JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, yeni eski-ovo deneyleri ve morfogenetik mekaniği erken piliç embriyonik beyin burulma sırasında çalışmak için fiziksel modelleme yaklaşımlar bir dizi tanıtımı iletişim kuralı mevcut.

Özet

Embriyonik geliştirme geleneksel biyomoleküler genetik açıdan okudu ama morfogenez mekaniğinin temel önem giderek tanınır hale. Özellikle, onlar geliştirdikçe hangi ciddi morfolojik değişiklikler geçmesi, embriyonik piliç kalp ve beyin Tüp, rol morfogenez fiziksel güçlerinin çalışmaya başbakan adayları arasında yer. İlerici ventral bükme ve borulu embriyonik piliç beyin rightward burulma organ düzeyinde sağa ve sola asimetri piliç embriyonik geliştirme erken aşamada olur. Vitelline membran (VM) embriyonun dorsal tarafında sınırlar ve burulma gelişmekte olan beyin ikna etmek gerekli gücü sağlayan karıştığı olmuştur. Burada bir arada yeni eski-ovo deneyler ve fiziksel beyin burulma mekaniği tanımlamak için modelleme mevcut. Hamburger-Hamilton aşamada 11, embriyo hasat ve kültürlü ex ovo (medya). VM çekti kılcal tüp kullanarak daha sonra kaldırılır. Sıvı düzeyini denetleyerek ve embriyo sıvı-AIR arabirimiyle tutulmasi, medya sıvı yüzey gerilimi VM mekanik rolünü değiştirmek için kullanılabilir. Mikrocerrahi deneyler de sonuç değişiklik beyin burulma sembolik bulmak için kalp konumunu değiştirmek için yapıldı. Bu iletişim kuralı sonuçlarından morfogenez sürüş mekaniğinin temel rolleri gösterilmektedir.

Giriş

Modern gelişim Biyolojisi Araştırma büyük ölçüde anlayış geliştirme açısından moleküler genetik1,2,3,4,5,6 üzerinde duruluyor. , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. fiziksel olaylar morfogenez içinde merkezi bir rol oynamak veya14,15,16,17; biyolojik nesil formu bilinen Ancak, geliştirme belirli mekanik mekanizmaları büyük ölçüde doğaçlama kalır. Ventral bükülme ve sonra Hamburger-Hamilton sahne 11 (HH 11)18 embriyonik şekle katkıda iki ana süreç ilkel beyin tüp rightward burulma19,20değiştirin. Özellikle, embriyonik beyin burulma geliştirmede temel fiziksel mekanizma tam olarak anlaşılır kalır.

Civciv embriyo embriyonik burulma-sol (sol-sağ) asimetri gelişiminde en erken morfogenetik olayları arasında yer alıyor. L-R asimetri sürecinin tedirgin, Doğum kusurları kalbin inversus, isomerismveya heterotaxia gibi21ortaya çıkar.
Burada mekanik Kuvvetleri erken embriyonik beyin gelişimi sırasında karakterize için fiziksel modelleme ile ex ovo deneyler22,23 birleştiren bir iletişim kuralı mevcut. Mekanik Kuvvetleri sorumlu beyin burulma ve burulma derecesini erken geliştirme12sırasında etkileyen faktörleri belirlemek için sunulan Yöntem hedefidir. Vitelline membran (VM) embriyonun dorsal tarafında sınırlar deneysel gözlem dayalı, VM burulma gelişmekte olan beyin ikna etmek gerekli gücü sağlar olan. Bu nedenle, bu yöntemde beyin burulma üzerindeki etkilerini öğrenmek için beyin alan kaplayan VM parçası çıkardık. Ayrıca, sıvı yüzey gerilimi uygulama Yöntem VM mekanik rolü onaylamak ve daha önce yapılmamıştır beyin burulma için gerekli gücü'nün bir tahmin sağlamak için kullanılmıştır. Güçleri sırasında embriyonik morfogenez ölçme bir iştir. Özellikle, öncü bir çalışmada, Campàs ve iş24 enjekte microdroplets kullanarak hücresel stresleri ölçmek için yeni bir yöntem geliştirdi. Yine de, bu yöntem kuvvetleri hücresel düzeyde kuvvetleri, doku veya organizma düzeyinde soruşturma için bu nedenle uygulanamaz ölçmek için sınırlıydı. Bu raporda sunulan Protokolü kısmen bu boşluğu doldurmak için geliştirilmiştir.

Protokol

1. doku kültürü medya hazırlanması

  1. 0,5 L şişe Dulbecco'nın modifiye kartal Orta (DMEM) 4,5 g/M glikoz, sodyum bikarbonat ve L-glutamin ile kültür ortamı için temel olarak kullanın.
  2. Bir steril laminar akış başlık, antibiyotikler 10 mL DMEM 0.5 litre için ekleyin.
  3. Steril bir pipet kullanarak, DMEM antibiyotik çözüm 50 mL steril 50 mL konik tüp aktarın.
  4. Piliç serum 50 mL steril başlıklı 0,5 L şişede kalan DMEM antibiyotik çözüm ekleyin.
  5. Nihai çözüm (ahiret için piliç kültür ortamı [CCM] olarak 50 mL konik tüp aliquots-20 ° C'de olarak adlandırılır) saklamak

2. yumurta kuluçka

  1. Kullanım hassas döllenmiş belirli patojen ücretsiz beyaz Livorno tavuk yumurtası temizlemek için % 70 etanol ile siliyor. Yumurta sahipleri üzerinde boyuna yönlendirme düzenleyin.
  2. Bir hedef sıcaklık 37,5 ° C ayarlayın ve 48-%55 nem korumak için bir kuluçka açın. Nem oranı da kuluçka için uygun bir miktar su ekleyerek kontrol edilir.
  3. HH11-13 olarak yaklaşık 40-44 h yumurtaları kuluçkaya.
  4. İzin için püskürtme/Temizleme % 70 etanol ile önce yaklaşık 15-30 dakika oda sıcaklığında yumurta sakin olun.

3. çekme cam kılcal

  1. 1.0 mm bir dış çapı ve 0,5 mm bir iç çapı 10 cm uzunluğundaki cam kılcal tüpler bir micropipette çektirmenin bağlayın.
  2. Isı ayarlama ve parametreleri 750 ve 400, sırasıyla çekin. İnce iğneler kapiller boruyu için çekme düğmesine basın.

4. filtre kağıdı taşıyıcı yöntemi

  1. Daireler yaklaşık 3 cm çapında filtre kağıdı kesti.
  2. Bir dikdörtgen kabaca bir delik zımba kullanarak Daire 2 cm x 1 cm kesti. Herhangi bir çıkıntılı kaldırmak veya keskin köşeler emin olun.

5. embriyo hasat ve hazırlık

  1. Alt yumurta çatlamak, kabuk yavaşça ayır ve dikkatle içeriği 150 mm x 15 mm petri kabına mevduat. Embriyo yan doldu önlemek için aynı yönde onları çatlama süre inkübe yumurta getirin.
  2. Bir tek kullanımlık Pasteur pipet kullanarak ince albümin kaldırın.
  3. Kalın albümin künt uçlu forseps kullanarak sarısı ayırın. Kalın albümin sarısının üstündeki künt uçlu forseps ile hafifçe kazıma kaldırıldığından emin olmak.
  4. İnce uçlu forseps ortalamak ve filtre kağıdı yüzük Yüzük uzun ekseni embriyo uzun ekseni ile eşleşen embriyo üzerinde yer için kullanın.
  5. Filtre kağıdı halka makasla çevreleyen sarısı kesti.
  6. Yüzük ve embriyo sarısı kapalı nerede sarısını ilk kesildi sitesi yönelik eğik bir yönde çekin.
  7. İki sıralı 100-mm yemeklerinde oda sıcaklığında 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x ile embriyo durulayın.
  8. Bir filtre kağıdı halka ilk 35-mm petri kabına yerleştirin. Sonra embriyo dorsal tarafta filtre kağıdı zaten 35-mm kabında yerleştirin.
  9. Paslanmaz Çelik Yüzük filtre kağıdı sandviç üstüne yerleştirin. Embriyo zarar vermeyeceğine emin olun.
  10. Önceden hazırlanmış CCM 3 mL her petri kabına ekleyin.
  11. Her embriyo VM hafifçe çekti kapiller iğne embriyo ve VM uzak soyulması, (ön) üzerinde doğru anterior sonundan başlayarak ve ilerleme-e doğru (Şekil 1A) notochord üstte kaymağını tarafından kaldırın.
  12. Sekiz 35-mm Petri yemekler (nem korumak için) doymuş su hassas görev mendil ile kaplı bir 150 mm çanak içine yerleştirin.
  13. Yere yapışmalı Plastik torba 150 mm petri kabına sonra % 95'i O2 ve %5 CO2oluşan bir gaz karışımı ile çantayı doldurun.
  14. Çantayı mühür ve 37,5 ° C kuluçka makinesine koyun.
  15. Bir ek 27 h için embriyo HH15-HH16 kadar (Şekil 1B) kuluçkaya.

6. inducing yüzey gerilimi

  1. Embriyolar inkübatör kaldırmak ve onları görüntü için bir optik koherens tomografi (OCT) sistemi kullanın. Nöral tüp (NT) (Şekil 2) burulma açısı belirlemek için kullanım Ekim
  2. Işık mikroskop için embriyo transfer ve 10 X büyütme oranında görselleştirin. 200 microliter pipet artımlı olarak medya 0.2 mL petri kabına kaldırmak için kullanın.
  3. Embriyo medya-AIR arabirimiyle etkilerini gözlemlemek için her aralıkta aydınlık alan görüntü alabilir.
  4. Torsiyon (Şekil 1 c) embriyo üzerinde yüzey gerilimi indükler kadar medyayı çıkarın.
  5. OCT sistemi bir kez daha embriyo denetlemek karşılaştırma için son bir burulma açısı kurmak için kullanılarak embriyo görüntü.  Not: Diseksiyon mikroskop kullanarak parlak-alan görüntüleri elde. Ekli bir mikroskop ile bir optik koherens tomografi sistemi kesitsel görüntü yığınları canlı embriyo elde etmek için kullanılmıştır. Görüntüleri 3 x 10 mm x 3 mm3 tarama etki alanında elde sonra bir düşsel bilgisayar yazılımı içinde işlenen edildi. Son olarak, fiziksel model görüntüleri ile bir dijital tek objektifli refleks fotoğraf makinesi alındı.

7. yüzey gerilimi/VM güçlerinin fiziksel modelleme

  1. HH14-17'ticari modelleme yazılımı (Şekil 3A) arasında bir embriyo benzer basitleştirilmiş bir 3D geometri geliştirmek.
  2. Ticari 3D bilgisayar grafik yazılımı 3D geometri negatif kalıp tasarım.
  3. 1,75 mm Akrilonitril bütadien stiren filaman 3D 3D yazıcı yüklü kullanım stereolithographic (.stl) biçiminde tasarlanmış kalıp yazdırın.
  4. Kalıp döküm için silikon kauçuk elastomer bileşenleri A ve B eşit parçaya karışımı ve derhal karışımı kalıp içine dökün; 12 h (Şekil 3B) için oda sıcaklığında tedavi için döküm kalıp ayarlayın.
  5. Embriyo burulma görselleştirmek için NT sırt tarafında boyunca fiziksel model işaretleyin.
  6. Bir coverslip hangi VM veya yüzey gerilimi (şekil 3D) taklit eden 3D fiziksel modeli uygulanan kuvvet çoğaltmak için kullanın.
  7. Sert kablo fiziksel model tarafa eşit uzunlukta bir dizi ekleyin. Sonra coverslip bir dış kuvvet beyin modeli uygular, teller yere bağlıdır bir açıyla eğik haline. Dönme açısı tarafından öngörülen uzunlukta arctan her tel (Şekil 3E) orijinal uzunluğu belirler.

8. kalp döngü yönünü değiştirme

  1. 3.1 ve 3.2 çekti bir kılcal tüp elde etmek için bölümündeki adımları izleyin.
  2. 5.1 aracılığıyla 5.10 embriyo hazırlamak için adımları izleyin.
  3. Forseps bir çift filtre kağıt embriyo ventral-yan-up haline çevirmek için kullanın.
  4. Çekti kılcal tüp bir yarık splanchnopleure (SPL) membran açık kesmek için kullanın.
  5. Kılcal tüp kalbin sağ taraftan sol tarafına itmek için mekanik bir kuvvet uygulamak için kullanın.
  6. 5.12 burulma değişikliği gözlemlemek için 5,15 aracılığıyla adımları izleyin.

Sonuçlar

Bu çalışmada, HH11, embriyo VM ön taraftan torasik kivrimi kaldırıldı. Embriyo tarafından OCT sistem görüntüsü. Bu aşamada beyin tüp torsiyon (Şekil 1A) başlamamıştır. HH15-16 için inkübe sonra embriyo kaldırıldı onların VM ile düşük beyin tüp torsiyon, yaklaşık 35 yaklaşık 90 derece torsiyon gösteren embriyolar denetlemek için karşılaştırıldığında derece (Şekil 1B) sergiledi. Yüzey ge...

Tartışmalar

Fiziksel olaylar morfogenez26,27,28,29,30, belirli mekanik mekanizmaları, mekanik koordinasyonu ile birlikte önemli bir rol oynarken ve moleküler mekanizmalar, büyük ölçüde keşfedilmemiş kalır. Ventral bükülme ve ilkel beyin rightward burulma erken embriyonik morfogenez18,31,

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Teşekkürler

Z.C. destek Dartmouth başlangıç Fonu ve Branco Weiss - Derneği Bilim Kardeşliği, ETH Zürih tarafından yönetilen için kabul eder. Yazarlar Drs. Larry A. Taber, Benjamen A. Filas, Qiaohang Guo ve Yunfei Shi yararlı tartışmalar için yanı sıra adsız yorumcular Yorumlar için teşekkür ederim. Bu malzeme Ulusal Bilim Vakfı Yüksek Lisans Araştırma Bursu Grant No altında tarafından desteklenen çalışma üzerine kuruludur DGE-1313911. Herhangi bir görüş, bulgular ve sonuç ya da öneriler bu malzeme ifade yazarlar (s) ve mutlaka Ulusal Bilim Vakfı görüşlerini yansıtmamaktadır.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Fertilized Specific pathogen-free White Leghorn chicken eggsCharles River
Optical Coherent Tomography MicroscopeThorlabsGAN220C1
Silicone elastomerSmooth-On, Inc.EcoFlex 00-50
Dissecting microscopeLeicaMZ8
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Lonza12-604F
AntibioticsSigmaP4083
Chick serumSigmaC5405
Micropipette pullerSutter InstrumentModel P-30
Filter paperWhatman5202-110
Phosphate buffered saline (PBS)Corning21-040-CV
Comsol MultiPhysicsComsol
3D computer graphics softwareRhino 5
Microscope attached with OCTNikon FN1
Digital single-lens reflex cameraEOS Rebel T3i

Referanslar

  1. Taber, L. A. Biomechanics of Growth, Remodeling, and Morphogenesis. Appl. Mech. Rev. 48, 487-545 (1995).
  2. Wyczalkowski, M. A., Chen, Z., Filas, B. A., Varner, V. D., Taber, L. A. Computational models for mechanics of morphogenesis. Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 96, 132-152 (2012).
  3. Savin, T., et al. On the growth and form of the gut. Nature. 476, 57-62 (2011).
  4. Gjorevski, N., Nelson, C. M. The mechanics of development: Models and methods for tissue morphogenesis. Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 90, 193-202 (2010).
  5. Shyer, A. E., et al. Villification: how the gut gets its villi. Science. 342, 212-218 (2013).
  6. Ambrosi, D., et al. Perspectives on biological growth and remodeling. Journal of the Mechanics and Physics of Solids. 59, 863-883 (2011).
  7. Chen, Z., Majidi, C., Srolovitz, D. J., Haataja, M. Tunable helical ribbons. Appl. Phys. Lett. 98, (2011).
  8. Gerbode, S. J., Puzey, J. R., McCormick, A. G., Mahadevan, L. How the cucumber tendril coils and overwinds. Science. 337, 1087-1091 (2012).
  9. Armon, S., Efrati, E., Kupferman, R., Sharon, E. Geometry and mechanics in the opening of chiral seed pods. Science. 333, 1726-1730 (2011).
  10. Filas, B. A., et al. A potential role for differential contractility in early brain development and evolution. Biomech. Model. Mechanobiol. 11, 1251-1262 (2012).
  11. Xu, G., et al. Axons pull on the brain, but tension does not drive cortical folding. J. Biomech. Eng. 132, 71013 (2010).
  12. Chen, Z., Guo, Q., Dai, E., Forsch, N., Taber, L. A. How the embryonic chick brain twists. J. R. Soc. Interface. 13, (2016).
  13. Manca, A., et al. Nerve growth factor regulates axial rotation during early stages of chick embryo development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 2009-2014 (2012).
  14. Shi, Y., Yao, J., Xu, G., Taber, L. a. Bending of the looping heart: differential growth revisited. J. Biomech. Eng. 136, 1-15 (2014).
  15. Shi, Y., et al. Bending and twisting the embryonic heart: A computational model for c-looping based on realistic geometry. Front. Physiol. 5, (2014).
  16. Taber, L. A. Morphomechanics: Transforming tubes into organs. Current Opinion in Genetics and Development. 27, 7-13 (2014).
  17. Hosseini, H. S., Beebe, D. C., Taber, L. A. Mechanical effects of the surface ectoderm on optic vesicle morphogenesis in the chick embryo. J. Biomech. 47, 3837-3846 (2014).
  18. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev. Dyn. 88, 49-92 (1951).
  19. Shi, Y., Varner, V. D., Taber, L. a. Why is cytoskeletal contraction required for cardiac fusion before but not after looping begins?. Phys. Biol. 12, 16012 (2015).
  20. Garcia, K. E., Okamoto, R. J., Bayly, P. V., Taber, L. A. Contraction and stress-dependent growth shape the forebrain of the early chicken embryo. J. Mech. Behav. Biomed. Mater. 65, 383-397 (2017).
  21. Faisst, A. M., Alvarez-Bolado, G., Treichel, D., Gruss, P. Rotatin is a novel gene required for axial rotation and left-right specification in mouse embryos. Mech. Dev. 113, 15-28 (2002).
  22. Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. a., Butcher, J. T. An ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications. J. Vis. Exp. (44), (2010).
  23. Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier. Dev. Dyn. 220, 284-289 (2001).
  24. Campàs, O., et al. Quantifying cell-generated mechanical forces within living embryonic tissues. Nat. Methods. 11, 183-189 (2014).
  25. Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux's Arch. Dev. Biol. 202, 10-16 (1992).
  26. Chuai, M., Weijer, C. J. The Mechanisms Underlying Primitive Streak Formation in the Chick Embryo. Current Topics in Developmental Biology. 81, 135-156 (2008).
  27. Voronov, D. A., Alford, P. W., Xu, G., Taber, L. A. The role of mechanical forces in dextral rotation during cardiac looping in the chick embryo. Dev. Biol. 272, 339-350 (2004).
  28. Raya, A., Izpisua Belmonte, J. C. Unveiling the establishment of left-right asymmetry in the chick embryo. Mechanisms of Development. 121, 1043-1054 (2004).
  29. Voronov, D. A., Taber, L. A. Cardiac looping in experimental conditions: Effects of extraembryonic forces. Dev. Dyn. 224, 413-421 (2002).
  30. Chen, Z., Huang, G., Trase, I., Han, X., Mei, Y. Mechanical Self-Assembly of a Strain-Engineered Flexible Layer: Wrinkling, Rolling, and Twisting. Phys. Rev. Appl. 5, (2016).
  31. Manner, J., Seidl, W., Steding, G. Formation of the cervical flexure: an experimental study on chick embryos. Acta Anat. (Basel). 152, 1-10 (1995).
  32. Ware, M., Schubert, F. R. Development of the early axon scaffold in the rostral brain of the chick embryo. J. Anat. 219, 203-216 (2011).
  33. Ramasubramanian, A., et al. On the role of intrinsic and extrinsic forces in early cardiac S-looping. Dev. Dyn. 242, 801-816 (2013).
  34. Hoyle, C., Brown, N. a., Wolpert, L. Development of left/right handedness in the chick heart. Development. 115, 1071-1078 (1992).
  35. Nerurkar, N. L., Ramasubramanian, A., Taber, L. A. Morphogenetic adaptation of the looping embryonic heart to altered mechanical loads. Dev. Dyn. 235, 1822-1829 (2006).
  36. Levin, M. Left-right asymmetry and the chick embryo. Semin. Cell Dev. Biol. 9, 67-76 (1998).
  37. Roebroek, A. J., et al. Failure of ventral closure and axial rotation in embryos lacking the proprotein convertase Furin. Development. 125, 4863-4876 (1998).
  38. Peebles, D. M., et al. Magnetic resonance proton spectroscopy and diffusion weighted imaging of chick embryo brain in ovo. Dev. Brain Res. 141, 101-107 (2003).
  39. Zhu, L., et al. Cerberus regulates left-right asymmetry of the embryonic head and heart. Curr. Biol. 9, 931-938 (1999).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendisliksay 136biyomekanikembriyonik morfogenezsol sa asimetriburulmaeksenel d nmegeli tirmecivciv embriyo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır