I ruoli di forze fisiche in anticipo pulcino morfogenesi embrionale di sondaggio

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo introducendo una serie di nuovi esperimenti di ex-ovo e approcci di modellazione fisica per studiare la meccanica della morfogenesi durante primi torsione cervello embrionale di pulcino.

Abstract

Lo sviluppo embrionale è tradizionalmente studiato dal punto di vista della genetica biomolecolare, ma l'importanza fondamentale della meccanica nella morfogenesi è sempre più riconosciuta. In particolare, il tubo embrionale del pulcino cuore e cervello, che subiscono drastici cambiamenti morfologici come si sviluppano, sono tra i principali candidati per studiare il ruolo delle forze fisiche nella morfogenesi. Progressiva flessione ventrale e torsione verso destra del cervello embrionale tubolare pulcino accadere alle primissime fasi dell'organo-livello sinistra-destra asimmetria nello sviluppo embrionale del pulcino. La membrana vitellina (VM) vincola la parte dorsale dell'embrione ed è stata implicata nel fornire la forza necessaria per indurre torsione di sviluppo del cervello. Qui presentiamo una combinazione di nuovo ex-ovo esperimenti e modelli per identificare i meccanismi di torsione cervello fisici. In fase di Hamburger-Hamilton 11, gli embrioni vengono raccolte e coltivati ex ovo (Media). La macchina virtuale viene successivamente rimosso utilizzando un tubo capillare tirato. Controllando il livello del fluido e sottoporre l'embrione a un'interfaccia liquido-aria, la tensione superficiale liquido dei media può essere utilizzata per sostituire il ruolo meccanico della macchina virtuale. Microchirurgia esperimenti sono stati eseguiti anche per modificare la posizione del cuore per trovare il conseguente cambiamento nella chiralità di torsione cervello. Risultati da questo protocollo illustrano i ruoli fondamentali della meccanica nella morfogenesi di guida.

Introduzione

Ricerca moderna biologia inerente allo sviluppo in gran parte si concentra sullo sviluppo di comprensione dal punto di vista di genetica molecolare^{1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. è noto che fenomeni fisici svolgono un ruolo centrale nella morfogenesi, oppure la generazione di biologico forma^14,15,16,17; Tuttavia, specifici meccanismi meccanici di sviluppo rimangono in gran parte. Ventrale flessione e torsione verso destra del tubo primitivo cervello dopo Hamburger-Hamilton fase 11 (HH 11)¹⁸ sono i due principali processi che contribuiscono alla forma embrionale cambio^19,20. In particolare, il meccanismo fisico alla base dello sviluppo torsionale nel cervello embrionale rimane in modo incompleto capito.

La torsione embrionale in embrione di pollo è tra i primi eventi morfogenetici di sinistra-destra (L-R) asimmetria in sviluppo. Quando il processo di asimmetria L-R viene perturbato, difetti di nascita come situs inversus, isomeriao eterotassia verificherಹ.
Qui presentiamo un protocollo che unisce ex-ovo esperimenti^22,23 con modellazione fisica per caratterizzare le forze meccaniche durante lo sviluppo iniziale del cervello embrionale. L'obiettivo del metodo presentato è quello di identificare le forze meccaniche responsabile torsione cervello e i fattori che influenzano il grado di torsione durante lo sviluppo iniziali¹². Basato sull'osservazione sperimentale che la membrana vitellina (VM) vincola la parte dorsale dell'embrione, abbiamo supposto che la VM fornisce la forza necessaria per indurre torsione di sviluppo del cervello. Pertanto, in questo metodo, abbiamo rimosso la parte di VM che copre l'area del cervello per scoprire gli effetti sulla torsione cervello. Inoltre, il metodo di applicazione fluido tensione superficiale è stato utilizzato per confermare il ruolo meccanico della macchina virtuale e fornire una stima della forza necessaria per torsione del cervello, che non era stato fatto in precedenza. Misurare le forze durante la morfogenesi embrionale è un compito impegnativo. In particolare, in uno studio pionieristico, Campàs e collaboratori²⁴ ha sviluppato un nuovo metodo per quantificare lo stress cellulare utilizzando microgocce iniettato. Tuttavia, questo metodo è stato limitato alla misurazione di forze a livello cellulare, quindi non applicabile per sondare le forze a livello del tessuto o organismo. Il protocollo presentato in questo documento è stato sviluppato per parzialmente colmare questa lacuna.

Protocollo

1. preparazione di terreni di coltura del tessuto

1. Utilizzare una bottiglia da 0,5 L dell'Aquila per volta di Dulbecco Medium (DMEM) con glucosio 4,5 g/L, bicarbonato di sodio e L-glutamina come base per i terreni di coltura.
2. In una cappa a flusso laminare sterile, aggiungere 10 mL di antibiotici al 0,5 l di DMEM.
3. Utilizzando una pipetta sterile, trasferire 50 mL della soluzione di antibiotici DMEM in una provetta conica sterile 50 mL.
4. Aggiungere 50 mL di siero di pulcino per la soluzione di antibiotici DMEM rimanente nella bottiglia 0,5 L nella cappa sterile.
5. Conservare la soluzione finale (denominata di seguito come terreni di coltura pulcino [CCM]) in 50 mL tubo conico aliquote a-20 ° C.

2. l'incubazione delle uova

1. Uso delicato pulisce con etanolo al 70% per pulire specifici esenti da patogeni White Leghorn pollo uova fecondate. Disporre le uova in un orientamento longitudinale sui titolari.
2. Accendere un'incubatrice per impostare una temperatura di 37,5 ° C e mantenere l'umidità al 48-55%. L'umidità è controllata con l'aggiunta di una quantità appropriata di acqua nell'incubatore.
3. Incubare le uova HH11-13 e circa 40-44 h.
4. Lasciare che le uova raffreddare a temperatura ambiente per circa 15-30 min prima della spruzzatura/pulizia con etanolo al 70%.

3. tirare tubi capillari in vetro

1. Montare un 10 tubi capillari di vetro lungo cm con un diametro esterno di 1,0 mm e un diametro interno di 0,5 mm su un estrattore micropipetta.
2. Impostare il calore e tirare i parametri a 750 e 400, rispettivamente. Premere il pulsante di tirare per tirare il tubo capillare in aghi sottili.

4. carta da filtro vettore metodo

1. Tagliare cerchi di circa 3 cm di diametro da carta da filtro.
2. Tagliare un rettangolo di circa 1 cm di 2 cm dal cerchio utilizzando una perforatrice. Assicurarsi di rimuovere qualsiasi sporgenti o spigoli vivi.

5. embrione raccolta e preparazione

1. Rompere le uova dalla parte inferiore, separare il guscio delicatamente e accuratamente depositare contenuto in una capsula Petri 150 x 15 mm. Per assicurarsi che il lato di embrione sia alto, mantenere le uova nello stesso orientamento che essi sono stati incubati mentre li di cracking.
2. Rimuovere l'albumina sottile utilizzando una pipetta Pasteur.
3. Separare l'albumina spessa dal tuorlo usando il forcipe concluso smussato. Garantire che l'albumina di spessa è stato rimosso da raschiare leggermente la parte superiore del tuorlo con il forcipe smussato si è conclusa.
4. Utilizzare pinze a punta fine per centrare e posizionare un anello di carta da filtro sopra l'embrione, corrispondente all'asse lungo dell'anello con l'asse lungo dell'embrione.
5. Tagliare il tuorlo che circonda l'anello di carta da filtro con le forbici.
6. Tirare l'anello e l'embrione fuori il tuorlo in una direzione obliqua verso il sito dove il tuorlo in primo luogo è stato tagliato.
7. Sciacquare gli embrioni in due piatti sequenziale di 100 mm con temperatura ambiente 1 x tamponato fosfato salino (PBS).
8. Inserire un anello di carta da filtro in una capsula Petri 35mm prima. Quindi posizionare il lato dorsale dell'embrione fino sulla carta da filtro già in 35mm di Petri.
9. Inserire un anello di acciaio sopra il panino di carta da filtro. Assicurarsi di non danneggiare l'embrione.
10. Aggiungere 3 mL di CCM precedentemente preparato per ogni scatola di Petri.
11. Rimuovere la macchina virtuale di ogni embrione scremando leggermente l'ago capillare tirato attraverso la parte superiore dell'embrione e peeling la VM di distanza, a partire dall'estremità anteriore (proprio sopra il proencefalo) e procedere alla notocorda (Figura 1A).
12. Inserire otto 35mm di Petri in un piatto di 150 mm che è stato rivestito con salviettine delicato compito saturata d'acqua (per mantenere umidità).
13. Posto di Petri 150mm in un sacchetto di plastica sigillabile quindi riempire la borsa con una miscela di gas composta da 95% O₂ e 5% CO₂.
14. Sigillare il sacchetto e metterlo in un'incubatrice di 37,5 ° C.
15. Incubare gli embrioni per un ulteriore 27 h fino a HH15-HH16 (Figura 1B).

6. che induce tensione superficiale

1. Rimuovere gli embrioni dall'incubatrice e utilizzare un sistema di tomografia a coerenza ottica a loro immagine. Uso OCT per determinare l'angolo di torsione del tubo neurale (NT) (Figura 2).
2. Trasferire gli embrioni per un microscopio chiaro e visualizzare a 10 ingrandimenti. Utilizzare una pipetta 200 microlitro per togliere in modo incrementale 0,2 mL di media di Petri.
3. Prendere immagini campo chiaro a ogni intervallo per osservare gli effetti dell'interfaccia multimediale-aria sull'embrione.
4. Rimuovere il supporto fino a quando la tensione superficiale attraverso l'embrione induce torsione (Figura 1).
5. Immagine dell'embrione utilizzando il sistema OCT ancora una volta per stabilire un angolo di torsione finale per il confronto di controllare gli embrioni.  Nota: Le immagini del campo luminoso sono state acquisite utilizzando un microscopio per dissezione. Un sistema di tomografia ottica di coerenza con un microscopio collegato è stato utilizzato per acquisire gli stack di immagine a sezione trasversale degli embrioni dal vivo. Immagini sono stati ottenuti in un dominio di scansione³ 3 x 10 x 3 mm, poi trasformati in un software di imaging. Infine, le immagini del modello fisico sono state scattate con una digital single-lens reflex.

7. physical Modelling delle forze di tensione superficiale/VM

1. Sviluppare una geometria 3D semplificata che assomiglia ad un embrione tra HH14-17 nel software di modellazione commerciale (Figura 3A).
2. La progettazione dello stampo negativo della geometria 3D nel software di grafica computer 3D commerciale.
3. Uso una stampante 3D caricata con filamento di 1,75 mm acrilonitrile-butadiene-stirene a 3D stampare lo stampo progettato, in formato stereolithographic (STL).
4. Per lanciare lo stampo, mescolare componenti di elastomero di silicone gomma A e B in parti uguali e versare la miscela nello stampo prontamente; impostare lo stampo di colata per curare a temperatura ambiente per 12 h (Figura 3B).
5. Contrassegnare il modello fisico dell'embrione lungo il NT dal lato dorsale di visualizzare torsione.
6. Utilizzare un vetrino coprioggetto per replicare la forza applicata al modello fisico 3D che imita quella del VM o tensione superficiale (Figura 3D).
7. Inserire una serie di fili rigidi di lunghezza uguale al lato del modello fisico. Dopo il coprioggetto esercita una forza esterna sul modello del cervello, i fili diventano inclinati di un angolo che dipende dalla posizione. Determinare l'angolo di rotazione di arctan della lunghezza proiettata sopra la lunghezza originale di ogni filo (Figura 3E).

8. alterare la direzione del ciclo cuore

1. Seguire i passaggi in 3.1 e 3.2 per ottenere un tubo capillare tirato.
2. Seguire i passaggi in 5.1 attraverso 5.10 per preparare l'embrione.
3. Utilizzare un paio di pinze per capovolgere la carta da filtro in modo che l'embrione diventa ventrale-side-up.
4. Utilizzare il tubo capillare tirato per tagliare aperto una fessura nella membrana splanchnopleure (SPL).
5. Utilizzare il tubo capillare per esercitare una forza meccanica per spingere il cuore dal lato destro al lato sinistro.
6. Seguire i passaggi in 5.12 attraverso 5.15 per osservare il cambiamento in torsione.

Risultati

In questo studio, la macchina virtuale dell'embrione alle HH11 è stato rimosso dall'estremità anteriore alla flessione toracica. Gli embrioni erano imaged tramite un sistema di OCT. In questa fase, la torsione del tubo del cervello non è avviato (Figura 1A). Dopo essere incubate a HH15-16, embrioni con loro VM rimosso ha esibito riduttrice del cervello tubo torsione, circa 35 gradi (Figura 1B) rispetto per controllare gli embr...

Discussione

Mentre fenomeni fisici giocano un ruolo integrante nella morfogenesi^{26,27,28,29,30}, i meccanismi meccanici specifici, insieme con il coordinamento della meccanica e meccanismi molecolari, rimangono in gran parte inesplorate. È noto che il ventrale flessione e torsione verso destra del cervello primitivo sono due processi centrali che contribuiscono al precoce...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fertilized Specific pathogen-free White Leghorn chicken eggs	Charles River
Optical Coherent Tomography Microscope	Thorlabs	GAN220C1
Silicone elastomer	Smooth-On, Inc.	EcoFlex 00-50
Dissecting microscope	Leica	MZ8
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Lonza	12-604F
Antibiotics	Sigma	P4083
Chick serum	Sigma	C5405
Micropipette puller	Sutter Instrument	Model P-30
Filter paper	Whatman	5202-110
Phosphate buffered saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Comsol MultiPhysics	Comsol
3D computer graphics software	Rhino 5
Microscope attached with OCT	Nikon	FN1
Digital single-lens reflex camera	EOS	Rebel T3i