspicion is cost-effective. Auto Immun Highlights. 7 (1), 10(2016).
  18. Kang, S. Y., Lee, W. I. Clinical significance of dense fine speckled pattern in anti-nuclear antibody test using indirect immunofluorescence method. Korean J Lab Med. 29 (2), 145-151 (2009).
  19. Lee, H., Kim, Y., Han, K., Oh, E. J. Application of anti-DFS70 antibody and specific autoantibody test algorithms to patients with the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells. Scand J Rheumatol. 45 (2), 122-128 (2016).
  20. Mariz, H. A., et al. Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody-positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases. Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).
  21. Marlet, J., et al. Thrombophilia Associated with Anti-DFS70 Autoantibodies. PLoS One. 10 (9), e0138671(2015).
  22. Mercado, M. V., et al. Detection of autoantibodies to DSF70/LEDGFp75 in Mexican Hispanics using multiple complementary assay platforms. Auto Immun Highlights. 8 (1), 1(2017).
  23. Muro, Y., Sugiura, K., Morita, Y., Tomita, Y. High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease. Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).
  24. Muro, Y., Sugiura, K., Nakashima, R., Mimori, T., Akiyama, M. Low prevalence of anti-DFS70/LEDGF antibodies in patients with dermatomyositis and other systemic autoimmune rheumatic diseases. J Rheumatol. 40 (1), 92-93 (2013).
  25. Mutlu, E., Eyigor, M., Mutlu, D., Gultekin, M. Confirmation of anti-DFS70 antibodies is needed in routine clinical samples with DFS staining pattern. Cent Eur J Immunol. 41 (1), 6-11 (2016).
  26. Okamoto, M., et al. Autoantibodies to DFS70/LEDGF are increased in alopecia areata patients. J Autoimmun. 23 (3), 257-266 (2004).
  27. Pazini, A. M., Fleck, J., dos Santos, R. S., Beck, S. T. Clinical relevance and frequency of cytoplasmic and nuclear dense fine speckled patterns observed in ANA-HEp-2. Rev Bras Reumatol. 50 (6), 655-660 (2010).
  28. Schmeling, H., et al. Autoantibodies to Dense Fine Speckles in Pediatric Diseases and Controls. J Rheumatol. 42 (12), 2419-2426 (2015).
  29. Wiik, A. S., Hoier-Madsen, M., Forslid, J., Charles, P., Meyrowitsch, J. Antinuclear antibodies: a contemporary nomenclature using HEp-2 cells. J Autoimmun. 35 (3), 276-290 (2010).
  30. Mahler, M., Fritzler, M. J. The Clinical Significance of the Dense Fine Speckled Immunofluorescence Pattern on HEp-2 Cells for the Diagnosis of Systemic Autoimmune Diseases. Clin Dev Immunol. 2012, 494356(2012).
  31. Mahler, M., et al. Anti-DFS70/LEDGF Antibodies Are More Prevalent in Healthy Individuals Compared to Patients with Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases. J Rheumatol. 39 (11), 2104-2110 (2012).
  32. Conrad, K., Rober, N., Andrade, L. E., Mahler, M. The Clinical Relevance of Anti-DFS70 Autoantibodies. Clin Rev Allergy Immunol. , (2016).
  33. Miyara, M., et al. Clinical Phenotypes of Patients with Anti-DFS70/LEDGF Antibodies in a Routine ANA Referral Cohort. Clin Dev Immunol. 2013, 703759(2013).
  34. Bizzaro, N., Tonutti, E., Villalta, D., et al. Recognizing the dense fine speckled/lens epithelium-derived growth factor/p75 pattern on HEP-2 cells: not an easy task! Comment on the article by Mariz et al. Arthritis Rheum. 63 (12), 4036-4037 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm nolojisay 131yo un iyi benekli 70lens epitel kaynakl b y me fakt renerjiye antikorlarinsan epitel h creleri 2dolayl ayirthomojenbenekli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır