Fare modelleri sağaltımı geliştirme alkolizm için içme: karanlık ve iki şişe seçiminde içme

Özet

Alkol kullanım bozukluğu (AUD) büyük bir ulusal sağlık sorunu ve daha etkili tedaviler gelişimi bu hasta nüfusun ihtiyaçlarını karşılamak için gerekli. Bu amaçla, aşağıdaki protokol kurşun Anti-alkol bileşikler preklinik etkinliğini değerlendirmek için iki basit kemirgen içme modelleri kullanır.

Özet

Alkol kullanım bozukluğu (AUD) ile önemli bir sorun daha fazla dünya çapında tanı ölçütlerine yaklaşık 76 milyon kişi. Mevcut tedaviler bile psikososyal ile birlikte yüksek tarafından belirgin olduğu gibi müdahale, nüks oranı büyük ölçüde etkisiz üç FDA onaylı ilaçlar için sınırlıdır. Bu nedenle, daha yeni tedaviler için arama bir önemli halk sağlığı hedefi temsil eder. Bu amaçla, aşağıdaki protokol kurşun Anti-alkol bileşikler preklinik etkinliğini değerlendirmek için iki basit kemirgen içme modeller kullanır: iki şişe seçim (TBC) ve karanlıkta (DID) içme. Eski fare ikinci fareler için gönüllü ikna ederken aşırıya kaçmadan gönüllü içecek alkol büyük miktarda içki taklit eden kısa bir süre içinde tüketmek sağlar. Bu paradigmalar her ikisi de basit ve yüksek üretilen iş doğası farmakolojik ajanların hızlı tarama için veya belirli gönüllü içme davranışı sergilemek fareler suşları tanımlamak için izin verir.

Giriş

Son 25 yıl önemli çaba alkol kullanım bozukluğu (AUD)¹tedavisi için ilaç geliştirme koymak olmuştur. Her ne kadar birçok gelişmeler yaptık, AUD hala önemli halk sağlığı sorunu 18 milyon Amerikalı etkileyen ve üzerinde 220 milyar dolar mal kalır her yıl^2,3. Şu anda orada sadece üç ilaçlar FDA onaylı, ampisilin, naltrekson ve acamprosate, tüm bunların klinik ve sınırlı başarı klinik ayarları psikososyal müdahale ile bir araya geldiğinde bile tutarsız sonuçlar vermiştir ^{4 , 5 , 6 , 7}.

Hataları geçerli AUD tedavisinin başlıca nedeni AUD⁸hànzú doğaya bağlıdır. Çevresel ve genetik faktörlerin AUD gelişimine katkıda iken kalıtsallığı başlangıçlı⁹riski için yaklaşık 50-%60 oluşturmaktadır. Depresyon tedavisi için benzer, bu yaygın olarak hastalarda AUD her hasta¹⁰ihtiyaçlarını karşılamak için tasarlanmış ilaçlar çeşitli gerekir kabul edilir.

Açıkça, zaten zorlu ve zaman tüketmek oluşum ilaç keşif aerodinamik³olsaydı, kolaylaştırılmış olacaktır daha etkili tedaviler için acil bir ihtiyaç vardır. Bu amaçla, aşağıdaki iletişim kuralı AUD¹¹nörobiyolojik temeli incelemek için yaygın olarak kullanılan iki kemirgen içme modellerin preklinik Uygulanabilirlik gösterir. Daha ayrıntılı olarak, burada tanıtılan Yöntem alkol azaltmayı aday bileşikler etkinliğini değerlendirebilir tüketimi "Orta" ve iki şişe seçim (TBC) kullanan ve karanlık (DID) paradigmalar içme "tıkınırcasına içme" senaryoları anılan sıraya göre. Her iki paradigmalar sayede fare sözlü olarak ve de olacak, etanol yutmayın ve bu nedenle yüksek yüz göstermek ve geçerlilik insan alkolizm¹¹bir model olarak inşa edimsel etanol öz yönetim, inceleyin.

TBC alkol, olarak da bilinen özgür seçim, içki içme, tercih veya sosyal içme, çözüm iki şişe ev kafeste sürekli olarak kullanılabilir. Bir şişe su, ve diğer etanol, mademki etanol konsantrasyonu çeşitli seyreltilmiş bir çözüm içerir (Örn., % 5-30 v/v)^11,12. Fareler her iki şişe için sürekli erişime sahip ve bu nedenle, ne kadar her şişeden içmeyi tercih edebilirsiniz.

Bu model etanol tercih oranı (tüketilen tüketilen etanol ÷ toplam hacim sıvı hacmi) yanı sıra her fare (g/kg), etanol tüketimi değerlendiriyor. Düzenli olarak içme düzeyleri farklı suşları farelerin veya belirli bir genetik manipülasyon sonra arasında karşılaştırmak için kullanılınır (Örn., gen nakavt veya nakavt) ve kan etanol konsantrasyonları (tarafım) insanlarda bulunan için benzer sonuçlar ne zaman ılımlılık^13,14' te içme.

DID yordamda, karanlık döngüsünün başladıktan sonra 3 h ev kafes şişe su bir şişe %20 (v/v) etanol çözüm için bir sınırlı erişim oturum içme ile değiştirilir. İçme oturumları 4 gün üst üste 4 günlük döngüsü, kalıcı 2 h gün 1-3 ve 4 h meydana gelir. Gün 1-3 gün 4 test önce bir alkol-habituation dönemi olarak hizmet vermektedir. Sonuç olarak, fareler güvenilir tarafım ulaşmak için yeterli etanol tüketecektir > 100 mg/dL ve sonuç olarak,^13,14,15içme alem olan insanlarda bulunan zehirlenme davranışsal etkileri sergilemek. Su erişimi her zaman dışında içme oturum mevcuttur.

Sınırlı erişim içme birçok varyasyon vardır. Örneğin, aralıklı erişim modeli, fareler iki şişe (bir içeren su ve diğer içeren %20 (v/v) etanol) sadece Pazartesi, Çarşamba ve Cuma hafta içi ve hafta sonları, sırasıyla¹⁶24 saat ve 48 h çekilme süresi ile alırsınız. Birkaç hafta sonra aralıklı erişim, fare yavaş yavaş olacak ve gönüllü olarak düzeyleri, sonunda tarafım DID modelde gözlenen için benzer ulaşmak içme yükselmek. DID, ancak, aşırı gibi içme davranışı değerlendirmek için en yaygın olarak kullanılan model gibi görünüyor. Aralıklı içme diğer modelleri mevcut, ancak gıda erişimi kısıtlama güvenmek veya onları daha az temsilcisi gönüllü insan alkol tüketimi¹⁶yapar gönüllü kendi kendine Yönetim odası indüklenen artışlar Buhar.

Protokol

Burada açıklanan tüm yordamları kurumsal hayvan bakım ve Güney Kaliforniya Üniversitesi Sağlık Bilimleri kampüs kullanımı komiteler tarafından onaylanmıştır.

1. deneysel kurulum ve montaj

1. Tüm aşağıdaki malzemeleri ve kimyasallar çalışma başlangıcından önce elde etmek: fare, kafes/metal kafes üstleri, yatak takımları, gıda, su, etanol, pipets, sipper başında, shrink sarma, yeni bıçak, ZIP bağları, teyp, Bunsen brülör, ölçek, Far.
2. C57BL/6J fareler elde etmek için ya bir ticari kaynağı veya şirket içi bir koloni, bu fareler göz önünde bulundurarak test zamana kadar ev sahipliği yaptığı grup olabilir.
   Not: Tedarik fareler toplam sayısı deneysel tasarım karmaşıklığına bağlıdır. Yaklaşık 12-15 fareler her grubu, pilot çalışmalar küçük grup başına 5-7 fare ile karşılamak için plan. Aşağıda gösterilen temsilcisi sonuçlarında biz tek doz (5 mg/kg) kullanarak neden-sonuç ilişkisi değerlendirmek için basit bir iki grup set-up ilaç (MOX) olarak kullanılmıştır.
3. Şişe¹⁸düzenlemek için aşağıdaki adımları izleyin.
   1. Bunsen burner kullanarak yeni bıçak ısı.
   2. Bu bıçak kullanarak, yaklaşık bir inç bir plastik 18 mL serolojik damlalıklı üst ve alt uçları kapalı kesti.
      1. Not daha küçük birim pipets (yani, 10 mL) aynı zamanda ölçüm kesinliğini artırmak için kullanılabilir.
   3. Damlalıklı ısı silah altında sıcak.
   4. "Alt" sonuna damlalıklı (diğer bir deyişle, en yakın 18 mL kesik çizgi açılış) rulman sipper tüp takın.
   5. Sipper tüp yerde ticari olarak kullanılabilen küçültme şal silah kullanarak shrink wrap ile kapatın.
   6. Diğer açılış silikon tıpa ile kapalı kap.

2. hayvan Habituation

1. En az 1 hafta önce deneme başlangıç tarihinden başlayarak, deneysel prosedürler (ortam sıcaklığı (21 ± 1 ° C) ve 12-h dahil yetiştirme koşulları alışmana böylece gerçekleştirilebilmesi için nerede Oda fareler transfer Açık/Koyu döngüsüyle, ışıklar kapalı 12 öğlen ters). Kurumsal yönergeleri izleyin ve hayvanlar bir konumdan bir sonrakine geçmeden önce uygun kanallar bildirmek emin olun.
   1. Fareler standart bir ışık/karanlık döngüsü transfer ediliyor ek habituation zaman 2 hafta izin verir.
2. Yeni yapılan şişeler ağzına kadar suyla doldurun. Kapağı güvenli bir şekilde ve herhangi bir hava kabarcıkları veya sızıntı emzik dan yoksun kapalı olmasına dikkat edin. Çözüm sızdırmaz kap yeniden güvenli. Herhangi bir hava kabarcıkları böylece hava tüpü kaçabilir şişesinde sadece dokunarak kaldırın.
3. Elimize tek yatak ve bir metal ızgara kafesi üst standart Polikarbonat/polysulfone kafeslerde her fare evi; Artık kullanılacak gibi Kafesin kapağını çıkarın.
   1. Gıda ve water bottle(s) ad libitumerişim sağlar.
   2. Her şişe kafesi dön etrafında yerde tutmak için her şişe Plastik ZIP kravat sarma tarafından güvenli. Kafesin içine çıkıntı değil emin olmak için ZIP kravat aşırı herhangi bir plastikten kırpın.
      Not: karanlık (DID) yordamda içme için yalnızca tek bir şişe su gereklidir. İki şişe seçim (TBC) paradigma habituation ancak, kafes set-up iki su şişesi eklemenizi gerektirir. Sağlanan metal ızgara hopper çözüm yalnızca tek bir şişe tutmak için tasarlanmış ise, yavaşça ayrı ikinci şişe TBC için karşılamak ek bir plaka için alan yaratmak için onun Bar kır.
4. En az 3 fare ücretsiz kontrol kafes kadar ayarla. Bu sadece doğal bir olay gibi kafesleri ve kafes raf kapalı yerleştirilir gerçekleşen olan buharlaşma ya da dökülme şişeler, neden herhangi bir sıvı kaybına izlemek için izin verir (bkz. Adım 2.6.3, 3.6.1 ve 4.6.1 denklemler için).
5. ' 4 / 1 haftalık tek konut calıştıkları gününden başlayarak, ölçmek ve oymalar en yüksek noktası kaydetmek için ters şişe yanında istimal su alımı yanı sıra bir ölçekte, (gram) kullanarak her fare günlük gıda ve vücut ağırlıkları kayıt Menisküs (mL içinde).
   1. Şişe ters bir pozisyonda ölçüm sırasında kalır çünkü o içbükey menisküs en düşük noktası okumak için standart bilimsel yöntem olmakla birlikte, menisküs en yüksek noktası kaydedin.
6. Aşağıdaki denklemleri kullanarak 2.5 parametrelerini değerlendirmek:
   1. Vücut ağırlığı değişikliği (g) ölçmek: ağırlığını geçerli gün (g) - önceki gün (g) ağırlığı.
   2. Gıda alımı (g) ölçmek: önceki gün (g) - ağırlığını geçerli gün (g) Gıda Gıda ağırlık.
   3. Su alımı (mL) ölçmek: [geçerli gün (mL) - önceki gün (mL) su su hacmi] - Ortalama su kaybı tüm denetim kafesleri (mL).
7. 2.5 arka arkaya, etanol getirilmesi hemen önce üç gündür bir taban çizgisi tespiti için izin vermek için 5-7, günlerinde adımları yineleyin. Üst üste kayıt toplanamaz, temel ölçü birimlerinin değerlendirme için izin vermek için calıştıkları süresini uzatmakta.
8. Bir kez su alımı ± % 10 değişkenliği için son 3 gün anlamına stabilize, etanol erişim TBC (sınırsız erişim) ya da DID (sınırlı erişim) ile başlar.
   Not: nadir durumlarda, bir veya iki ek gün konular bu istikrar ulaşmak için gerekli olabilir; ek süre ±10% değişkenlik son 3 gün ortalaması üzerinden görüntülenecek değerleri için gerekliyse, endişelenme.

3. 24 saatlik iki şişe seçim (TBC)

Not: Bir şematik resim 1' de hazır.

1. 500 mL ses seviyesinde bir %10 (v/v) etanol çözüm H₂O için 447.35 mL 52.65 mL 190 kanıtı tahıl etanol (% ~ 95 etanol) ekleyerek hazırlamak; iyice sallayın emin olun. Etanol hızla buharlaşır göz önüne alındığında, çözümü her 3-4 gün aralığı içinde yerini alır.
   Not: Diğer konsantrasyonları etanol de kullanılabilir, ancak yazarlar bu model için bir %10 konsantrasyon öneririz.
2. TBC, ilk gününde (günde 8 en erken) 1 / 2 su şişeleri, her kafes içinde boş ve taze hazırlanmış etanol çözüm ile ağzına kadar doldurun. Etanol ve su görsel olarak ayırt edici olmak zor olduğunu göz önüne alındığında, açıkça ilgili içerikleri ile şişe etiket. Sadece şişe teybe maskeleme ve bir marker ile veya etiketleme yazarak bir parça şişesinde doğrudan uygulanır.
3. Daha fazla su şişesi, gerektiği gibi ekleyin.
4. Tümü büyük harf güvenli bir şekilde kapalı olduğundan emin yapma kafesine geri ve herhangi bir hava kabarcıkları veya sızıntı emzik dan yoksun şişe yerleştirin. Çözüm sızdırmaz kap yeniden güvenli. Herhangi bir hava kabarcıkları böylece hava şişe kaçabilir şişesinde sadece dokunarak kaldırın.
5. Alternatif olarak her geçen gün şişe konumunu için şartına yer tercih ile ilgili doğru etkiler etkinlik içme (daha fazla bilgi için konuya bakın).
6. 2.5 ve devam eden olmuştur, 2.6, günlük ölçümler ek olarak okumak ve etanol alımı düzeyleri de kaydetmek başlar. % 10 etanol alımı ve tercih oranı aşağıdaki denklemleri kullanarak çözümleyin:
   1. % 10 ölçmek etanol alımı (mL): [geçerli gün (mL) - hacmi önceki gün (mL) etanol etanol hacmi)]-Ortalama tüm denetim kafesleri (mL) etanol kaybı.
   2. % 10 ölçmek etanol alımı (g/kg): [% 10 etanol alımı (mL) 0.07893 g/mL x] / vücut ağırlığı (kg).
   3. Tercihi % ölçmek: [% 10 etanol alımı (mL) / su (mL)] x 100.
7. En kısa zamanda etanol alımı istikrarlı hale geldi, bir tek denetim (tuzlu) mayi (IP) enjeksiyon (vücut ağırlığının 0,01 mL/g) sırasında günlük ölçüm rutin her fare için yönetmek. Bu şekilde, konular enjeksiyon için alışmış.
   1. İstikrar ± % 10 değişkenlik son 3 gün (aynı bölüm 2.8) ortalaması üzerinden olarak tanımlanır.
      Not: Etanol düzeyleri stabilize etmek için 1 hafta kadar sürebilir. Fare bir önceki deneyden yeniden kullanılmakta olan ve etanol önceki maruz oldu bu özellikle doğrudur. Sadece uyuşturucu çözülmeye kullanılan çözücü denetimidir.
8. Düşük değişkenlik etanol temeliyle fareler dozaj içine split yeniden kurulmuş, bir kez tüm grupları kabaca benzer böylece etanol alımı değerleri kullanarak grupları etanol alımı değerlerin ortalamasını.
   1. Bir grup (tuz almaya devam) denetimi diğer deneysel olarak atayın (0,01 mL/g vücut ağırlığının, incelenen ilacın ı.p. enjeksiyon). Günlük ilaç dozaj, ya bir akut veya çok günlük süre için başlar. Daha sonra Denetim sonrası uyuşturucu etkileri (isteğe bağlı) test etmek için yeniden kullanılmaya olabilir.
      Not: 24 saat uzun bir süre izlenir içme çünkü dozaj yönetim zaman karanlık döngüsü bağlı değildir.

4. karanlıkta (yaptım) İçme

Not: Şekil 3' te bir şematik hazırlanır.

1. Her gün zamanlanan etanol erişim (gün 1-4) su hacmi, gıda alımı ve vücut ağırlığı, ölçümleri kaydetmek ve ilaç dozaj gerçekleştirin. Bunu önceden belirlenen bir süre içinde İlaç dozları uygun olarak seçilir, böylece bileşiktir, ışık-siklet sırasında yapmak / veya içme süresi boyunca en fazla beyin konsantrasyonu yaklaşıyor.
   Not: 1-3 gün sadece kısa bir süre içinde bol düzeyde etanol içme fareler alışmana gerekiyordu unutmayın. Fareler BEC düzeyleri için insan 0,08 karşılaştırılabilir ulaşmak olmayan iken; "eğitim" Bugünlerde günde 4, biraz daha içki oturumu sırasında onlar aslında bu seviyeye içer misin emin olun.
   1. Bütün fareler gün 4 gün 1-3 ve denetim veya uyuşturucu denetimi (serum) ver. Bu DID yordamı uyuşturucu (2. hafta) ve sonrası ilaç (4 hafta) içme oturum öncesi ilaç (1. hafta) dahil etmek için 3 hafta span üzerinden gerçekleşir.
   2. Not: Bu ilaç dozaj hafta içi, gün 3 etanol alımı düzeyleri fareler ya da her iki grup etanol alımı düzeyde en az değişkenlik olduğu bir şekilde denetim veya ilaç grubu atamak için kullanılır. Bu 3 günlük ortalama olarak göre gruplara atar TBC benzemez.
2. %20 (v/v) etanol çözeltisi (20E) 500 mL ses seviyesinde H₂O için 394.75 mL 105.25 mL 190 kanıtı tahıl etanol (% ~ 95 etanol) ekleyerek hazırlamak; iyice sallayın emin olun.
3. DID başlar başlamaz su şişeleri sadece alkol şişeleri ile değiştirilebilir içme oturum başlangıcından önce etanol şişeleri doldurun.
4. Tüm DID oturumunda (adım 4.5-4.8), hayvanların rahatsız etme gibi bir kırmızı ışık far kullanın.
5. Oturum 3 saat karanlık çevrimi başlaması planlanan, içme DID başında her fare için su hacmi kaydedin. Sonra her su şişesi 20E çözüm bir şişe ile değiştirin ve başlangıç etanol ses kaydı.
6. Okuyun ve son etanol Cilt 2 saat sonra 1-3 gün içme oturum ve daha sonra gün 4'te 4 saat sonunda kaydetmek. Aşağıdaki denklemleri kullanarak % 20 etanol alımı analiz.
   1. % 20 ölçmek etanol alımı (mL): [etanol oturum (mL) - etanol oturum (mL) içme başında hacmi içme sonunda hacmi] - Ortalama etanol kaybı tüm denetim kafesleri (mL).
   2. % 20 ölçmek etanol alımı (g/kg): [% 20 etanol alımı (mL) 0.15786 g/mL x] / vücut ağırlığı (kg).
7. Su ile günde hemen sonra etanol birimleri kayıt ve erişim yeniden tanıtımı önce 4 yalnızca, her fare (isteğe bağlı) kan etanol konsantrasyonu değerlendirmek için kan toplamak.
   Not: Herhangi bir terminal kan toplama yöntemi, retro-orbital sinüs kan toplama veya safen ven kan toplama gibi kullanılabilir. Yararlı protokollerde Parasuraman ve ark. için bkz: ²¹ ve Yardley vd. ²⁰.
   1. LCMS veya piyasada bulunan makineleri de dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle analiz ( Tablo malzemelerigörmek).
8. Tüm etanol şişe su şişeleri ve kayıt su hacmi ile değiştirin.

Sonuçlar

Aşağıdaki temsilcisi araştırmalarda sosyal içme iki şişe seçim (TBC) paradigması kullanarak örnek alınarak tasarlanmıştır. Kısaca, fareler ve bunlardan biri su ve diğer bir % 10 (v/v) etanol çözüm bulunan çözüm, iki şişe erişimi vardı. Konular daha sonra bölünmüş ve her grup varyasyon az miktarda etanol alımı düzeyleriyle ortalama böylece eşit olarak uyuşturucu tedavi grupları, moxidectin (MOX) serum fizyolojik kontrol, vs atanan.

Tartışmalar

Dünya çapında tahminler kadar 76 milyon kişi bir tanı için alkol kullanım bozukluğu (AUD) emri için ölçütlere uyan gösterir. Ne yazık ki, ilaç tedavisi mevcut büyük ölçüde etkisiz ve daha da geliştirilmesi bu klinik nüfus²⁰ihtiyaçlarını dengelemek gereklidir. Bu amaçla, aşağıdaki protokol iki paradigmalar içme en temel kemirgen örnekli tarafından bu çaba kolaylaştırmak amaçlamaktadır: iki şişe Seçmeli (TBC) ve karanlıkta (DID) içme. Her iki model de edimse...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L  graduated cylinder	VWR	https://us.vwr.com/store/product/20935285/marisco-single-scale-cylinder-graduates-john-m-maris-co	To prepare ethanol solution.
1 L glass bottle	Pyrex (Fisher Scientific)	https://www.fishersci.com/shop/products/pyrex-reusable-media-storage-bottles-12/p-42752	To prepare ethanol solution.
100 mL graduated cylinder	Fisher Scientific	https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kimax-class-a-to-contain-graduated-cylinders-8/p-4369311	To prepare ethanol solution.
Analox			One potential method of analyzing DID blood samples is by using the analox machine
ball-bearing sipper tubes	Ancare Corp.	http://www.ancare.com/products/watering-equipment/open-drinking-tubes/straight-tubes-ball-point	Length: 2.5 inches, Diameter: 5/16 inches, Model: TD100
C57BL/6J Mice	Jackson lab	https://www.jax.org/strain/000664	May also come from internal breeding colony
disposable serological pipets	VWR International (VWR)	https://us.vwr.com/store/product/4760455/vwr-disposable-serological-pipets-polystyrene-sterile-plugged	10 mL, 18 mL, or 25 mL
ethanol, pure, 190 proof (95%), USP, KOPTEC	Decon Labs (VWR)	https://us.vwr.com/store/product/4542412/ethanol-pure-190-proof-95-usp-koptec	---
heat gun	Master Appliances Corp.	http://www.masterappliance.com/master-heat-guns-kits/
heat shrink tubing	---	---	Diameter: 3/8 inches
industrial knife/blade	---	---	---
metal cage plate	---	---	Should be available through the university/institutional vivarium
mouse RO water	---	---	Should be available through the university/institutional vivarium
portable electronic scale	Ohaus (VWR)	https://us.vwr.com/store/product/4789377/portable-electronic-cs-series-scales-ohaus	---
red light headlamp	nyteBright (Amazon)	https://www.amazon.com/LED-Headlamp-Flashlight-Red-Light/dp/B00R0LMMF8/ref=sr_1_1?ie=UTF8&qid=1499591137&sr=8-1-spons&keywords=red+lamp+headlamp&psc=1	---
silicone stoppers	Fisher	---	---
thermometer	Fisher Scientific	https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-scientific-hygro-thermometer-clock-large-display-2/p-4077232	---
weigh boat	VWR International (VWR)	https://us.vwr.com/store/product/16773534/vwr-pour-boat-weighing-dishes	The lid from a pipete tip box is an appropriate alternative