Hemiseção Lateral da Medula Espinhal e Avaliações Comportamentais Assimétricas em Ratos Adultos

Resumo

Aqui descrevemos procedimentos cirúrgicos para produzir uma hemiseção lateral medular confiável (HX) no nível⁹ torácico em ratos adultos e avaliações neurocomportamentais projetadas para detectar déficits assimétricos após tal lesão unilateral.

Resumo

A lesão medular incompleta (SCI) muitas vezes leva a prejuízos das funções sensoriais e é clinicamente o tipo mais freqüente de SCI. A síndrome de Brown-Séquard humano é um tipo comum de SCI incompleto causado por uma lesão a metade da medula espinhal que resulta em paralisia e perda de propriocepção no mesmo lado (ou ipsilesional) como a lesão, e perda de dor e sensação de temperatura no lado oposto (ou contralelerial). Metodologias adequadas para a produção de uma hemiseção lateral da medula espinhal (HX) e avaliação de prejuízos neurológicos são essenciais para estabelecer um modelo animal confiável da síndrome brown-séquard. Embora o modelo de hemiseção lateral tenha um papel fundamental na pesquisa básica e translacional, faltam protocolos padronizados para a criação de tal hemisesecção e avaliação da função unilateralizada. O objetivo deste estudo é descrever procedimentos passo a passo para produzir um HX lateral espinhal de rato no nível vertebral do^9º torácico (T9). Nós, então, descrevemos uma escala de comportamento combinada para HX (CBS-HX) que fornece uma avaliação simples e sensível do desempenho neurológico assimétrico para SCI unilateral. O CBS-HX, que varia de 0 a 18 anos, é composto por 4 avaliações individuais que incluem pisada de membro traseiro unilateral (SUS), acoplamento, colocação de contato e caminhada em grade. Para cbs-HX, os membros laterais ipsilaterais e contralaterais são avaliados separadamente. Descobrimos que, após um T9 HX, o membro traseiro ipsilateral apresentou função comportamental prejudicada, enquanto o membro traseiro contralateral apresentou recuperação substancial. O CBS-HX efetivamente discriminava funções comportamentais entre os membros laterais ipsilaterais e contralaterais e detectou progressão temporal da recuperação do membro hindilateral ipsilateral. Os componentes CBS-HX podem ser analisados separadamente ou em combinação com outras medidas quando necessário. Embora tenhamos apenas fornecido descrições visuais dos procedimentos cirúrgicos e avaliações comportamentais de um HX torácico, o princípio pode ser aplicado a outros IMc incompletos e em outros níveis da lesão.

Introdução

As lesões medulares incompletas (SCI) muitas vezes levam a prejuízos graves e persistentes das funções sensoriais e são clinicamente o tipo mais freqüente de SCI¹. A síndrome de Brown-Séquard em humanos é causada por uma lesão a metade da medula espinhal que resulta em paralisia e perda de propriocepção no mesmo lado (ou ipsilesional) como a lesão, e perda de dor e sensação de temperatura no lado oposto (ou contralecionista)^{lado 2,3,4}. Os modelos animais de hemiseção lateral espinhal são usados amplamente para imitar a síndrome de Brown-Séquard humano e foram relatados em ratos^5,6,7,8,9, gambás¹⁰, e macacos^7,11,12,13 por vários laboratórios em vários níveis da coluna vertebral. No entanto, não foram descritos procedimentos detalhados visualizados para a produção de uma hemiseção lateral padrão. O fornecimento de procedimentos passo a passo para uma hemisesecção lateral deve otimizar o modelo e facilitar a comparação ou replicação de resultados experimentais em pesquisas básicas e translacionais.

Um SCI unilateral produz déficits de comportamento assimétricos e desproporcionais que são difíceis de medir usando avaliações convencionais para lesões simétricas. Uma metodologia adequada para avaliar os prejuízos neurológicos para um SCI unilateral é um componente essencial para o desenvolvimento de um modelo de SCI unilateral. Apesar do papel fundamental de uma lesão unilateral na coluna vertebral, faltam protocolos padronizados para avaliar déficits sensoriais em animais com tal lesão. A escala de classificação locomotor Basso-Beattie-Bresnahan (BBB) tem sido a medição de função mais usada após o SCI para ratos adultos ^14, o que produz uma descrição semiquantitativa da locomoção como um todo. No entanto, não mede cada membro traseiro independentemente.

Neste estudo, relatamos procedimentos passo a passo para produzir um HX espinhal de roedores no nível vertebral do^9º torácico (T9). Também introduzimos uma escala de comportamento combinada para hemisesecção (CBS-HX) que inclui revisão unilateral de membros traseiros (SUS), acoplamento, colocação de avaliações de caminhada e caminhada de grade para avaliação de deficiências neurológicas e recuperação após uma SCI unilateral. Esperamos que este modelo seja um modelo útil para examinar mecanismos de lesão e eficácias terapêuticas para ASCs unilaterais.

Protocolo

Todos os procedimentos cirúrgicos e de manejo animal foram realizados conforme aprovado no Guia de Cuidado e Uso de Animais Laboratoriais (Conselho Nacional de Pesquisa) e nas Diretrizes da Escola de Medicina Institucional de Indiana Comité.

1. Consideração Geral

1. Use ratos sprague-dawley femininos adultos (SD) (pesando 200 g, n=12) para este estudo. Habituar animais a todos os ambientes de teste e coletar dados de linha de base para todos os testes de comportamento uma semana antes do procedimento cirúrgico.
2. Realizar as avaliações comportamentais por dois observadores cegos aos grupos experimentais.

2. Preparação animal

1. Limpe a mesa cirúrgica com 70% de etanol. Coloque uma almofada de aquecimento pré-aquecida na mesa cirúrgica. Cubra a área cirúrgica com uma cortina cirúrgica estéril. Coloque a gaze estéril, cotonetes de algodão e ferramentas cirúrgicas autoclaved na superfície da cortina cirúrgica.
2. Ligue um esterilizador de microesferas para a esterilização interoperativa de ferramentas cirúrgicas.
   NOTA: Um exemplo das ferramentas utilizadas neste experimento é mostrado na Figura 1.
3. Anestesiar o rato com uma injeção intraperitoneal (i.p.) de cetamina (87,7 mg/kg) e xilazina (12,3 mg/kg). Certifique-se de que o plano adequado da anestesia seja alcançado sem resposta ao estímulo de aperto do dedo do dedo. Aplique pomada veterinária aos olhos do animal para evitar a secagem da córnea durante a cirurgia.
4. Remova o cabelo sobreposto às vértebras torácicas por meio da raspada(Figura 2A). Remova a pele raspada com um vácuo equipado com um filtro HEPA.
5. Limpe a área cirúrgica com três esfregões alternados de esfoliante à base de iodo e etanol.
6. Cubra o animal com uma cortina estéril com uma fenestração sobre o local de incisão proposto(Figura 2B). Nota; Em vídeo, a cortina cirúrgica foi omitida para fins de demonstração.

3. Hemição sinozona espinhal

1. Toque na^costela 13, que é a costela mais baixa do rato e uma costela flutuante que não se conecta ao esterno. Siga a^13ª costela dorsalmente para identificar sua conexão com a vértebra T13 e, em seguida, conte até identificar a vértebra T10.
2. Use uma lâmina de bisturi (#15, Figura 1) para realizar uma incisão de pele média de 3 a 4 cm na parte de trás sobreos processos versícidos versíteros 8-11.^th
3. um microscópio cirúrgico, dissecar sem rodeios e separar os músculos paraespinhais lateralmente dos processos espinhosos para as facetas das vértebras T9 e T10 em ambos os lados usando a mesma lâmina de bisturi.
   NOTA: Esta abordagem provocará bem o tecido sem causar hemorragia.
4. Estabilizar a coluna vertebral usando um suporte estabilizador modificado. Faça uma fenda em ambos os lados do osso vertebral lateral. Deslize os braços de aço inoxidável as facetas do processo transversal exposta e aperte os parafusos para garantir a estabilidade.
5. Use um retrátil para retirar os músculos da área cirúrgica (Figura 2B) e para expor os processos de laminae vertebral T8-11 e spinous(Figura 2C).
   NOTA: Há uma grande lacuna entre os processos espinhosos T8 e T9, que são marcos para a identificação de T9 (Figura 2C, visão dorsal). Do ponto de vista lateral, o processo espinhoso da vértebra T9 aponta caudally, o processo girado T10 aponta dorsalmente, e os pontos do processo espinhoso T11 rostamente; assim, os 3 processos espinhosos formam uma pirâmide e o processo giraspos T10 forma o pico(Figura 2D, visão lateral).
6. Faça uma laminectomia dorsal na vértebra T9 usando um rongeur. Retire o processo girado T9 e remova uma pequena parte da lâmina esquerda para a linha média(Figura 3A,linha tracejada), e toda a parte direita da lâmina o mais lateralpossível(Figura 3A,linha tracejada). Para laminectomia, insira o rongeur suavemente a lâmina e corte um pequeno pedaço de osso de cada vez até que uma região desejada de laminectomia seja concluída(Figura 3B e Figura 3C).
7. Sob um microscópio cirúrgico, identifique a linha média dorsal da medula espinhal(Figura 3C). Insira uma agulha (30 G) verticalmente através da linha média na medula espinhal com o lado chanfrado voltado para o lado direito(Figura 4A).
   NOTA: A agulha deve penetrar toda a medula espinhal para alcançar a parede ventral do canal vertebral.
8. Pare qualquer sangramento com um pequeno pedaço de gelespuma estéril.
9. Insira uma ponta de uma tesoura de iridectomia/microcirúrgica através da faixa de agulha média e a outra ponta ao longo da superfície lateral do hemi-corddireito direito e, em seguida, faça um corte completo no hemi-cord direito com a tesoura(Figura 4B).
   NOTA: Use uma microtesoura afiada para o corte da medula espinhal para minimizar a lesão de compressão na medula espinhal durante o corte.
10. Use a borda lateral da mesma agulha que uma faca para cortar a abertura da lesão para confirmar uma hemisessecção direita completa. Verifique a completitude da hemisesecção direita visualizando a parte inferior do canal vertebral com o microscópio cirúrgico (Figura 4C,visão transversal; Figura 4D, visão lateral; Figura 4E, visão dorsal).
11. Coloque um pequeno pedaço de esponja de gelatina sobre o local da lesão(Figura 4F). Use a mistura de cimento e construa uma ponte estreita sobre a esponja e os processos espinhosos de T8 e T10(Figura 4G, H).
    NOTA: O propósito de usar uma ponte de cimento é duplo: 1) separa a cicatriz desenvolvida no local da lesão do resto do tecido, e 2) torna mais fácil dissecar o segmento da medula espinhal após o sacrifício animal.
12. Suturar as camadas muscular e cutânea separadamente com fio de seda 4-0.
13. Injete 0,9% soro fisiológico estéril subcutâneamente para manter a hidratação. Injete um agente analgésico Buprenorfina (0,05-2,0mg/kg S) 8-12 h/dia subcutânea durante 2 dias. Pressione a bexiga urinária 2-3 vezes por dia durante a primeira semana e 1-2 vezes nas semanas seguintes até que a bexiga espontânea retorne.

4. Cuidados com animais pós-operatórios

1. Devolva o animal para sua gaiola de casa única. Forneça chow de roedor úmido ou gel na parte inferior da gaiola para ajudar na capacidade do animal de comer/hidratar. Coloque uma almofada de aquecimento abaixo da gaiola durante a recuperação pós-cirurgia. Certifique-se de que a almofada de aquecimento cobre apenas metade do fundo da gaiola para evitar superaquecimento.
2. Injete 0,9% soro fisiológico estéril subcutâneamente para manter a hidratação. Injete um agente analgésico Buprenorfina (0,05-2,0mg/kg S) 8-12 h/dia subcutânea durante 2 dias. Pressione a bexiga urinária 2-3 vezes por dia durante a primeira semana e 1-2 vezes nas semanas seguintes até que a bexiga espontânea retorne.

5. Avalie a revisão unilateral da hemiseção (SUS)

NOTA: O teste unilateral de revisão da hemisesecção (SUS) é uma medida direta da capacidade dos animais SCI de utilizar seu membro traseiro ipsilesional no campo aberto. Como mencionado em 1.1, os animais foram aclimatados a um ambiente de campo aberto (diâmetro 42 polegadas) ¹⁵ duas vezes por dia durante 7 dias. Dois observadores cegos para os grupos animais realizam o teste. A pontuação do SUS em ambas as linhas de base (7 dias antes do T9 HX) e os pontos de tempo após a lesão serão coletados. As etapas para avaliação são descritas como seguidas.

1. Coloque o animal em um ambiente de campo aberto e examine a locomoção do animal por 4 min.
   NOTA: Durante os testes, pode-se incentivar o animal a se mover ativamente.
2. Com o formulário fornecido na Tabela 1,atribua um valor de 1 para Sim e 0 para Não para cada categoria de comportamento e, em seguida, suma o valor total para dar uma pontuação final do SUS de 0 a 8.
   NOTA: De acordo com a Tabela 10: nenhum movimento observável do membro traseiro; 1 – 4: movimentos isolados de 3 articulações de membros posteriores (quadril, joelho e tornozelo); 5: varrer sem suporte de peso; 6: colocação sem suporte de peso; 7: colocação com suporte de peso; e 8: pisar com suporte de peso.
3. Coletar pontuações do SUS tanto na linha de base (7 dias antes do T9 HX) quanto nos pontos de tempo após a lesão.
   NOTA: As pontuações serão avaliadas em vários pontos de tempo após o T9 HX.

6. Acoplamento

1. Analise o CPL (acoplamento de marcha) com um vídeo registrando um animal andando em um dispositivo de pista estreito ou em um simples campo aberto.
2. Na seção de acoplamento da Tabela 1,atribua uma pontuação de 0 para "Não", 1 para "Irregular/desajeitado" e 2 para "Normal" para cada categoria CPL.
   NOTA: O teste de acoplamento (CPL) é para avaliar a coordenação dos movimentos alternados dos membros, incluindo cpl homólogo (membros dianteiros/traseiros, Figura 5A), CPL diagonal (membros dianteiros esquerdo-traseiros direito ou dianteiro direito- traseiro, Figura 5B), e CPL homolateral (membros dianteiros-traseiros do mesmo lado, Figura 5C). Seguindo um T9 HX, os déficits do membro traseiro no lado ipsilesional tornam-se visíveis, resultando na alternância do CPL homólogo (Figura 5D),CPL diagonal(Figura 5E)e CPL homolateral(Figura 5F).

7. Colocação de contato

NOTA: O teste de colocação do contato com o membro traseiro é utilizado para avaliar a integração motora das respostas dos membros traseiros aos estímulos proprioceptivos ¹⁶. A propriocepção é considerada intacta se o animal subir com seu membro traseiro sobre a superfície depois que o membro traseiro é puxado para baixo abaixo da superfície.

1. Segure o animal em posição vertical para que ambos os membros posteriores estejam disponíveis para a resposta de colocação.
2. Escove a superfície dorsal de um membro traseiro para a frente levemente em direção à borda de uma superfície (por exemplo, banco de trabalho animal).
3. Observe a colocação do pé na superfície e atribua uma pontuação de colocação de contato com o membro traseiro. 0: sem colocação; 1: colocação.
   NOTA: A superfície dorsal recebe estimulação e o pé se estenderá posteriormente e colocará o pé sobre a superfície se o reflexo estiver intacto. O formulário de avaliação também está na Tabela 1.

8. Grid Walking

NOTA: O teste de caminhada da grade avalia déficits motores espontâneos e movimentos de membros envolvidos em passos precisos, coordenação e colocação precisa da pata.

1. Coloque um rato em uma grade de malha de arame revestida de plástico elevada (36 × 38 cm com aberturas de 3 cm²⁾ e permita que ele ande livremente pela plataforma por 30 passos.
2. Conte o número total de passos e o número de erros no pé para cada membro. Gravações de vídeo são feitas para confirmar a contagem.
   NOTA: Dois observadores cegos avaliam a colocação de patas de membros dianteiros e membros traseiros à medida que os animais caminham.
3. Atribuir as pontuações de caminhada da grade para cada membro traseiro da seguinte forma – 0: erros maiores que 15; 1: erros menores ou iguais a 15; 2: erros menores ou iguais a 10; e 3: erros menores ou iguais a 5.
   NOTA: A avaliação da pontuação é baseada na Tabela 1. Os escores de cortes são utilizados como medidas de gravidade dos déficits motores.

9. Perfusão e Processamento de Tecidos

1. Após anestesia adequada semelhante na etapa 2.3, perfundir os animais cuidadosamente seguindo o protocolo de perfusão transcardíaca ¹⁷.
2. Dissecar e coletar as amostras da medula espinhal e corrigi-las em 4% de PFA durante a noite.
3. As amostras podem então ser transferidas para uma solução de sacarose de 30%.
4. Corte a medula espinhal em seções transversais e manche as seções selecionadas com um marcador de axôno SMI-31 e proteína fibrial glial glial glial ascítica (GFAP) de acordo com os procedimentos padrão¹⁸.

Resultados

Os procedimentos cirúrgicos descritos acima permitem a produção de um HX lateral consistente e reprodutível em T9. Após a perfusão e remoção da pele, o local cirúrgico em T9 poderia ser facilmente identificado por uma sutura residual (Figura 6A). A dissecção adicional permite a exposição da ponte de cimento(Figura 6B)e da esponja de gelatina(Figura 6C)em camadas. A medula espinhal é então exposta ao canal vertebral aberto e uma hemiseção lateral no lado direito é confirmada (Figura 4D). O nível da lesão pode ser ainda mais confirmado pela sua associação com os corpos vertebrais e costelas expostos (Figura 6D). A coloração de imunofluorescência de uma seção transversal no epicentro da lesão mostra uma perda completa do hemicord direito e a preservação do hemicord esquerdo contralateral à lesão. A seção manchada com um marcador de axôno SMI-31 e proteína ácida fibriária glial glial ascítica (GFAP)(Figura 6E).

Neurocomportamentalmente, o sistema CBS-HX é capaz de detectar déficits assimétricos ao longo do tempo após um T9 HX. Após o HX, o membro traseiro ipsilateral perdeu sua capacidade de pisar, enquanto o membro traseiro contralateral manteve a capacidade de andar. Para cada medida de comportamento, foram realizados 3 ensaios e utilizou-se a média dos 3 ensaios para quantificação e análise. Usamos a medida pré-cirurgia como uma linha de base que consideramos como o controle mais preciso em comparação com o uso de outros ratos. Escores das 4 medidas individuais, ou seja, UHS, CPL, colocação de contato e caminhada em grade podem ser analisadas separadamente (Figura 7A-D) ou podem ser combinadas em um CBS-HX composto (Figura 7E). Análises bidirecionais da ANOVA mostraram diferenças significativas no SUS (F = 23.199, p < 0,001), acoplamento (F = 8,376, p < 0,01), colocação de contato (F = 17.672, p < 0,001), grid walking (F = 19.261, p < 0,001), CBS-HX (F = 20.897, p < 0,001) entre os lados ipsilateral e contralateral. A Figura 7A mostra os resultados do SUS após um T9 HX. Nos primeiros 3 dias após a lesão, os ratos perderam a capacidade de pisar e receberam uma pontuação de 0-2 para o membro traseiro ipsilesional. Movimentos semelhantes a passos começaram a aparecer no lado ipsilesional em 7-10 dias após a lesão, com a maioria dos passos sendo passos dorsais. 28 dias após o T9 HX, os ratos poderiam tomar medidas plantar com coordenação praticamente normal com uma pontuação de SUS atribuída de 8. Como comparação, o membro traseiro contralelesional foi menos interrompido e o escore do SUS caiu nos primeiros 5 dias após o T9 HX e retornou ao nível de linha de base após o 10º dia pós-lesão. Para o teste total de CPL (incluindo acoplamento homolateral, homólogo e diagonal), tanto a estabilidade quanto a adaptabilidade da coordenação após o T9 HX foram significativamente reduzidos(Figura 7B). 1-5 dias após a lesão, os animais HX não mostraram nenhum sinal de CPL. Com o tempo, CPL do membro hindipéris ipsilateral emergiu, muitas vezes desajeitado, instável e inapropriadamente variável em sua velocidade, força e direção. A colocação de contato (Figura 7C) e a caminhada da grade (Figura 7D) do membro traseiro ipsilateral também foram afetadas pelo T9 HX particularmente nos primeiros 5 dias após a lesão, e geralmente se recuperaram quando o animal começou a tomar passos plantar. O sistema cbs-hx composto inclui os testes de SUS, CPL, colocação de contato e caminhada em grade para uma pontuação máxima possível de 18(Figura 7E). A função motora dos membros laterais ipsilaterais demonstrou uma diminuição nos escores de CBS-HX após o HX lateral T9, o que é consistente com os déficits observados na síndrome de Brown-Séquard humano. A função motora dos membros laterais ipsilaterais demonstrou uma diminuição nos escores cbs-HX de 1 dia para 4 semanas após o HX lateral T9 em comparação com os membros contrários contralaterais(Figura 7E).

Assim, o sistema cbs-hx composto que combina o SUS, CPL, colocação de contato e caminhada em grade pode ser usado para avaliar a função comportamental dos ratos após a lesão lateral da medula espinhal torácica para um escore máximo possível de 18.

Figura 1. Ferramentas cirúrgicas utilizadas para a produção de uma hemisesecção t9 do lado direito. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Exposurecirúrgica. A) Raspe o cabelo nas costas sobre a região cirúrgica. B) Retrair os músculos da área cirúrgica usando um retrátil. C) Expor a lâmina vertebral T8-11 e definir processos espinhosos individuais (setas). Note que há uma grande lacuna entre os processos giraissos T8 e T9, que é um marco para a identificação de T9. D) O desenho esquemático mostra a visão lateral dos processos espinhosos. Os processos espinhosos T9-11 formam uma pirâmide com o processo girado T10 sendo o pico. Novamente, uma grande lacuna entre os processos giraissos T8 e T9 é claramente vista como um marco para identificar T9 onde uma laminectomia é realizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Laminectomia e exposição do hemicord direito. A) O desenho esquemático mostra a seção transversal da medula espinhal dentro da vértebra T9. A linha tracejada indica a extensão da laminectomia de cada lado. B) O desenho esquemático mostra a remoção de uma pequena parte da lâmina no lado esquerdo e de todo o arco vertebral do lado direito. Uma seta indica a linha média dorsal do cabo. C) Visão dorsal da medula espinhal exposta. Note-se que a veia dorsal estava localizada no meio da medula espinhal dividindo as hemifios esquerda e direita. O hemicord direito foi completamente exposto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Hemiseção lateral. A-D) Desenhos esquemáticos mostram a inserção da agulha média na medula espinhal (A), a hemiseção T9 (B), a cobertura de gelatina e cimento (C) e a visão lateral de uma hemiseção lateral T9 (D). Linhas tracejadas em C esboçam a lâmina vertebral T9 removida e o hemicord direito. E) Visão dorsal de uma hemisessecção da medula espinhal direita. F) Colocação de um pequeno pedaço de esponja de gelatina sobre o local da hemiseção. G-H) Uma ponte de cimento Simplex-P construída sobre a esponja e os processos espinhosos de T8 e T10. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Desenho esquemático do teste de acoplamento (CPL). test. O teste CPL é avaliar a coordenação dos movimentos alternados dos membros, incluindo A) CPL homólogo (membros dianteiros/traseiros), B) CPL diagonal (membros dianteiros esquerda-esquerda/dianteiro-esquerda direita-esquerda) e C) CPL homolateral (membros dianteiros-traseiros do mesmo lado). Após O T9 HX (caixa vermelha, D-F), o déficit do membro traseiro tornou-se visível no lado ipsilesional e os animais mostram falta de coordenação em homolog (D), diagonal (E) e homolateral (F) CPL. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Dissecção de tecidos e histologia. Após a perfusão, os tecidos foram dissecados para expor a medula espinhal. Foram processadas seções transversais para dupla coloração imunofluorescente de proteína ácido fibrial glial (GFAP, marcador para astrócitos) e SMI31 (marcador para axôns). A) Exposição da sutura como marco para o local da lesão (seta amarela). B) Exposição do cimento dentário (seta amarela). C) Exposição da esponja de gelatina (seta amarela). D) Identificar a hemiseção espinhal do lado direito (seta amarela). E) Seção transversal da medula espinhal no epicentro da lesão imunoscente com GFAP (verde) e SMI 31 (vermelho). Mostra que a hemicord direita foi completamente cortada e a hemicord esquerda estava bem preservada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7. Resultados de escores neurocomportamentais. Os gráficos mostram escores das 5 medidas: A, o escore de hemisesecção unilateral (SUS); B, acoplamento (CPL); C, colocação de contato; D, grid walking e E, pontuação de comportamento combinada (CBS) em membros laterais ipsilaterais e contralaterais após um T9 HX. Os dados representam a média ± s.e.m. *: p < 0,05, **: p < 0,01, ***: p < 0,001 entre membros laterais ipsilaterais e contralaterais (ANOVA bidirecional, teste de múltiplas comparações de Tukey, n = 12 ratos/grupos). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome/intervalo do subscore	Descrição	Pontuação
Pisando em membros traseiros unilaterais	Movimento leve mente observável de membros traseiros	Não	0
(UHS)		Sim	1
(0-8)	Movimento do Tornozelo	Não	0
		Sim	1
	Movimento do Joelho	Não	0
		Sim	1
	Movimento do Quadril	Não	0
		Sim	1
	Varrendo (sem suporte de peso)	Não	0
		Sim	1
	Colocação (sem suporte de peso)	Não	0
		Sim	1
	Colocação (com suporte de peso)	Não	0
		Sim	1
	Pisando	Não	0
		Sim	1
Acoplamento	Homolateral	Não	0
(0-6)		Irregular/desajeitado	1
		Normal	2
	Homólogo	Não	0
		Irregular/desajeitado	1
		Normal	2
	Diagonal	Não	0
		Irregular/desajeitado	1
		Normal	2
Colocação de contato		Não	0
(0-1)		Sim	1
Grid andando	Passos de miss	>15	0
(0-3)		≤15	1
		≤10	2
		≤5	3
Total CBS-HX
(0-18)

Tabela 1: Os escores de comportamento combinados para hemiseção (CBS-HX)

Discussão

Neste estudo, relatamos procedimentos passo a passo para produzir um HX espinhal T9 simples, consistente e reprodutível em ratos adultos que imita a Síndrome Brown-Séquard em humanos. Introduzimos ainda um sistema combinado de pontuação de comportamento para hemiseção (CBS-HX) que é sensível para avaliar o comprometimento neurológico assimétrico e a progressão da recuperação, medido por uma combinação de pisada de membro traseiro unilateral (SUS), acoplamento (CPL), colocando contato, e grid andando. Embora demonstremos a lesão no nível T9, este procedimento pode ser aplicado a outras regiões da medula espinhal, incluindo as medulas cervical e lombar de forma simples e pouco exigente. Esperamos que este modelo, juntamente com avaliações comportamentais unilateralizadas, seja útil para examinar mecanismos de lesão e eficácias terapêuticas para esses tipos de SCI.

Como o modelo lateral hx só lesiona a metade ipsilateral do cordão, o lado contralateral do cordão é amplamente preservado e pode ser usado como um controle interno. Muitas vias descendentes e ascendentes são projetadas unilateralmente e uma hemiseseção lateral em muitas circunstâncias produz danos a um trato axonal de um lado e preserva o mesmo trato no lado oposto, permitindo a comparação da reorganização e consequências funcionais desses setores no mesmo animal. Além disso, produzir uma lesão mais localizada pode permitir o direcionamento de vias específicas. Por exemplo, uma lesão ventral e ventrolateral pode afetar as vias reticulospinal e vestibulosspinal. Uma lesão dorsal ou dorsolateral pode afetar as vias corticoespinhal e rubro-negra. O modelo de hemiseção ou lesão parcial também pode ser usado para estudar a anatomia e a função de outras vias, como as vias propriopsídias, noradrenergic as sorotonergicas. Assim, o modelo de hemiseção pode ser utilizado exclusivamente para estudar a compensação por aferentes sensoriais, por vias descendentes e por circuitos intrínsecos da coluna vertebral. Este modelo também é adequado para investigar mecanismos de recuperação de locomotor após HX.

O HX lateral leva a prejuízos comportamentais óbvios, que são avaliados tarefas motoras (por exemplo, Treadscan ou Esteira) paradigma para a análise automatizada da marcha ¹⁹. Além disso, a condutividade dos tratos axonais do lado contralateral da lesão poderia ser medida por meio de registros eletrofisiológicos, e esta avaliação proporciona a possibilidade de estabelecer uma reorganização funcional após vários tratamentos. Além disso, injeções unilaterais dos rastreadores anatômicos em neurônios de uma via específica permitem a visualização de fibras de cruzamento de linha média anterogradamente rotuladas e sua conexão com neurônios retrógrados^{20,21,22,,23,24,25}.

Embora uma cirurgia típica de HX espinhal leve menos de 20 minutos para terminar, requer alguma prática para conseguir um HX preciso e consistente. Em primeiro lugar, é importante que o nível de HX espinhal seja consistente de animal para animal. Portanto, é fundamental que se identifique o segmento vertebral adequado para laminectomia. Em segundo lugar, certifique-se de que o HX está completo. Para fazer um HX completo, pode-se usar uma agulha de calibre 30 inserida verticalmente através da linha média para orientar o corte usando microtesouras. A inserção da agulha também evita danos aos vasos posteriores da coluna vertebral ou à medula sobre lesões. A segunda função da agulha de calibre 30 é que ela pode servir como uma faca para rastrear o corte para se certificar de que não há ambiguidade da lesão. Em terceiro lugar, colocar gelatina no local da lesão pode minimizar o vazamento do fluido cefalorraquidiano, e colocar o cimento em cima da gelatina e fazer a ponte da lâmina vertebral pode fortalecer a estabilidade das vértebras espinhais no local da lesão e facilitar a cicatrização da ferida. Para evitar a interferência do sinal com a aplicação de gravações eletrofisiológicas, músculos, fáscia e pele devem ser suturados em camadas com fio de seda 4-0. Finalmente, todos os esforços devem ser feitos para minimizar os danos à medula espinhal contralateral. A verificação histológica deve ser estabelecida para confirmar uma hemiseção lateral completa de um lado e a preservação da outra metade do cordão do outro lado (conforme mostrado na Figura 6E).

Para melhorar a locomoção após o SCI, estudos anteriores utilizaram uma ampla gama de estratégias, incluindo transplante celular, regeneração de axônto8, ^{8,18,,26,,27,}e reabilitação baseada em ^{atividade28,,29,30}. Enquanto isso, vários testes comportamentais foram estabelecidos para avaliação funcional e para triagem para os melhores tratamentos após o SCI. A escala de classificação do bbb locomotor foi projetada para avaliação locomotor de lesões simétricas espinhais, como contusão na linha média ou lesões de transsecção que afetam os membros traseiros bilaterais ^14,31. Certos parâmetros do BBB, como coordenação e desobstrução dos dedos, são registrados pela observação de ambos os membros traseiros. Se um membro traseiro estiver intacto e o outro mostrar déficits como visto em lesões assimétricas, então o membro traseiro intacto confundirá a pontuação do membro traseiro afetado. Uma vez que a pontuação do BBB não acomoda a pontuação de um membro traseiro do outro após a lesão unilateral, não é ideal para avaliar lesões unilaterais da medula espinhal. No entanto, se o movimento articular e o suporte de peso de cada lado forem avaliados separadamente e não forem calculados como parte do BBB, então o membro traseiro intacto (semelhante a um controle falso) não confundirá a pontuação do membro traseiro afetado. Além disso, o lado intacto não distorcerá a pontuação geral do animal, pois o membro traseiro intacto não tem déficits dramáticos no movimento articular, suporte de peso ou pisada.

O escore de comportamento combinado para hemiseção foi projetado para ser uma avaliação sensível e facilmente realizada da recuperação comportamental no modelo de rato da hemiseção lateral. Pode ser usado para avaliar comportamentos de fases iniciais e tardias de recuperação. A fase inicial é dentro de 7-10 dias após a lesão. Nos primeiros 3-5 dias pós-HX, a atividade do membro traseiro ipsilateral aumentou de forma constante e deve ser avaliada com mais freqüência para registrar recuperações espontâneas ou mediadas pelo tratamento do movimento do membro traseiro. Em 5-7 dias após o HX, os ratos começaram a fazer movimentos de membros traseiros sem suporte de peso. Em 7-10 dias, os ratos normalmente começaram a ficar em pé e pisar. Durante esta fase, deve-se prestar atenção ao padrão de passo. Na fase final (14-28 dias), a atividade do membro traseiro ipsilateral foi estável e próxima ao normal.

Deve-se também prestar muita atenção à capacidade de acoplamento (CPL). O teste CPL (acoplamento de marcha) pode ser realizado com um vídeo (por exemplo, Treadscan/Catwalk) ou um vídeo de filmagem durante um teste de campo aberto. A segunda opção oferece flexibilidade se os pesquisadores não tiverem acesso ao sistema de análise de marcha. Para ambas as sessões de gravação de vídeo, é necessário um mínimo de dois touchdowns consecutivos para cada pé para este teste. Para a análise, há três parâmetros de acoplamento: acoplamento homólogo, homólogo e diagonal (etapa 6.2). Cada acoplamento envolve um pé de referência e o pé dado. Tome o acoplamento homólogo (frente esquerda direita, ou traseira esquerda-traseira direita) por exemplo, é o primeiro tempo de touchdown do pé dado dividido por um tempo de passo inteiro do pé de referência. Uma vez que o pé esquerdo e direito deve estar fora de fase, o acoplamento perfeito deve ser 0,5. Este é o mesmo caso no acoplamento homolateral (traseiro dianteiro esquerdo ou traseiro dianteiro direito). No entanto, para o acoplamento diagonal (traseiro dianteiro esquerdo-direito, ou traseiro dianteiro direito-esquerdo), o acoplamento perfeito deve ser 0 ou 1, uma vez que os dois pés devem estar em fase. Na etapa 6.4, atribuímos uma pontuação para cada CPL de 0 a 2. Em detalhes, um placar 0 deve representar o pé dado é incapaz de se mover para concluir um touchdown, portanto, nenhum CPL; uma pontuação 1 representa qualquer CPL irregular ou desajeitado, uma vez que o pé dado termina um touchdown, mas não no acoplamento perfeito; uma pontuação 2 significa um acoplamento perfeito de 0,5. Os três conceitos de parâmetro de acoplamento estão bem descritos nas publicações anteriores^32,33. O CPL pode ser combinado com as avaliações de colocação de contato e caminhada de grade. Os componentes individuais do sistema combinado de pontuação de comportamento serão mais ou menos eficazes em diferentes modelos de ratos de SCI. Para a CPL, os déficits tornaram-se obviamente visíveis na taxa de alternância e na completitude da sequência. Os déficits proprioceptivos de colocação de membros traseiros poderiam ser claramente revelados após o HX unilateral. Em nosso estudo, todos os ratos apresentaram déficits de membros traseiros ipsilesionais, enquanto a colocação do membro traseiro contralateral não apresentou déficits. O teste de caminhada da grade deve ser considerado quando a colocação de contato, que envolve o trato corticoespinhal, começa a se recuperar. Para descartar possíveis problemas de fadiga, a seqüência de testes comportamentais pode ser aleatória em cada teste.

Em conclusão, relatamos procedimentos passo a passo para criar um modelo de rato in vivo reprodutível do HX espinhal T9 que imita a Síndrome Brown-Séquard em humanos. O sistema combinado de pontuação de comportamento para hemiseção oferece uma medida mais discriminativa dos desfechos comportamentais individuais dos membros traseiros para avaliar mecanismos e tratamentos de lesões após um SCI unilateral. Embora forneçamos apenas uma descrição visual dos procedimentos cirúrgicos e avaliações comportamentais de um HX torácico, os métodos descritos aqui podem ser aplicados a outros SCIs incompletos em diferentes níveis de lesão.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Baby-Mixter Hemostat	FST	13013-14	Can be any brand of choice
Elevated plastic coated wire mesh grid	Any		36×38 cm with 3 cm2 openings
Gel foam	Moore Medical	2928	Can be any brand of choice.
Grip cement kit, powder and solvent	Dentsply	675570	Can be any brand of choice.
Microbead Sterilizer	FST	NA	Can be any brand of choice
Pearson Rongeur	FST	16015-17	Can be any brand of choice.
Retractors	Jinxie surgical tools	6810	Can be any brand of choice
Scalpel Handle	FST	10003-12	Can be any brand of choice
Simplex-P cement	Stryker		Can be any brand of choice.
TreadScan automatic gait analysis	CleverSys Inc	NA	Can be any brand of choice