JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

DFS70 аутоантител имитировать общие шаблоны связанных заболеваний антиядерное антитело, делая точной интерпретации сложных при использовании обычных подложек HEp-2. Протокол описывает преимущества новых инженерных субстрата HEp-2 над обычными HEp-2 в Ана скрининг и отличительные DFS70 структур с высокой степенью уверенности в моновидовые и смешанные Ана положительных случаях.

Аннотация

Системных аутоиммунных соединительной ткани расстройства характеризуются циркулирующих Антиядерный антитела (АНА). Хотя существует несколько технологий для скрининга Ана, непрямой иммунофлюоресценции (IIF) с использованием человеческих эпителиальных клеток-2 (HEp-2) субстрата остается основной и рекомендуемый метод из-за его превосходная чувствительность. HEp-2 субстраты можно обнаружить множество шаблонов, обусловленной аутоантител привязки различных белков и нуклеиновых кислот autoantigens, распределенных по всему ядра и цитоплазмы клеток. Большое разнообразие моновидовые и смешанных моделей результате позитивные реакций на подложке HEp-2 также усложнить толкование и точность отчетности. Один конкретный пример, который недавно получил пристальное внимание является плотной хорошую крапинами 70 (DFS70) шаблон результате аутоантител, конкретно привязанные к белок, называемый фактор роста производные эпителия объектива (LEDGF). Отсутствие четкой ассоциации с конкретных системных аутоиммунных заболеваний и высокая распространенность в здоровых популяциях добились точной интерпретации шаблона DFS70 важное значение. Точное различие DFS70 шаблона от болезни связанные шаблоны, с помощью обычных субстрат HEp-2 является сложной задачей. Кроме того частые совместного вхождения pattern DFS70 наряду с болезнь связанные модели, такие как однородной, пятнистым и смешанных моделей однородной рябой усложнить толкование IIF. Цель настоящего документа заключается в демонстрации полезности Роман инженерии HEp-2 IIF субстрат, который сохраняет все преимущества обычных субстрат HEp-2 одновременно обеспечивая способность различать DFS70 шаблон с высокой степенью уверенности в обоих моновидовые и смешанные Ана положительных примеров. Новый субстрат далее возможность разоблачать болезни связанные шаблоны Ана ранее скрытый DFS70 шаблон.

Введение

Нана являются отличительной чертой заболеваний аутоиммунных опосредованной системных соединительной ткани1. Несколько методов для проверки и подтверждения Нана. IIF техника с использованием HEp-2 субстрата остается наиболее широко используется и часто рекомендуемый метод для скрининга Анас1,2. Несмотря на успехи в твердой фазе диагностического анализа методологии как assay энзим связанный иммуносорбента (ELISA), иммуноферментного анализа (ОВОС), хемилюминесценция иммуноанализа (CLIA) и на основе бисера мультиплекс анализов IIF HEp-2 является наиболее распространенным скрининг метод, благодаря своей диагностики полезности и стоимости эффективности1,2,3. Вышеупомянутые пробирного технологии полагаются на ограниченный набор очищенный родной или рекомбинантным autoantigens в то время как препараты монослоя клеток Нер-2 на стекло слайд скважин присутствует обширный ассортимент autoantigens в их естественной форме, распределены по ядро и цитоплазму, которые реагируют с аутоантител от пациента сера или позитивные элементы, приводит множество шаблонов, которые связаны с различными аутоиммунными условий. Эти шаблоны подразделяются на ядерного, цитоплазмы и митотического моделей, основанных на месте антигена в клетках. Каждый шаблон и связанного антигена/антигены и болезни государства являются также характеризуется4. В методе IIF пациента и контроля сывороток инкубируют на стекло слайд скважин, которые представляют монослойном культивировании клеток Нер-2, должным образом исправлена для сохранения множества autoantigens в их естественной конфигурации. Аутоантител в пациента сера или позитивные элементы разрешены для привязки к autoantigens, представленной HEp-2 клетки на подложке (стеклянное скольжение хорошо) во время инкубации. После инкубации, несвязанные антитела смываются и связанного антитела класса IgG обнаруживаются с флуоресцеин/флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC) конъюгированных античеловеческие IgG реагента. Несвязанного конъюгата сообщили смыл и стекла coverslips монтируются на верхней слайдов, используя средство монтажа, который сохраняет реакции и облегчает наблюдение под микроскопом флуоресцентные. Реакции наблюдаются под микроскопом флуоресценции, оснащенных комбинацию фильтров возбуждения соответствующую-выбросов, настроенный как репортер используется (FITC репортером, диагностический Микроскоп обычно использует фильтры с спектр возбуждения 467 -498 Нм и выбросов диапазон 513-556 Нм). Присутствие Ана подтверждается ярко зеленая Флуоресценция конкретных структур в клетках. В отличие от платформ автоматизированного анализа IIF методология опирается на трудоемкий процесс последовательного разбавления sera и визуального положительную детерминацию окрашивания моделей, которая требует значительных пользователя опыт5,6. Несмотря на эти ограничения IIF HEp-2 остается наиболее широко используемым и рекомендованный метод скрининга Нана благодаря стандартизации усилия в направлении шаблон интерпретации и номенклатура международного консенсуса по Ана шаблонов (ICAP) Комитета, увеличение доступности решений по автоматизации для IIF слайд обработки и интерпретации результатов3.

Среди множества моделей определяется метод HEp-2 IIF, аутоантитела, ориентация продукта гена psip1 (также называется Р75/LEDGF/DFS70), получили значительный интерес в последние годы несколько причин4,5 ,6,,78,9,10. DFS70 аутоантител присутствуют в высокие титры в здоровых элементов управления, и исследования пока не смогли продемонстрировать собственный клинический ассоциации на наличие DFS70 аутоантител,7,8,,9 ,10,11,12,13. Тарифы сообщил положительные результаты для DFS70 аутоантител в различных положениях заболеванием и здорового когорт, различаются между исследования6,8,9,10,14 ,,1516,,1718,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Шаблон моновидовые DFS70 хорошо отличается от однородной или пятнистым узором но интерпретации смешанных однородной пестрые узоры и антител анти DFS70, происходящих совместно с другими Нана является сложной задачей даже для экспертов читателей. Нынешнее поколение IIF скрининг методы и DFS70 анализов конкретных твердой фазы не способны дифференциации моновидовые DFS70 реакции от смешанных моделей (рис. 1A, желтые затененные области алгоритма). Неправильного толкования DFS70 шаблон как однородные, крапчатый, смешанная модель, или, наоборот, могут иметь серьезные последствия для ухода за пациентами. Текущий часто используемый протокол является следующим: клинические лаборатории используют число твердой фазы подтверждающие тесты для связанных заболеваний Анас и/или метод immunoadsorption для DFS70/LEDGF при плотной штраф крапчатого (AC-2) шаблон подозревается (Рисунок 1a)4,5.

Цель настоящего Протокола заключается в демонстрации полезности Роман инженерии HEp-2 IIF субстрата (нокаут HEp-2 элита/DFS70 (KO), будут переданы как элита HEp-2), сохраняет все преимущества обычных HEp-2 для скрининга Анас при одновременном отличительные DFS70 шаблон с высокой степенью уверенности в моновидовые и смешанные Ана положительных случаев (рис. 1B, желтые затененные области алгоритма)5. Субстрат элиты HEp-2 состоит из приблизительное смеси неизмененном обычных клеток Нер-2 и инженерии клетки лишены Р75/LEDGF/DFS70 антигена в соотношении 1:95. IIF процедура HEp-2 элиты идентичен методу обычных HEp-2. Уникальную конфигурацию HEp-2 элиты субстрата не только сохраняет все преимущества обычных HEp2, но можно дифференцировать шаблоны однородной, пятнистым и смешанные реакции от DFS70 шаблон в первоначальной проверки или тестирования образца (Рисунок 1B )5. Пациента сывороток для отреагировали на слайдах с Нер-2 IIF субстрат должен быть разбавленных 1:40 с отбора разрежения или в соответствии с критерием отдельные лаборатории. Специфическая реакция на 1:40 или выше титр считаются положительными.

В этом исследовании, позитивные сывороток для однородной, крапчатый, центромер, ядрышковые, цитоплазматических ретикулярной/АМА и DFS70 моделей, которые произведены средних позитивный сигнал (относительно отрицательного контроля и положительный контроль Ана, предоставляемый комплект) на скрининг для имитации моно конкретных и смешанные шаблоны на подложках HEp-2 были отобраны разбавления 1:40 (обычных и элита HEp-2). 1:40, которую разбавленных DFS70 положительные sera были смешаны с 1:40 разведений отдельных связанных заболеваний Ана модель управления (однородной, крапчатый, центромер, ядрышковые, или цитоплазматическая ретикулярной AMA) в различных соотношениях (управления: DFS70 в бесступенчатое, 80: 20, 50: 50, вдохновившей и 0: 100) и оценены на обычных и HEp-2 элиты субстраты после стандартной процедурой IIF, изложенные ниже.

протокол

Протокол следует руководящие принципы Комитета по этике институциональных исследований человеческого Троицы Biotech.

1. образец и подготовка субстрата

  1. Позволяют чехлы, содержащие подложки слайды (стекло слайды с 12 скважин на каждом слайде, содержащие HEp2 или HEp-2 + HEp2 KO ячейку смесь) сбалансировать до комнатной температуры для обеспечения оптимальной производительности и предотвращения конденсации влаги на поверхности слайда до Добавление образца. Это должно занять около между 10-15 мин.
  2. После того, как достижение равновесного уровня до комнатной температуры, тщательно удалите субстрат слайды с помощью пальцев без них трогательные стороны мешок.
  3. Ярлык слайды и поместите их в камеру инкубации (при комнатной температуре) выстроились с салфетки, смоченной водой для предотвращения высыхания слайдов во время выборки и сопряжённых инкубации.
    Примечание: Неспецифичный пятнать может быть результатом сухого скважин; влажной салфеткой внутри камеры инкубации обеспечивает влажности и предотвращает сухость хорошо.

2. Добавление элементов управления и образцы

  1. Отказаться от примерно 50 мкл негативных/позитивных элементов, комбинации положительных sera DFS70-Ана, как описано в этом исследовании, или образцов сыворотки больного на отдельных слайдов скважин.
  2. Отказаться от элементов управления и образцы в каждой скважине на слайде.
  3. Чтобы предотвратить хорошо перекрестного загрязнения, Избегайте переполнения скважин. Хотя не переполнять скважин, обеспечить полный охват хорошо поверхности и избежать воздушных пузырей.
    Примечание: Рекомендуемый объем-50 мкл согласно шагу 2.1.
  4. Установите крышку на камере инкубации и инкубировать слайды для 30 мин при комнатной температуре. Если есть любые Ана в сыворотке крови пациента, он будет привязан к клетки присутствуют в каждой скважине в течение этого периода инкубации.
  5. После инкубационного периода, удалите слайд из камеры для инкубации. Держите слайд в конце вкладки и осторожно промыть примерно 10 мл фосфат амортизированное физиологический (PBS) мыть буфер, предоставленный в комплект, с помощью пипетки или в стакан, наполненный PBS для s. 10-15 передачи слайд сразу в опарник Coplin с PBS буфер мыть и мыть ( Замочите) 10 минут повторите процесс с все остальные слайды.
    Примечание: При размещении нескольких слайдов в опарник Coplin, убедитесь, что клетки стороне слайда не связаться с другой слайд, как это приведет к повреждение клеток придерживались на стеклянное скольжение.

3. Добавление флуоресцентные конъюгата

  1. Удалите только один слайд в то время из опарник Coplin. Чтобы удалить избыток PBS мыть буфера слайд, аккуратно коснитесь или пятно слайд на бумажное полотенце. Каждый комплект предоставляется с FITC помечены флуоресцентные конъюгат анти человека IgG. На каждой скважине осторожно примените 1 капля (примерно 50 мкл) предоставленных конъюгата.
  2. Инкубируйте слайды в закрытой камере окрашивание инкубации за 30 мин.
    Примечание: Рекомендуется использовать ФК конкретных IgG конъюгата. Если есть любые Ана в сыворотке крови пациента, сопряженное будет привязан к клетки присутствуют в каждой скважине в этот период инкубации, которая приводит к конкретным флуоресценции клетки присутствуют в скважинах. Сопряженное чувствителен к свету. Закрытые инкубации палата поможет предотвратить световых помех с сопряженной реакции клетки присутствуют в каждой скважине.
  3. После инкубационного периода, удалите слайд из камеры для инкубации. Держите слайд в конце вкладки и осторожно промыть примерно 10 мл PBS мыть буфер, предоставленный в комплект, с помощью пипетки или в стакан, наполненный PBS. Передача слайд сразу в Coplin банку с PBS буфер мыть и мыть (замочить) за 10 минут повторите процесс с все остальные слайды.
    Примечание: При размещении нескольких слайдов в опарник Coplin, убедитесь, что клетки стороне слайда не связаться с другой слайд, как это приведет к повреждение клеток придерживались на стеклянное скольжение.
  4. Место coverslips, которые предоставляются в комплекте на сухой салфеткой. Монтаж средств массовой информации предоставляется комплект. К нижнему краю coverslip применяются между 3-4 капли монтаж средств массовой информации в линии.
  5. Возьмите один слайд в то время из Coplin jar, содержащий буфер мыть. Чтобы удалить избыток мыть буфера, аккуратно коснитесь или пятно слайд на бумажное полотенце.
  6. Ниже слайд аккуратно на coverslip, поместив в нижней части слайда к краю coverslip. Это позволяет монтаж носителя на нижнем краю coverslip поступать к верхнему краю слайда и минимизирует образование пузырьков воздуха, которые могут мешать чтению каждой скважины слайд.
    Примечание: Минимальное давление должно использоваться для монтирования слайд крышка на слайд. Любое избыточное давление может вызвать боковое движение скользит крышка. Это может привести к повреждению подготовку монослоя клеток и результат в искажение.
  7. Хранить слайды в темноте при температуре 2-8 ° C. Просмотрите слайды, как только они монтируются или в течение 48 ч.
    Примечание: Более длительного хранения может привести к ухудшению шаблон и флуоресцентного сигнала.

4. выявление положительных и отрицательных результатов

  1. Просмотрите слайды с флуоресцентный микроскоп с использованием набора FITC фильтр, расположенный в темной комнате.
  2. Изучения для конкретных яркий зеленый флуоресценции под микроскопом флуоресцирования на увеличение 200 X или больше, чтобы сделать окончательные толкования в отношении позитивность и узор. Наблюдать за положительной и отрицательной контроля.
    Примечание: Положительный контроль будет отображаться ярко зеленая Флуоресценция в ядре (рисунок 2A, гомогенный). Отрицательный контроль будет отображать без конкретных зеленый флуоресценции под флуоресцентным микроскопом.
  3. Запись положительный/отрицательный результат для каждой скважины и включают в себя Ана шаблон для положительных случаев.

Результаты

HEp-2 элита/DFS70 KO субстрат сохраняет классический Ана шаблоны и облегчает четкое различие DFS70 шаблона:

Обычных и инженерии клетки на Нер-2 элита/DFS70 KO подложке идентичны, сохраняя все autoantigens Кроме LEDGF/Р75. Отрицательный контроль, предоставляемые комплект устанавливает базовые флуоресцентного сигнала. Позитивные элементы управления для модели ядрышковые и митохондриальной однородной, крапчатый, центромер, на Нер-2 элиты производят шаблон идентичен ожидаемых моделей на обычных субстрат IIF HEp-2 (рисунок 2A). Эти ссылки модели были описаны в деталях наряду с каждого шаблона антигена и болезней ассоциации ранее4,29. Краткое описание модели отмечено на рисунке 2A приведены в таблице 1.

DFS70 узор на Нер-2 элиты:

Примерно 10% ячеек в каждой хорошо показан шаблон плотной тонкой крапчатого (ICAP, назначена номенклатура: AC-2) который можно наблюдать на межфазной ядро, и пятнать хроматина связанные видели на митотическая ядер (Рисунок 2Б). На обычных субстрат HEp-2 все клетки будут иметь этот шаблон когда прореагировало с DFS70 положительный пример. Оставшиеся ~ 90% клеток Нер-2 имеют ген psip1 кодирования LEDGF антигена, выбил и поэтому не будет производить сигнала или модели когда реагируют с моновидовые DFS70 положительные сыворотки (рис. 2B). Если 10% клеток Нер-2 ярче флуоресценции соответствующего шаблона DFS70 и остальной части клетки нынешних дополнительных моделей (например, штраф крапинами или ядрышковые), то это указывает на присутствие смешанных моделей. При более внимательном изучении таких шаблонов имеет важное значение для подтверждения всех особенностей аутоантител, которые присутствуют в дополнение к DFS70 шаблон. Чтобы продемонстрировать возможности HEp-2 элиты субстрата, Группа сера образцов был создан с различных концентраций DFS70 и Ана позитивных контроля сывороток и испытаны на обоих обычных и HEp-2 элиты субстратов с помощью стандартной функции IIF протокол (рис. 3 , Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, рис. 7).

Интерпретация DFS70 моновидовые и неоднозначную реакцию на обычных и HEp-2 ЭЛИТНЫХ субстратов:

Для каждого конкретного заболевания связанные Ана шаблона (Рисунок 3 Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, рис. 7), моновидовые Ана образец слева столбца и моновидовые DFS70 узор на право большинства столбцов может наблюдаться. Три колонки в середине представляют различные показатели заболевания, связанного и DFS70 шаблон позитивные элементы управления. Результате смешанной модели являются сложными различить на обычных субстрат HEp-2 (рис. 3, рис. 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, верхняя строка). Однако с Роман Hep-2 элиты субстрата, в большинстве образцов, разница в интенсивности между неизмененным и инженерии клетки отличается который не только подтверждает наличие аутоантител DFS70 (когда соотношение ярче меньше светлые клетки 1:9), но также показывает шаблон вторичного Ана. В случае однородной DFS70 или пятнистые DFS70 неоднозначную реакцию невозможно с уверенностью предсказать правильный шаблон, который приводит к лабораториям, выбирают для запуска ряда дополнительных анализов (рис. 1A). В случае центромер DFS70 и ядрышковые DFS70 неоднозначную реакцию, подозревая, что DFS70 позитивность является весьма сложной задачей (Рисунок 5, Рисунок 6). Ядрышковые и цитоплазматических ретикулярной/Ама реакций DFS70 шаблон не является доминирующим, до тех пор, пока сера коэффициент достигает 50%. Во всех примерах HEp-2 элиты субстрата может представить структуру DFS70 и базового среднего шаблон над более широкий спектр интенсивности уровнях и таким образом способствует более точной интерпретации Ана.

Тщательно соблюдать смешанной модели, результаты для различных комбинаций 50: 50 Ана и DFS70 положительные элементы были расширенного (рис. 8) для обоих обычных и HEp-2 элиты субстратов. Рекомендуется соблюдать межфазные и митотическая пятная для всех шаблонов Ана, включая DFS70 на Нер-2 субстратов для улучшения интерпретации и точности сообщаемых шаблона. Однако для смешанных моделей, дифференциальной шаблон, представленный деления ядер клеток может быть не достаточно для облегчения точной интерпретации. Красные стрелки (рис. 8) указывают митотическая ядер в ячейке как обычных, так и инженерии. Можно отметить, что, смешанные DFS70 реакции на делящиеся клетки не соответствуют с установленным набором правил для интерпретации связанных заболеваний Ана шаблонов. Желтые и синие стрелки указывают неизмененным и инженерных клеточных ядер (DFS70 KO) HEp-2, соответственно. Во всех комбинациях (рис. 8), наблюдается ясно интенсивности разница между неизмененных клеток ядерной окрашивание (~ 10%) и инженерии клетки ядерной шаблон (~ 90%) в поле зрения же микроскопических, что позволяет одновременный скрининг и подтверждение о структуре DFS70.

figure-results-6073
Рисунок 1: Ана, скрининг алгоритмы с использованием обычных методов Нер-2 и IIF KO элита/DFS70 Нер-2. (A) схема распутывает дефицит обычных HEp-2 IIF в определении моновидовые и смешанные DFS70 позитивные модели на стадии отбора (желтые затененные области) и его неспособность исключает средней болезни связанные Ана узор, который может скрыть DFS70 шаблон. Кроме того, нынешнее поколение DFS70 конкретные твердой фазы, подтверждающего анализов не способны подтвердить моновидовые DFS70 положительности, что приводит к дополнительных подтверждающих тестирования для Нана. (B) схемы раскрывает возможности HEp-2 элиты для скрининга Нана, одновременное различия моновидовые и смешанные DFS70 реакций, и устраняя необходимость твердой фазы DFS70 assays подтверждения. Алгоритм, с помощью ELITE HEp-2 значительно упрощает Ана скрининг и уменьшает необходимое количество анализов подтверждения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-7325
Рисунок 2: классический Ана и DFS70 узор на Нер-2 элита/DFS70 KO субстрата. (A) HEp-2 элита/DFS70 KO субстрата сохраняет Классические узоры Ана. Классический Мономорфный тип реакции и позитивные реакций DFS70 были произведены используя позитивные элементы управления, предоставляемые в комплект. Другие реакции были произведены с использованием ранее установленных положительный контроль сывороток для крапчатый, центромер, ядрышковые и цитоплазматических ретикулярной/Ама реакции5. (B) HEp-2 элита/DFS70 KO субстрата обеспечивает как обычных, так и инженерии клетки, которая облегчает легко разграничения шаблона DFS70. Схема показывает результате реакции моновидовые DFS70 окрашивание узор на межфазной и деления ядер клеток для обычных и инженерии клетки (DFS70-KO). Инженерии HEp-2 клетки лишены Р75/LEDGF/DFS70 антиген, который дает возможность одновременного обнаружения вторичных структур, которые обычно скрыты, DFS70 аутоантител реакции на обычных основаниях HEp-2. Стрелки (желтый) показывают примеры митотическая клеточных ядер. Масштаб бары представляют 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-8785
Рисунок 3: DFS70 и однородной Сера в комбинации. DFS70 моновидовые sera были объединены с позитивным однородной шаблон управления в различных соотношениях (бесступенчатое, 80: 20, 50: 50, вдохновившей и 0: 100) и протестированы на обычных и инженерии HEp-2 (DFS70-KO) подложках. Масштаб бары представляют 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-9426
Рисунок 4: DFS70 и рябой Сера в комбинации. DFS70 моновидовые sera были объединены с позитивным крапинами шаблон управления в различных соотношениях (бесступенчатое, 80: 20, 50: 50, вдохновившей и 0: 100) и протестированы на обычных и инженерии HEp-2 (DFS70-KO) подложках. Масштаб бары представляют 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-10061
Рисунок 5: DFS70 и центромер Сера в комбинации. DFS 70 моновидовые sera были объединены с позитивным центромер шаблон управления в различных соотношениях (бесступенчатое, 80: 20, 50: 50, вдохновившей и 0: 100) и протестированы на обычных и инженерии HEp-2 (DFS70-KO) подложках. Масштаб бары представляют 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-10701
Рисунок 6: DFS70 и ядрышковые Сера в комбинации. DFS 70 моновидовые sera были объединены с позитивным ядрышковые шаблон управления в различных соотношениях (бесступенчатое, 80: 20, 50: 50, вдохновившей и 0: 100) и протестированы на обычных и инженерии HEp-2 (DFS70-KO) подложках. Масштаб бары представляют 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-11343
Рисунок 7: DFS70 и цитоплазматических ретикулярной/Ама Сера в комбинации. DFS70 моновидовые sera были объединены с позитивным митохондриальной шаблон управления в различных соотношениях (бесступенчатое, 80: 20, 50: 50, вдохновившей и 0: 100) и протестированы на обычных и инженерии HEp-2 (DFS70-KO) подложках. Масштаб бары представляют 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-12015
Рисунок 8: смешанные шаблоны (соотношении) производится на обычных и субстраты элиты HEp-2. Выявлены различия между двумя субстратов. Красные стрелки показывают митотическая ядер в обычных и инженерии клетки на обоих субстратов. Для этих комбинаций дифференциальной шаблон, представленный деления ядер клеток на обычных субстрат HEp-2 не является достаточным для точной интерпретации смешанных моделей. Можно наблюдать, что смешанные DFS70 реакции на делящиеся клетки можно возмущают установленных правил для интерпретации связанных заболеваний Ана шаблонов. Желтые и синие стрелки указывают неизмененным и инженерных клеточных ядер (DFS70 KO) HEp-2, соответственно. Результаты, полученные для всех комбинаций протестирован на инженерных субстрат: ясно интенсивности различие между ядерной шаблон интерфаза, принадлежащих к неизмененной клетки (~ 10%) и инженерии клетки (~ 90%) было отмечено, что позволило одновременно выявление и подтверждение DFS70 шаблона. Масштаб бары представляют 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Ана шаблонОписание
ОднородныеЯдром всей флуоресцирует равномерно с шаблоном диффузных окрашивание.
РябойДискретный, грубый для тонкой зернистости из флуоресцировать всей ядра.  Были описаны тонкой пятнистым и грубый пестрые узоры.
ЯдрышковыеЯдрышек пятно как несколько твердых или пятнистым тела в ядре. Ранее были описаны подтипы.
ЦентромерБольшие крапинками конечного числа. Реактивная антигена сегрегирует с конденсированных хромосом в клетках, проходят митоз.
Цитоплазматическая ретикулярной/АмаЦитоплазме появляется гранулированный с положительный пятнать митохондрий.
DFS70•Классический Нер-2 клетки: шаблон плотной тонкой крапинами наблюдается на межфазной ядро и связанные хроматина пятнать видели на митотическая ядер.
•Engineered ко DFS70 клетки: антитела анти-DFS70 производят отрицательные пятнать
Элита HEp-2 / DFS70 KO имеет обычные и инженерии (DFS70 KO) клетки в соотношении примерно 1:9. Обычные клетки производят типичный шаблон DFS70 и инженерии клетки вырабатывают отрицательные шаблон когда прореагировало с моновидовые/изолированные позитивные реакций DFS70.

Таблица 1: Описание шаблонов Ана.

Обсуждение

Аутоантител к антигенам ядерные и цитоплазматические очень распространены в системных аутоиммунных заболеваний. Хотя без один пробирного обеспечивает лучшие возможности чувствительность и специфичность, IIF HEp-2 широко рассматривается как весьма деликатного и экономически эффективных скрининг метод для системных аутоиммунных заболеваний2,3,4 . Несмотря на распространенность IIF протокола для более чем 50 лет точность IIF пробирного сильно зависит от мастерства техник, тщательное выполнение индивидуального действия протокола, и точной интерпретации результатов с помощью хорошо ухоженный флуоресцентным микроскопом. Диагностика системных аутоиммунных заболеваний следует не основываться на результатах одного Серологический тест, например IIF HEp-2.

Воссоздание реагентов, используя высокое качество воды (дистиллированная/деионизированная), использование стандартизированных комплект компонентов (слайды с монослои клеток Нер-2, образец разбавителя, положительной и отрицательной контроля, предварительно разбавленного оптимизированный FITC-конъюгата и монтажа средних) имеют положительное влияние на результаты. Пропуск добавления элементов управления или образцы на скважинах может стимулировать ложных негативных толкований. Сушка слайды в любой момент после добавления образца или элемент управления может привести к артефакты ложных положительных реакций и/или ненадлежащее шаблонов. Слишком много мыть буфера остается на слайде или сушки слайд скважин до отправления монтажа средних может привести к артефактам. Добавление недостаточное количество монтажа средних или генерации пузыри на поверхности скольжения до размещения coverslip может привести к реакции, которые выглядят размытыми или не в фокусе, когда наблюдается под микроскопом. Навесные слайды должны храниться при температуре 2-8 ° C и проанализированы в окне рекомендованные времени для сведения к минимуму ложные отрицательные или артефакты результаты.

С помощью ухоженные epi флуоресцентный Микроскоп, который дома соответствующего источника света LED/Hg/Ксенон и чистку оптических компонентов, включая фильтры возбуждения и выбросов, которые не повреждены имеет решающее значение для получения точных результатов IIF. Конечного пользователя обучение для требовательных положительная/отрицательная реакция интенсивности и интерпретации моделей имеет решающее значение. HEp-2 IIF анализов уязвимы для отсутствие стандартизации процедур, Микроскоп конфигурации и обучение конечных пользователей или навык. Консенсуса номенклатура и представитель шаблоны и примеры изображения, полученные с использованием различных производителей доступны ICAP (< www.ANApatterns.org>) для образовательных целей4. HEp-2 ячейки шаблона классификации дерево предоставляемых ICAP для различных моделей ядерного, цитоплазмы и митотического является ценным ресурсом для изучения тонкие различия между различными шаблонами, которые могут выглядеть для неопытного глаза4. Одним из основных примеров сложный узор является DFS70, который также отсутствует собственный ассоциации с аутоиммунным заболеванием, и как описано в предыдущих разделах этот шаблон является очень распространены в здорового населения5.

Исследования распространенность анти DFS70 аутоантител зависимости между здоровым когорт, Ана скрининга населения и Ана позитивные лица при отсутствии доказательств системное аутоиммунное заболевание9,16,20 ,30,31. DFS70 аутоантител, как сообщается, происходят в изоляции, а также с другими шаблонами Ана связанных заболеваний. Изолированные или шаблон моновидовые DFS70 сообщается в 2-22% здоровых элементов управления, но в менее чем 1% случаев с аутоиммунные ревматические болезни32. Основываясь на эти тенденции, DFS70 моно позитивных шаблон был предложен в качестве критерия исключить в аутоиммунные ревматические заболевания ICAP Комитета3,,3132. ICAP Комитет, учрежденный для содействия гармонизации аутоантител тест номенклатуры и интерпретации результатов HEp-2 IIF, рекомендует отчетности DFS70 позитивность сообщая Ана скрининг результаты4.

До постановления из системных аутоиммунных заболеваний, основанные на DFS70 моно позитивность, жизненно важно для обзора состояния методов для проверки и подтверждения текущего (особенно те специфические для DFS70). Соглашение между DFS70 позитивность IIF Нер-2 и твердой фазы подтверждающего анализа именно ELISA, CLIA и линия иммуноанализа/точка помарки методы) варьируются между различными исследования13,22,25,33 . IIF интерпретации и подтверждающего анализа параметров, влияющих на этом разногласия были ранее обсуждены5,13,34. Immunoadsorption недавно предложенный подход для подтверждения антител анти DFS70 адресует некоторые из недостатков текущего твердой фазы анализов (для DFS70), но требует labs чтобы выполнить дополнительный шаг в процедуре IIF на подозреваемых образцы, которые увеличивает время стоимость и поворот для отчетности результаты13. Этот дополнительный шаг не требуется, когда HEp-2 элита/DFS70 KO клетки используются для экранирования рутины Ана. Это уменьшает общую стоимость и Кроме того существует не оказывает влияния на сроки как DFS70 шаблон различил в первоначальных скрининг шаг27. Дополнительный недостаток использования обычного метода HEp-2 IIF является, что он не может отличить DFS70 шаблон совместно происходящих с другими Ана узоры на стадии отбора. Однако этот недостаток преодолевается с помощью HEp-2 элита/DFS70 KO клетки27.

Сравнительная оценка обычных Нер-2 и новых инженерных HEp-2 (HEp-2 элита/DFS70 KO) с использованием Ана позитивные элементы и их комбинации с элементом управления DFS70 моно позитивных, продемонстрировать полезность новый субстрат способность одновременно экран для Нана и подтвердите DFS70 шаблон (рис. 1). IIF протокол для новый субстрат идентичен методу обычных HEp-2 IIF. Интерпретация схемы для всех болезней связанных шаблонов Ана идентичны за исключением шаблоне DFS70 (Таблица 1). Интерпретация как моно позитивных, так и смешанные DFS70 моделей был сравнительно легче, используя новый метод, и он не требуют дополнительных анализов (рис. 1B). Осуществление этого нового метода в клинической лаборатории упрощает вызов, связанный с толкованием DFS70 шаблон и улучшает общую точность Ана, скрининг, дальнейшее выявление болезни связанные Ана моделей, ранее скрытый DFS70 (смешанные шаблоны).

Раскрытие информации

Авторы Kishore Malyavantham и Lakshmanan Суреш являются сотрудниками Троицы Biotech, США.

Благодарности

Мы благодарим Эндрю Zenger за выполнение IIF экспериментов и сбора изображений.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 Well Slide sealed individually in pouchTrinity Biotechpart of kit# 1108, 1108-120, 1108-240
ANA positive controlTrinity Biotech part of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
DFS70 antibody positive controlTrinity Biotechpart of kit# 1108, 1108-120, 1108-240
Negative controlTrinity Biotechpart of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Anti-human IgG FITC conjugate containing Evan's blue counterstainTrinity Biotechpart of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Buffer diluent for serumTrinity Biotechpart of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Phosphate buffered saline (PBS)Trinity Biotechpart of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Mounting mediumTrinity Biotechpart of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
Coverslips Trinity Biotechpart of kit# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240
ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 well slide sealed individually in pouchTrinity Biotechpart of kit# 1103, 1103-240
NameCompanyCatalog NumberComments
Materials used in the study but not provided by the kits
Diagnostic fluorescent microscopeNikon Eclipse 50iEquipped with a spot dignostic camera, model 2.2.1
Incubation chamberTrinity Biotechprovided for customers (no catalog #)
Coplin jarn/aGeneral labware
Paper towelsn/aGeneral lab supplies
distilled/deionized watern/aGeneral lab supplies

Ссылки

  1. . Position Statement. Methodology of testing for antinuclear antibodies Available from: https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf (2011)
  2. Meroni, P. L., Schur, P. H. ANA screening: an old test with new recommendations. Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).
  3. Agmon-Levin, N., et al. International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies. Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).
  4. Chan, E. K., et al. Report of the First International Consensus on Standardized Nomenclature of Antinuclear Antibody HEp-2 Cell Patterns 2014-2015. Front Immunol. 6, 412 (2015).
  5. Malyavantham, K., Suresh, L. Analysis of DFS70 pattern and impact on ANA screening using a novel HEp-2 ELITE/DFS70 knockout substrate. Auto Immun Highlights. 8 (1), 3 (2017).
  6. Sperotto, F., Seguso, M., Gallo, N., Plebani, M., Zulian, F. Anti-DFS70 antibodies in healthy schoolchildren: A follow-up analysis. Autoimmun Rev. , (2017).
  7. Ayaki, M., et al. Detection of cytotoxic anti-LEDGF autoantibodies in atopic dermatitis. Autoimmunity. 35 (5), 319-327 (2002).
  8. Ochs, R. L., et al. Autoantibodies to DFS 70 kd/transcription coactivator p75 in atopic dermatitis and other conditions. J Allergy Clin Immunol. 105 (6 Pt 1), 1211-1220 (2000).
  9. Watanabe, A., et al. Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers. Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).
  10. Yamada, K., et al. Humoral immune response directed against LEDGF in patients with VKH. Immunol Lett. 78 (3), 161-168 (2001).
  11. Seelig, C. A., Bauer, O., Seelig, H. P. Autoantibodies Against DFS70/LEDGF Exclusion Markers for Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases (SARD). Clin Lab. 62 (4), 499-517 (2016).
  12. Ochs, R. L., et al. The significance of autoantibodies to DFS70/LEDGFp75 in health and disease: integrating basic science with clinical understanding. Clin Exp Med. 16 (3), 273-293 (2016).
  13. Bizzaro, N., et al. Specific chemoluminescence and immunoasdorption tests for anti-DFS70 antibodies avoid false positive results by indirect immunofluorescence. Clin Chim Acta. 451 (Pt B), 271-277 (2015).
  14. Bizzaro, N., et al. Antibodies to the lens and cornea in anti-DFS70-positive subjects. Ann N Y Acad Sci. 1107, 174-183 (2007).
  15. Daniels, T., et al. Antinuclear autoantibodies in prostate cancer: immunity to LEDGF/p75, a survival protein highly expressed in prostate tumors and cleaved during apoptosis. Prostate. 62 (1), 14-26 (2005).
  16. Dellavance, A., et al. The clinical spectrum of antinuclear antibodies associated with the nuclear dense fine speckled immunofluorescence pattern. J Rheumatol. 32 (11), 2144-2149 (2005).
  17. Gundin, S., et al. Measurement of anti-DFS70 antibodies in patients with ANA-associated autoimmune rheumatic diseases suspicion is cost-effective. Auto Immun Highlights. 7 (1), 10 (2016).
  18. Kang, S. Y., Lee, W. I. Clinical significance of dense fine speckled pattern in anti-nuclear antibody test using indirect immunofluorescence method. Korean J Lab Med. 29 (2), 145-151 (2009).
  19. Lee, H., Kim, Y., Han, K., Oh, E. J. Application of anti-DFS70 antibody and specific autoantibody test algorithms to patients with the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells. Scand J Rheumatol. 45 (2), 122-128 (2016).
  20. Mariz, H. A., et al. Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody-positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases. Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).
  21. Marlet, J., et al. Thrombophilia Associated with Anti-DFS70 Autoantibodies. PLoS One. 10 (9), e0138671 (2015).
  22. Mercado, M. V., et al. Detection of autoantibodies to DSF70/LEDGFp75 in Mexican Hispanics using multiple complementary assay platforms. Auto Immun Highlights. 8 (1), 1 (2017).
  23. Muro, Y., Sugiura, K., Morita, Y., Tomita, Y. High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease. Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).
  24. Muro, Y., Sugiura, K., Nakashima, R., Mimori, T., Akiyama, M. Low prevalence of anti-DFS70/LEDGF antibodies in patients with dermatomyositis and other systemic autoimmune rheumatic diseases. J Rheumatol. 40 (1), 92-93 (2013).
  25. Mutlu, E., Eyigor, M., Mutlu, D., Gultekin, M. Confirmation of anti-DFS70 antibodies is needed in routine clinical samples with DFS staining pattern. Cent Eur J Immunol. 41 (1), 6-11 (2016).
  26. Okamoto, M., et al. Autoantibodies to DFS70/LEDGF are increased in alopecia areata patients. J Autoimmun. 23 (3), 257-266 (2004).
  27. Pazini, A. M., Fleck, J., dos Santos, R. S., Beck, S. T. Clinical relevance and frequency of cytoplasmic and nuclear dense fine speckled patterns observed in ANA-HEp-2. Rev Bras Reumatol. 50 (6), 655-660 (2010).
  28. Schmeling, H., et al. Autoantibodies to Dense Fine Speckles in Pediatric Diseases and Controls. J Rheumatol. 42 (12), 2419-2426 (2015).
  29. Wiik, A. S., Hoier-Madsen, M., Forslid, J., Charles, P., Meyrowitsch, J. Antinuclear antibodies: a contemporary nomenclature using HEp-2 cells. J Autoimmun. 35 (3), 276-290 (2010).
  30. Mahler, M., Fritzler, M. J. The Clinical Significance of the Dense Fine Speckled Immunofluorescence Pattern on HEp-2 Cells for the Diagnosis of Systemic Autoimmune Diseases. Clin Dev Immunol. 2012, 494356 (2012).
  31. Mahler, M., et al. Anti-DFS70/LEDGF Antibodies Are More Prevalent in Healthy Individuals Compared to Patients with Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases. J Rheumatol. 39 (11), 2104-2110 (2012).
  32. Conrad, K., Rober, N., Andrade, L. E., Mahler, M. The Clinical Relevance of Anti-DFS70 Autoantibodies. Clin Rev Allergy Immunol. , (2016).
  33. Miyara, M., et al. Clinical Phenotypes of Patients with Anti-DFS70/LEDGF Antibodies in a Routine ANA Referral Cohort. Clin Dev Immunol. 2013, 703759 (2013).
  34. Bizzaro, N., Tonutti, E., Villalta, D., et al. Recognizing the dense fine speckled/lens epithelium-derived growth factor/p75 pattern on HEP-2 cells: not an easy task! Comment on the article by Mariz et al. Arthritis Rheum. 63 (12), 4036-4037 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

131702

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены