Erişkin Sıçanlarda Spinal Kord Lateral Hemisite ve Asimetrik Davranış Değerlendirmeleri

Özet

Burada erişkin sıçanlarda^9'uncu torasik düzeyde güvenilir bir spinal kord lateral hemiksiyon (HX) üretmek için yapılan cerrahi prosedürleri ve böyle bir tek taraflı yaralanma sonrası asimetrik açıkları tespit etmek için tasarlanmış nörodavranışsal değerlendirmeleri açıklıyoruz.

Özet

Tamamlanmamış omurilik yaralanması (SCI) genellikle sensorimotor fonksiyonların bozukluklarına yol açar ve klinik olarak SCI.Human Brown-Séquard sendromunun en sık görülen tipidir. Bir omurilik lateral hemisection (HX) üretmek ve nörolojik bozuklukların değerlendirilmesi için yeterli metodolojiler Brown-Séquard sendromu güvenilir bir hayvan modeli kurmak için gereklidir. Lateral hemikesit modeli temel ve çevirisel araştırmalarda önemli bir rol oynasa da, böyle bir hemisitin oluşturulması ve tek taraflı fonksiyonun değerlendirilmesi için standart laştırılmış protokoller eksiktir. Bu çalışmanın amacı, 9^torasik (T9) vertebra düzeyinde bir sıçan spinal lateral HX üretmek için adım adım prosedürleri tanımlamaktır. Biz, daha sonra, HX için kombine bir davranış ölçeği tarif (CBS-HX) tek taraflı SCI için asimetrik nörolojik performans basit ve hassas bir değerlendirme sağlar. CBS-HX, 0 ile 18 arasında değişen, tek taraflı hindlimb stepping (UHS), kaplin, kontak yerleştirme ve ızgara yürüyüş dahil olmak üzere 4 ayrı değerlendirmeler oluşur. CBS-HX için ipsilateral ve kontralateral arka bacaklar ayrı ayrı değerlendirilir. T9 HX'ten sonra ipsilateral arka ekstremitenin davranış bozukluğu gösterdiğini, kontralateral arka ekstremitenin ise önemli ölçüde iyileştiğini gördük. CBS-HX, ipsilateral ve kontralateral arka bacaklar arasında etkili bir şekilde davranışsal fonksiyonları ayırarak ipsilateral arka ekstremitenin iyileşmesinin zamansal ilerlemesini saptamıştır. CBS-HX bileşenleri gerektiğinde ayrı ayrı veya diğer önlemlerle birlikte analiz edilebilir. Sadece torasik HX'in cerrahi prosedürleri ve davranışsal değerlendirmeleri hakkında görsel açıklamalar sağlasak da, bu ilke diğer eksik SCI'lere ve yaralanmanın diğer düzeylerinde uygulanabilir.

Giriş

Tamamlanmamış omurilik yaralanmaları (SCI) genellikle sensorimotor fonksiyonların ciddi ve kalıcı bozukluklarına yol açar ve klinik olarak EN sık görülen SCI¹tipidir. İnsanlarda Brown-Séquard sendromu felç ve yaralanma aynı (veya ipsilesional) tarafında propriosepsiyon kaybı ile sonuçlanan omurilik yarısına bir lezyon neden olur ve ters ağrı ve sıcaklık hissi kaybı (veya contralesional) yan^2,3,4. Spinal lateral hemisection hayvan modelleri insan Brown-Séquard sendromu taklit etmek için geniş kullanılır ve sıçanlarda bildirilmiştir^5,6,7,8,9, opossums¹⁰, ve maymunlar^7,11,12,13 çeşitli spinal düzeylerde çeşitli laboratuvarlar tarafından. Ancak, standart bir lateral hemiyon üretmek için ayrıntılı görselleştirilmiş prosedürler açıklanmamıştır. Lateral hemisection için adım adım prosedürlerin sağlanması modeli optimize etmeli ve temel ve çevirisel araştırmalarda deneysel sonuçların karşılaştırılmasını veya çoğaltılmasını kolaylaştırmalıdır.

Tek taraflı BIR SCI, simetrik yaralanmalar için konvansiyonel değerlendirmeler kullanılarak ölçülmesi zor asimetrik ve orantısız davranış açıkları üretir. Tek taraflı bir SCI için nörolojik bozuklukları değerlendirmek için yeterli bir metodoloji tek taraflı SCI modeli geliştirmenin önemli bir bileşenidir. Tek taraflı spinal yaralanmanın kilit rolüne rağmen, böyle bir yaralanmaya sahip hayvanlarda sensorimotor açıklarının değerlendirilmesi için standart protokoller eksiktir. Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) lokomotor derecelendirme ölçeği, bir bütün olarak lokomotion'ın yarı kantitatif bir tanımını veren yetişkin sıçanlar ¹⁴ için SCI'den sonra fonksiyonun en sık kullanılan ölçümü olmuştur. Ancak, her hindlimb bağımsız olarak ölçmek değildir.

Bu çalışmada, 9^torasik (T9) vertebra düzeyinde bir kemirgen spinal HX üretmek için adım adım prosedürleri rapor. Ayrıca tek taraflı arka bacak adımlama (UHS), kaplin, temas yerleştirme ve tek taraflı sci sonrası nörolojik bozukluklar ve iyileşme değerlendirmek için ızgara yürüyüş değerlendirmeleri içeren hemisite (CBS-HX) için kombine bir davranış ölçeği sokulmaktadır. Biz bu model yaralanma mekanizmaları ve tek taraflı SCIs için terapötik etkinliğini incelemek için yararlı bir model olacağını umuyoruz.

Protokol

Tüm cerrahi ve hayvan işleme prosedürleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi (Ulusal Araştırma Konseyi) ve Indiana Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanımı Rehberi kapsamında onaylandığı şekilde gerçekleştirilmiştir. Komitesi.

1. Genel Değerlendirme

1. Bu çalışma için yetişkin dişi Sprague-Dawley (SD) sıçanları (200 g, n=12 ağırlığında) kullanın. Hayvanları tüm test ortamlarına alışın ve cerrahi işlemden bir hafta önce tüm davranış testleri için temel veriler toplayın.
2. Deneysel gruplara kör olan iki gözlemcinin davranışsal değerlendirmelerini yapın.

2. Hayvan Hazırlığı

1. Cerrahi tabloyu %70 etanol ile temizleyin. Ameliyat masasına önceden ısıtılmış bir ısıtma yastığı yerleştirin. Cerrahi alanı steril bir cerrahi perde ile kaplayın. Steril gazlı bez, pamuklu bezler ve otoklavlı cerrahi aletleri cerrahi örtünün yüzeyine yerleştirin.
2. Cerrahi aletlerin cerrahi sterilizasyonu için bir mikroboncuk sterilizatörü açın.
   NOT: Bu deneyde kullanılan araçların bir örneği Şekil 1'degösterilmiştir.
3. Intraperitoneal (yani) ketamin (87.7 mg/kg) ve ksilezine (12.3 mg/kg) enjeksiyonu ile sıçananestezi. Anestezinin uygun düzlemine, parmak ucurması uyaranlarına yanıt sızarak ulaşıldığından emin olun. Ameliyat sırasında korneanın kurumasını önlemek için hayvanın gözlerine veteriner merhemi uygulayın.
4. Tıraş ederek göğüs omurlarını örten kılları çıkarın (Şekil 2A). Hepa filtre ile donatılmış bir vakum ile tıraş kürk çıkarın.
5. Cerrahi alanı iyot bazlı üç fırçalama ve etanol ile temizleyin.
6. Önerilen kesi bölgesi üzerinde bir fenestration ile steril bir perde ile hayvan kapak (Şekil 2B). Not; Videoda, cerrahi örtü gösteri amacıyla atlanmıştır.

3. Spinal Hemisection

1. Farenin en düşük kaburgası olan¹³ kaburgaya ve göğüs kafesine bağlanmayan yüzen kaburgaya dokunun. T13 omurile bağlantısını belirlemek için 13^kaburga dorsally izleyin ve daha sonra T10 omur tanımlamak için kadar saymak.
2. 8-11'inci vertebrali spinous prosesleri niörde üst üste 3 - 4 cm orta^th çizgi deri kesisi yapmak için neşter bıçağı (#15, Şekil 1)kullanın.
3. Cerrahi bir mikroskop altında, aynı neşter bıçağı kullanarak her iki tarafta t9 ve T10 omurlarının yönlerine doğru spinous süreçlerden yanal paraspinal kasları inceleyin ve ayırın.
   NOT: Bu yaklaşım, kanamaya neden olmadan dokuyu güzelce ayrı şıramaz.
4. Modifiye stabilizatör tutucu kullanarak omurgayı stabilize edin. Lateral vertebral kemiğin her iki tarafında bir yarık olun. Paslanmaz çelik kolları açığa çıkan enine proses yönlerinin altına kaydırın ve stabiliteyi sağlamak için vidaları sıkın.
5. Cerrahi alandan kasları geri çekmek için bir retraktör kullanın(Şekil 2B) ve T8-11 vertebral lamina ve spinous süreçleri ortaya çıkarmak için(Şekil 2C).
   NOT: T8 ve T9 spinous süreçleri arasında büyük bir boşluk vardır, Bunlar T9'u tanımlamak için önemli işaretlerdir(Şekil 2C, sırt görünümü). Yanal görünümden, T9 vertebra noktalarının spinous süreci caudally, T10 spinous proses noktaları dorsally ve T11 spinous proses noktaları rostrally; böylece, 3 spinous süreçleri bir piramit oluşturur ve T10 spinous süreci tepe oluşturur(Şekil 2D, yanal görünüm).
6. Bir rongeur kullanarak T9 vertebra üzerinde bir dorsal laminektomi gerçekleştirin. T9 spinous işlemini ortadan kaldırın ve laminanın küçük bir kısmını orta hatta(Şekil 3A, kesik çizgi) ve laminanın sağ kısmının tamamını mümkün olduğunca yanal olarak çıkarın(Şekil 3A, kesik çizgi). Laminektomi için, laminanın altına rongeur'ü hafifçe yerleştirin ve istenilen laminektomi bölgesi tamamlanana kadar bir seferde küçük bir kemik parçası koparın(Şekil 3B ve Şekil 3C).
7. Cerrahi bir mikroskop altında, omuriliğin dorsal orta hattını tanımlayın(Şekil 3C). Bir iğne (30 G) dikey olarak orta hattan omuriliğe, sağ tarafa bakan eğimli tarafı yla yerleştirin(Şekil 4A).
   NOT: İğne vertebral kanalın ventral duvarına ulaşmak için tüm omuriliği delmelidir.
8. Steril jel köpük küçük bir parça ile herhangi bir kanama durdurun.
9. Bir iridektomi/mikrocerrahi makasın bir ucunu orta hat iğne parkurundan, diğer ucunu da sağ hemi-kordun lateral yüzeyi boyunca takın ve makasla sağ hemi-kordonda tam bir kesim yapın(Şekil 4B).
   NOT: Kesme sırasında omurilikte sıkıştırma lezyonu en aza indirmek için omurilik kesim için keskin bir mikro makas kullanın.
10. Tam bir sağ hemisection onaylamak için lezyon boşluğu kesmek için bir bıçak olarak aynı iğnenin lateral kenarını kullanın. Vertebral kanalın alt kısmını cerrahi mikroskopla görselleştirerek sağ hemiksiyonun tamlığını doğrulayın(Şekil 4C, kesitsel görünüm; Şekil 4D, yanal görünüm; Şekil 4E, sırt görünümü).
11. Lezyon bölgesinin üzerine küçük bir parça jelatin sünger yerleştirin(Şekil 4F). Çimento karışımı kullanın ve sünger ve T8 ve T10(Şekil 4G, H)spinous süreçleri üzerinde dar bir köprü inşa.
    NOT: Çimento köprü kullanmanın amacı iki yönlüdür: 1) yaralanma yerinde geliştirilen yarayı dokunun geri kalanından ayırır ve 2) hayvan kurban edildikten sonra omurilik segmentinin kesilmesini kolaylaştırır.
12. 4-0 ipek iplik ile kas ve cilt tabakalarını ayrı ayrı dikin.
13. Hidrasyonu korumak için %0.9 steril salin ienjekte edin. 2 gün boyunca analjezik ajan Buprenorfin (0.05-2.0mg/kg S) 8-12 h/gün subkutan olarak enjekte edin. İlk hafta boyunca günde 2-3 kez, takip eden haftalarda ise 1-2 kez idrar kesesi preslenin spontan mesane boşluğu geri dönene kadar.

4. Ameliyat Sonrası Hayvan Bakımı

1. Hayvanı tek kişilik ev kafesine geri getirin. Hayvanın yeme/nemlendirme yeteneğine yardımcı olmak için kafesin alt kısmında nemli kemirgen chow veya jel sağlayın. Ameliyat sonrası iyileşme sırasında kafesin altına bir ısıtma yastığı yerleştirin. Isıtma yastığının aşırı ısınmayı önlemek için kafes alt kısmı sadece yarısını kapsadığından emin olun.
2. Hidrasyonu korumak için %0.9 steril salin ienjekte edin. 2 gün boyunca analjezik ajan Buprenorfin (0.05-2.0mg/kg S) 8-12 h/gün subkutan olarak enjekte edin. İlk hafta boyunca günde 2-3 kez, takip eden haftalarda ise 1-2 kez idrar kesesi preslenin spontan mesane boşluğu geri dönene kadar.

5. Tek Taraflı Hemisit Adımını (UHS) Değerlendirin

NOT: Tek taraflı hemizelik adım (UHS) testi, SCI hayvanlarının ipsilesional hindlimblarını açık alanda kullanabilme yeteneğinin doğrudan bir ölçüsüdür. 1.1'de belirtildiği gibi, hayvanlar 7 gün boyunca günde iki kez açık bir alan ortamına (çap 42 inç) ¹⁵ kez alıştılar. Hayvan gruplarına kör olan iki gözlemci testi gerçekletir. UHS skoru hem taban çizgisinde (T9 HX'ten 7 gün önce) hem de yaralanma sonrası zaman puanları toplanır. Değerlendirme adımları aşağıdaki gibi tanımlanır.

1. Açık bir alan ortamına hayvan yerleştirin ve 4 dakika boyunca hayvanın hareket incelemek.
   NOT: Test sırasında hayvana aktif hareket etmesi için teşvik verilebilir.
2. Tablo 1'deverilen formla, her davranış kategorisi için Evet için 1 ve Hayır için 0 değeri atayın ve ardından 0 ile 8 arasında son UHS puanı vermek için toplam değeri toplamı.
   NOT: Tablo 1 0'a göre: arka ekstremitenin gözlemlenebilir hareketi yoktur; 1 – 4: 3 arka bacak ekleminin izole hareketleri (kalça, diz ve ayak bileği); 5: hiçbir ağırlık desteği ile süpürme; 6: hiçbir ağırlık desteği ile yerleştirerek; 7: ağırlık desteği ile yerleştirme; ve 8: ağırlık desteği ile adım.
3. UHS puanlarını hem taban çizgisinde (T9 HX'ten 7 gün önce) hem de yaralanma sonrası zaman puanlarından toplayın.
   NOT: Puanlar T9 HX'ten sonra çeşitli zaman noktalarında değerlendirilecektir.

6. Kaplin

1. CPL'yi (yürüyüş kaplini) dar bir pist cihazında veya basit bir açık alanda yürüyen bir hayvanı kaydeden bir videoyla analiz edin.
2. Tablo 1'inbağlantı bölümünde ,"Hayır", "Düzensiz/beceriksiz" için 1 ve her CPL kategorisi için "Normal" için 2 puan atayın.
   NOT: Kaplin (CPL) testi homolog CPL (ön-ön/arka-arka ekstremiteler, Şekil 5A),diyagonal CPL (ön sol-arka sağ veya ön sağ-arka sol uzuvlar, Şekil 5B) ve homolateral CPL (aynı tarafta ön-arka uzuvlar, Şekil 5C)dahil olmak üzere ekstremitelerin alternatif hareketlerinin koordinasyonunu değerlendirmektir. T9 HX'ten sonra, ipsilesional taraftaki arka ekstremitenin açıkları homolog CPL(Şekil 5D),diyagonal CPL (Şekil 5E) ve homolateral CPL(Şekil 5F)değişimi ile sonuçlaşabilir hale gelir.

7. İletişim Yerleştirme

NOT: Hindlimb kontak yerleştirme testi proprioseptif uyaranlara hindlimb yanıtlarının motor entegrasyonunu değerlendirmek için kullanılır ¹⁶. Propriosepsiyon, arka ekstremite yüzeyin altına çekildikten sonra arka ekstremitesiyle yüzeye çıkarsa bozulmamış sayılır.

1. Hayvanı dikey bir pozisyonda tutun, böylece her iki arka bacak da yerleştirme tepkisi için kullanılabilir.
2. Bir arka ekstremitenin sırt yüzeyini hafifçe bir yüzeyin kenarına doğru fırçalayın (örn. hayvan çalışma tezgahı).
3. Yüzeye ayak yerleştirme gözlemleyin ve bir hindlimb temas yerleştirme puanı atayın. 0: hiçbir yerleştirme; 1: yerleştirme.
   NOT: Sırt yüzeyi stimülasyon alır ve refleks bozulmamış ise ayak daha sonra uzatır ve yüzeye ayak yerleştirin. Değerlendirme formu da Tablo 1'de yer al.)

8. Izgara Yürüyüş

NOT: Izgara yürüyüş testi spontan motor açıkları ve hassas atlama, koordinasyon ve doğru pençe yerleşimi dahil ekstremite hareketlerini değerlendirir.

1. Yüksek plastik kaplı tel örgü ızgara (36 × 38 cm 3 cm² açıklıklar) bir sıçan yerleştirin ve 30 adım boyunca platform boyunca serbestçe yürümek için izin.
2. Ayak seslerinin toplam sayısını ve her uzuv için ayak yanlış adımlarının sayısını sayın. Saymayı doğrulamak için video kayıtları yapılır.
   NOT: Kör olan iki gözlemci, hayvanlar yürürken ön ve arka ayakların pençe yerleşimini değerlendirir.
3. Her arka bacak için ızgara yürüyüş skorlarını aşağıdaki gibi atayın – 0: 15'ten büyük yanlış adımlar; 1: 15'ten daha az veya eşit yanlış adımlar; 2: 10'dan daha az veya eşit yanlış adımlar; ve 3: 5'ten daha az veya eşit yanlış adımlar.
   NOT: Puanlama değerlendirmesi Tablo 1'edayanmaktadır. Kesme puanları motor açıklarının şiddetinin ölçüleri olarak kullanılır.

9. Perfüzyon ve Doku İşleme

1. Adım 2.3'e benzer uygun anesteziden sonra, transkardiyal perfüzyon protokolü ^17'yiuygulayarak hayvanları dikkatlice perfüzyona geçirin.
2. Omurilik örneklerini kesip toplayın ve bir gecede %4 PFA'da düzeltin.
3. Numuneler daha sonra %30 sakaroz çözeltisine aktarılabilir.
4. Kes kesin kes ve standart prosedürlere göre bir akson marker SMI-31 ve astrositik marker glial fibrillary asidik protein (GFAP) ile seçilen bölümleri leke¹⁸.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan cerrahi işlemler T9'da tutarlı ve tekrarlanabilir lateral HX üretimine olanak sağlar. Perfüzyon ve deri alındıktan sonra, T9'daki cerrahi bölge artık dikiş le kolayca tespit edilebilir(Şekil 6A). Daha fazla diseksiyon çimento köprüsü(Şekil 6B)ve jelatin sünger(Şekil 6C)katmanları maruz sağlar. Omurilik daha sonra açık vertebral kanala maruz kalır ve sağ tarafta lateral hemisection doğrulanır (Şekil 4D). Yaralanma düzeyi daha maruz vertebral organları ve kaburga ile ilişkisi ile teyit edilebilir(Şekil 6D). Yaralanma merkez üssünde bir kesit immünüfasyon boyama sağ hemicord tam bir kayıp ve yaralanma sol hemicord kontralateral korunması gösterir. Kesit bir akson marker SMI-31 ve astrositik marker glial fibrillary asidik protein (GFAP)(Şekil 6E)ile boyanmıştır.

Nörodavranışsal olarak, CBS-HX sistemi bir T9 HX aşağıdaki zaman içinde asimetrik açıkları tespit yeteneğine sahiptir. HX'ten sonra ipsilateral arka ekstremite adım atma yeteneğini kaybederken, kontralateral arka ekstremite yürüme yeteneğini korudu. Her davranış ölçüsü için 3 deneme yaptık ve ölçme ve analiz için 3 denemenin ortalamasını kullandık. Ameliyat öncesi ölçüleri, diğer farelerin kullanımıyla karşılaştırıldığında en doğru kontrol olarak gördüğümüz bir temel olarak kullandık. UHS, CPL, kontak yerleştirme ve ızgara yürüyüşü gibi 4 ayrı ölçünün puanları ayrı ayrı analiz edilebilir(Şekil 7A-D)veya kompozit CBS-HX(Şekil 7E)olarak kombine edilebilir. İki yönlü ANOVA analizleri UHS'de önemli farklılıklar göstermiştir (F = 23.199, p < 0.001), kaplin (F = 8.376, p < 0.01), temas yerleştirme (F = 17.672, p < 0.001), ızgara yürüyüş (F = 19.261, p < 0.001), CBS-HX (F = 20.897, p < 0.001) ipsilateral ve contralateral ve contralateral arasında. Şekil 7A, UHS'nin t9 HX'ten sonraki sonuçlarını gösterir. Sakatlık sonrası ilk 3 gün içinde sıçanlar adım atma yeteneğini kaybetti ler ve ipsilesional hindlimb için 0-2 puan aldılar. Step benzeri hareketler sakatlıktan 7-10 gün sonra ipsilesional tarafta görünmeye başladı ve çoğu adım dorsal basamakta dır. T9 HX'ten 28 gün sonra, sıçanlar 8'lik uhs puanı yla neredeyse normal koordinasyonla plantar adımlar atabildiler. Karşılaştırma olarak, kontrlezyonel arka ekstremite daha az kesildi ve UHS skoru T9 HX'ten sonraki ilk 5 gün içinde düştü ve 10. Toplam CPL (homolateral, homolog ve diyagonal kaplin dahil) testi için, T9 HX'ten sonra koordinasyonun hem stabilitesi hem de uyarlanabilirliği belirgin bir şekilde azaltıldı(Şekil 7B). Yaralanmadan 1-5 gün sonra, HX hayvanlar CPL hiçbir belirti gösterdi. Zaman içinde, ipsilateral hindlimb CPL ortaya çıktı, genellikle beceriksiz, kararsız, ve uygunsuz hız, kuvvet ve yön değişen. İpsilateral arka ekstremitenin temas yerleştirmesi(Şekil 7C)ve ızgara yürümesi(Şekil 7D)de özellikle yaralanmadan sonraki ilk 5 gün içinde T9 HX'ten etkilenmiş ve genellikle hayvan plantar adımlar atmaya başladığında iyileşmiştir. Kompozit CBS-HX sistemi UHS, CPL, kontak yerleştirme ve ızgara yürüyüş testlerini içerir ve mümkün olan en yüksek 18 puan(Şekil 7E). Ipsilateral arka ekstremitelerin motor fonksiyonu, Insan Brown-Séquard sendromunda görülen açıklarla tutarlı olan T9 lateral HX'ten sonra CBS-HX skorlarında azalma olduğunu göstermiştir. İpsilateral arka ekstremitelerin motor fonksiyonu, T9 lateral HX'ten 1 gün ila 4 hafta sonra CBS-HX skorlarında kontralateral arka bacaklara göre bir azalma göstermiştir(Şekil 7E).

Böylece, UHS, CPL, kontak yerleştirme ve ızgara yürüyüş birleştiren kompozit CBS-HX sistemi maksimum 18 olası puan için torasik omurilik lateral yaralanma sonra sıçanların davranışsal fonksiyonlarını değerlendirmek için kullanılabilir.

Şekil 1. T9 sağ taraflı hemiyon üretmek için kullanılan cerrahi aletler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. Cerrahi exposure. A) Cerrahi bölgenin üst üste örten arkadaki saçı tıraş edin. B) Cerrahi alandaki kasları retraktör kullanarak geri çekin. C) T8-11 vertebral laminaları açığa çıkarmak ve tek tek spinous süreçleri (oklar) tanımlayın. T8 ve T9 spinous süreçleri arasında büyük bir boşluk olduğunu unutmayın, Hangi T9 tanımlamak için bir dönüm noktasıdır. D) Şematik çizim spinous süreçlerin yanal görünümünü gösterir. T9-11 spinous süreçleri t10 spinous süreci zirve olmak ile bir piramit oluşturur. Yine, T8 ve T9 spinous süreçler arasında büyük bir boşluk açıkça bir laminektomi yapılır T9 tanımlamak için bir dönüm noktası olarak görülüyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. Laminektomi ve sağ hemicord maruz . A) Şematik çizim, T9 omurunun içindeki omuriliğin kesitini gösterir. Kesikçizgi her iki tarafta laminektomi ölçüde gösterir. B) Şematik çizim, laminanın küçük bir kısmının sol tarafta, tüm vertebral kemerin ise sağ tarafta çıkarılmasını gösterir. Bir ok, kordonun dorsal orta çizgisini gösterir. C) Açıkta kalan omuriliğin dorsal görünümü. Dorsal ven sol ve sağ hemicords bölen omuriliğin ortasında yer olduğunu unutmayın. Sağ hemicord tamamen maruz kalmış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4. Lateral hemisit . A-D) Şematik çizimler, omuriliğe (A), T9 hemiksiyonuna (B), jelatin sünger ve çimento (C) kaplamasına ve T9 lateral hemiyonunun (D) lateral görünümünü gösteren orta hat iğnesi yerleştirilmelerini göstermektedir. C'deki kesik çizgiler, çıkarılan T9 vertebral lamina ve sağ hemicord'u özetler. E) Sağ omurilik hemiyonunun dorsal görünümü. F) Hemisit bölgesinin üzerine küçük bir parça jelatin sünger yerleştirilmesi. G-H) Sünger ve T8 ve T10'un dikenli prosesleri üzerine inşa edilmiş bir Simplex-P çimento köprüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5. Kaplin (CPL) testinin şematik çizimi. test. CPL testi, A) homolog CPL (ön-ön/arka-arka ekstremiteler), B) diyagonal CPL (ön sol-arka sağ/ön sağ-arka sol ekstremiteler) ve C) homolateral CPL (aynı tarafta ön-arka uzuvlar) dahil olmak üzere ekstremitelerin alternatif hareketlerinin koordinasyonunu değerlendirmektir. Sonra T9 HX (kırmızı kutu, D-F), hindlimb açığı ipsilesional tarafında görünür oldu ve hayvanlar homolog koordinasyon eksikliği göstermek (D), diyagonal (E) ve homolateral (F) CPL. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6. Doku diseksiyonu ve histoloji. Perfüzyondan sonra, dokular omuriliği ortaya çıkarmak için parçalara ayrıldı. Kesitler glial fibrillary asidik proteinin (Astrositler için bir belirteç olan GFAP) ve SMI31 (aksonlar için bir belirteç) çift immünükopesan boyama için işlenmiştir. A) Dikişin yaralanma yeri (sarı ok) için bir dönüm noktası olarak pozu. B) Diş çimentosu (sarı ok) maruz kalma. C) Jelatin süngerinin pozu (sarı ok). D) Sağ taraftaki spinal hemiksiyonu (sarı ok) belirleyin. E) Yaralanma merkez üssü nde bir omurilik kesiti GFAP ile immunostained (yeşil) ve SMI 31 (kırmızı). Sağ omurilik hemicord tamamen kesilmiş ve sol hemicord iyi korunmuş olduğunu gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7. Nörodavranışsal skorların sonuçları. Grafikler 5 ölçünün puanlarını gösterir: A, tek taraflı hemikesit skoru (UHS); B, kaplin (CPL); C, kontak yerleştirme; D, ızgara yürüyüş, ve E, kombine davranış puanı (CBS) ipsilateral ve kontralateral arka bacaklar da bir T9 HX sonra. Veriler ortalama ± s.e.m. *: p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001 ipsilateral ve kontralateral arka bacaklar arasında (İki yönlü ANOVA, Tukey çoklu karşılaştırma testi, n = 12 sıçan/grup). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Alt Puan Adı/Aralığı	Açıklama	Puan
Tek taraflı arka bacak adım	Gözlemlenebilir hafif arka bacak hareketi	№	0
(UHS)		Evet	1
(0-8)	Ayak Bileği Hareketi	№	0
		Evet	1
	Diz Hareketi	№	0
		Evet	1
	Kalça Hareketi	№	0
		Evet	1
	Süpürme (ağırlık desteği yok)	№	0
		Evet	1
	Yerleştirme (ağırlık desteği yok)	№	0
		Evet	1
	Yerleştirme (ağırlık desteği ile)	№	0
		Evet	1
	Adım	№	0
		Evet	1
Kaplin	Homolateral	№	0
(0-6)		Düzensiz/beceriksiz	1
		Normal	2
	Homolog	№	0
		Düzensiz/beceriksiz	1
		Normal	2
	Diyagonal	№	0
		Düzensiz/beceriksiz	1
		Normal	2
İletişim yerleştirme		№	0
(0-1)		Evet	1
Izgara yürüyüş	Miss adımları	>15	0
(0-3)		≤15	1
		≤10	2
		≤5	3
Toplam CBS-HX
(0-18)

Tablo 1: Hemisit (CBS-HX) için kombine davranış puanları

Tartışmalar

Bu çalışmada, erişkin sıçanlarda erkeklerde Brown-Séquard Sendromu'nu taklit eden basit, tutarlı ve tekrarlanabilir T9 spinal HX üretmek için adım adım prosedürler rapor ediyoruz. Ayrıca, tek taraflı arka ekstremite adım (UHS), kaplin (CPL) kombinasyonu ile ölçülen asimetrik nörolojik bozukluk ve iyileşme ilerlemesini değerlendirmek için hassas hemisit (CBS-HX) için kombine davranış skor sistemi sokulmaktadır. temas ve ızgara yürüyüş yerleştirerek. Yaralanmayı T9 düzeyinde göstermesek de bu işlem omuriliğin servikal ve lomber kordonlar da dahil olmak üzere diğer bölgelerine basit ve talepsiz bir şekilde uygulanabilir. Biz bu model, tek taraflı davranışdeğerlendirmeleri ile birlikte, SCI bu tür için yaralanma mekanizmaları ve terapötik etkinliğini incelemek için yararlı olacağını umuyoruz.

Lateral HX modeli sadece kordonun ipsilateral yarısını leziz olduğundan, kordonun kontralateral tarafı büyük ölçüde korunur ve iç kontrol olarak kullanılabilir. Birçok alçalan ve yükselen yollar tek taraflı olarak yansıtılır ve birçok durumda lateral hemisection bir tarafta aksonal bir yol hasara neden olan ve karşı tarafta aynı yolu korur, yeniden yapılanma karşılaştırma sağlar ve aynı hayvanda bu yollar fonksiyonel sonuçları. Buna ek olarak, daha lokalize bir lezyon üretmek belirli yolların hedeflemesine izin verebilir. Örneğin, bir ventral ve ventrolateral lezyon retikülospinal ve vestibulospinal yolları etkileyebilir. Bir dorsal veya dorsolateral lezyon kortikospinal ve rubrospinal yolları etkileyebilir. Hemisection veya parsiyel yaralanma modeli de anatomi ve propriospinal gibi diğer yolların fonksiyonu çalışmak için kullanılabilir, noradrenerjik veya serotonerjik yollar. Böylece, hemikesit modeli benzersiz duyusal afferents tarafından tazminat çalışma için istihdam edilebilir, inen yollar tarafından, ve içsel spinal devre tarafından. Bu model aynı zamanda HX sonrası lokomotor kurtarma mekanizmaları araştırmak için uygundur.

Lateral HX, otomatik yürüyüş analizi için motor görevler (örneğin, Treadscan veya Treadmill) paradigması altında değerlendirilebilir belirgin davranış bozuklukları, yol açar ¹⁹. Ayrıca, lezyonun kontralateral tarafındaki aksonal yollarin iletkenliği elektrofizyolojik kayıtlar kullanılarak ölçülebilir ve bu değerlendirme çeşitli tedaviler sonrasında fonksiyonel bir yeniden yapılanma oluşturma imkanı sağlar. Ayrıca, belirli bir yolun nöronlar içine anatomik izleyicilerin tek taraflı enjeksiyonlar anterogradely etiketli orta hat geçiş lifleri ve retrograd etiketli nöronlar ile bunların bağlantı görselleştirme izin^{20,21,22,23,24,25}.

Tipik bir spinal HX ameliyatı bitirmek için az 20 dakika sürer rağmen, kesin ve tutarlı bir HX elde etmek için bazı uygulama gerektirir. İlk olarak, spinal HX düzeyi nin hayvandan hayvana tutarlı olması önemlidir. Bu nedenle laminektomi için uygun vertebra segmentinin belirlenmesi önemlidir. İkinci olarak, HX'in tamamlandığından emin olun. Tam bir HX yapmak için, mikrosksorkullanarak kesme kılavuzu için orta hatta dikey olarak yerleştirilen 30-gauge iğne kullanabilirsiniz. İğne takılması da lezyon üzerinde posterior spinal damarlar veya kordon hasarı önler. 30-gauge iğnenin ikinci işlevi, lezyonun belirsizliği olmadığından emin olmak için kesiği takip etmek için bıçak görevi görebilmektir. Üçüncü olarak, lezyon sitesine jelatin yerleştirerek beyin omurilik sıvısı sızıntısı en aza indirebilirsiniz, ve jelatin üstüne çimento yerleştirerek ve vertebral lamina köprülelelele lezyon yerinde spinal vertebra istikrarını güçlendirmek ve yara iyileşmesini kolaylaştırmak. Elektrofizyolojik kayıtların uygulanması ile sinyal parazitini önlemek için, kaslar, fasya ve cilt 4-0 ipek iplik ile katmanlar halinde dikilmelidir. Son olarak, kontralateral omurilik hasarı en aza indirmek için her türlü çaba gösterilmelidir. Histolojik doğrulama bir tarafta tam bir lateral hemiyon onaylamak ve diğer tarafta kordonun diğer yarısının korunması için kurulmalıdır (Şekil 6E'degösterildiği gibi).

SCI sonra hareket geliştirmek için, önceki çalışmalarda hücre nakli, akson rejenerasyon ^8,18,,26,27, ve aktivite tabanlı rehabilitasyon ^28,29,30dahil olmak üzere stratejiler geniş bir yelpazede yararlanmıştır. Bu arada, fonksiyonel değerlendirme ve SCI aşağıdaki en iyi tedaviler için tarama için çeşitli davranış testleri kurulmuştur. BBB lokomotor derecelendirme ölçeği, bilateral hindlimbs etkileyen bir orta hat kontüzyonu veya transection yaralanmaları gibi spinal simetrik yaralanmaların lokomotor değerlendirilmesi için tasarlanmıştır ^14,31. Koordinasyon ve ton lama gibi BBB'nin bazı parametreleri her iki arka bacak gözlemlenerek kaydedilir. Eğer bir arka bacak sağlamsa ve diğeri asimetrik yaralanmalarda görüldüğü gibi açıkları gösteriyorsa, o zaman bozulmamış arka ekstremite etkilenen arka ekstremitenin skorunu sarsacaktır. BBB skoru tek taraflı yaralanma sonrası diğerinden bir arka bacak skoru na uygun olmadığından, tek taraflı omurilik yaralanmalarını değerlendirmek için ideal değildir. Ancak, her iki taraftaki eklem hareketi ve ağırlık desteği ayrı ayrı değerlendirilir ve BBB'nin bir parçası olarak hesaplanmaz ise, o zaman bozulmamış arka bacak (şam kontrolüne benzer) etkilenen arka ekstremitenin skoru na bulamayacaktır. Ayrıca, bozulmamış tarafı hayvanın genel puanı önyargı olmaz, bozulmamış arka bacak eklem hareketi dramatik açıkları yok çünkü, ağırlık desteği, ya da adım.

Hemisection için kombine davranış skoru lateral hemisection sıçan modelinde davranışsal iyileşme hassas ve kolay gerçekleştirilen bir değerlendirme olarak tasarlanmıştır. Hem erken hem de geç iyileşme evrelerinin davranışlarını değerlendirmek için kullanılabilir. Erken evre yaralanma sonrası 7-10 gün içindedir. HX sonrası ilk 3-5 gün içinde ipsilateral hindlimb aktivitesi sürekli olarak artmış ve spontan veya tedavi aracılı arka bacak hareketlerinin iyileşmekaydedilmesi için daha sık değerlendirilmelidir. HX sonrası 5-7 gün ile sıçanlar ağırlık desteği olmadan süpürme arka bacak hareketleri yapmaya başladılar. 7-10 gün içinde, sıçanlar genellikle ayakta durmaya ve adım atmaya başladılar. Bu aşamada, basamak paternine dikkat edilmelidir. Geç fazda (14-28 gün) ipsilateral arka bacak aktivitesi stabil ve normale yakındı.

Kaplin (CPL) kapasitesine de dikkat edilmelidir. CPL testi (yürüyüş kaplini) açık alan testi sırasında bir video (örneğin, Treadscan/Catwalk) veya bir film çekimi videosu ile gerçekleştirilebilir. Araştırmacıların yürüyüş analiz sistemine erişimi yoksa ikinci seçenek esneklik sağlar. Her iki video kayıt oturumu için, bu test için her ayak için en az iki ardışık touchdown gereklidir. Analiz için üç bağlantı paramı vardır: homolog, homolateral ve diyagonal bağlantı (adım 6.2). Her kaplin bir referans ayak ve verilen ayak içerir. Örneğin homolog bağlantı (ön sol-ön sağ veya arka sol-arka sağ) atın, verilen ayağın referans ayağının bir adım lık bir süreye bölündüğü ilk touchdown zamanıdır. Sol ve sağ ayak faz dışında olması gerektiğinden, mükemmel bağlantı 0.5 olmalıdır. Bu homolateral kaplin (sol ön-sol arka veya sağ ön-sağ arka) aynı durumdur. Ancak, diyagonal bağlantı için (sol ön-sağ arka, veya sağ ön-sol arka), iki ayak faz olmalıdır beri mükemmel kaplin 0 veya 1 olmalıdır. Adım 6.4 olarak, her CPL için 0'dan 2'ye bir puan atıyoruz. Ayrıntılı olarak, bir puan 0 verilen ayak temsil edecek bir touchdown bitirmek için hareket edemiyor, dolayısıyla hiçbir CPL; verilen ayak bir touchdown bitirir ama mükemmel kaplin değil beri bir puan 1 herhangi bir düzensiz veya beceriksiz CPL temsil eder; bir puan 2 0.5 mükemmel bir kaplin anlamına gelir. Üç bağlantı parametresi kavramları iyi önceki yayınlarda^32,33açıklanmıştır. CPL kontak yerleştirme ve ızgara yürüyüş değerlendirmeleri ile kombine edilebilir. Birleşik davranış skorlama sisteminin tek tek bileşenleri SCI'nin farklı sıçan modellerinde az ya da çok etkili olacaktır. CPL için, açıkları açıkça değişim oranı ve dizi bütünlüğü görünür hale geldi. Proprioseptif arka ekstremite yerleştirerek açıkları açıkça tek taraflı HX sonra ortaya olabilir. Çalışmamızda, tüm sıçanlar ipsilezyonal hindlimb ekstremite açıkları yerleştirerek gösterdi kontralateral hindlimb yerleştirerek hiçbir açıkları gösterdi. Kortikospinal yolu içeren kontak yerleştirme de değerlendirilmesi göz önünde bulundurulmalıdır. Olası yorgunluk sorunlarını elemek için, davranışsal testlerin sırası her testte randomize edilebilir.

Sonuç olarak, insanlarda Brown-Séquard Sendromu'nu taklit eden T9 spinal HX'in vivo sıçan modelinin tekrarlanabilir bir modelini oluşturmak için adım adım prosedürler rapor ediyoruz. Hemiseksiyon için kombine davranış skorlama sistemi tek taraflı bir SCI sonra yaralanma mekanizmaları ve tedavileri değerlendirmek için bireysel hindlimb davranışsal sonuçların daha ayrımcı bir ölçü sunuyor. Torasik HX'in cerrahi prosedürleri ve davranışsal değerlendirmelerinin sadece görsel bir açıklamasını sağlasak da, burada tanımlanan yöntemler farklı yaralanma düzeylerindeki diğer eksik STI'lere uygulanabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baby-Mixter Hemostat	FST	13013-14	Can be any brand of choice
Elevated plastic coated wire mesh grid	Any		36×38 cm with 3 cm2 openings
Gel foam	Moore Medical	2928	Can be any brand of choice.
Grip cement kit, powder and solvent	Dentsply	675570	Can be any brand of choice.
Microbead Sterilizer	FST	NA	Can be any brand of choice
Pearson Rongeur	FST	16015-17	Can be any brand of choice.
Retractors	Jinxie surgical tools	6810	Can be any brand of choice
Scalpel Handle	FST	10003-12	Can be any brand of choice
Simplex-P cement	Stryker		Can be any brand of choice.
TreadScan automatic gait analysis	CleverSys Inc	NA	Can be any brand of choice