Die Rollen der physikalischen Kräfte in frühen Küken embryonalen Morphogenese sondieren

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll eine Reihe von neuen Ex-Ovo -Experimente und physical-Modeling-Ansätze für das Studium der Mechanik der Morphogenese während frühen Küken embryonalen Gehirn Torsion.

Zusammenfassung

Embryonalentwicklung ist traditionell aus der Perspektive der biomolekularen Genetik studiert, aber die grundlegende Bedeutung der Mechanik in Morphogenese wird zunehmend anerkannt zu werden. Insbesondere die embryonalen Küken Herz und Hirn-Schlauch, der morphologische Veränderungen unterziehen, wie sie sich entwickeln, gehören zu den Hauptkandidaten zur Untersuchung der Rolle von physikalischen Kräfte in Morphogenese. Progressive ventrale biegen und rechts Torsion des Gehirns rohrförmige embryonale Küken passieren in der frühesten Phase der ORGANEBENE links-rechts-Asymmetrie in Küken Embryonalentwicklung. Die dotterhäutchen Membran (VM) schränkt die dorsale Seite des Embryos und hat dabei die Kraft für das sich entwickelnde Gehirn Torsion unabdingbar in Verbindung gebracht. Hier präsentieren wir Ihnen eine Kombination aus neuen Ex-Ovo -Experimente und physikalische Modellierung, um die Mechanik des Gehirns Torsion zu identifizieren. Hamburger-Hamilton Zeitpunkt 11, Embryonen werden geerntet und kultivierten ex Ovo (in den Medien). Die VM ist anschließend mit einer gezogenen Kapillarrohr entfernt. Durch die Steuerung des Niveau der Flüssigkeit und den Embryo eine Flüssigkeit-Luftschnittstelle zu unterwerfen, kann die Flüssigkeit Oberflächenspannung der Medien, die mechanische Rolle des virtuellen Computers zu ersetzen verwendet werden. Mikrochirurgie Experimente wurden auch durchgeführt, um die Position des Herzens die resultierende Änderung in die Chiralität des Gehirns Torsion zu verändern. Ergebnisse aus diesem Protokoll veranschaulichen die grundlegenden Aufgaben der Mechanik in Morphogenese fahren.

Einleitung

Modernen Entwicklungsbiologie Forschung konzentriert sich weitgehend auf Verständnis Entwicklung aus der Perspektive der Molekulargenetik^{1,2,3,4,5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. es ist bekannt, dass physikalische Phänomene eine zentrale Rolle in der Morphogenese spielen oder die Generation von biologischen^{14,15,16,17 bilden}; spezielle mechanische Mechanismen der Entwicklung bleiben jedoch weitgehend unerforschte. ^19,20ändern ventrale Biegung und rechts Torsion des primitiven Gehirn Rohres nach dem Hamburger-Hamilton Stufe 11 (HH 11)¹⁸ sind die zwei wichtigsten Prozesse, die embryonale Form beitragen. Insbesondere bleibt der physikalische Mechanismus zugrunde liegt die Torsionssteifigkeit Entwicklung im embryonalen Gehirn unvollständig verstanden.

Die embryonale Torsion Küken Embryos gehört zu den frühesten morphogenetischen Ereignissen des Links-Rechts (L-R) Asymmetrie in der Entwicklung. Wenn der Prozess der L-R Asymmetrie gestört ist, treten Geburtsschäden wie Situs Inversus, Isomerieoder Heterotaxie ²¹.
Hier präsentieren wir ein Protokoll verbindet Ex Ovo Experimente^22,23 mit physical-Modeling, mechanische Kräfte während der frühen Entwicklung des embryonalen Gehirns zu charakterisieren. Vorgestellte Methode soll die mechanischen Kräfte verantwortlich für Gehirn Torsion und die Faktoren, die Einfluss auf den Grad der Torsion während der frühen Entwicklung¹²zu identifizieren. Basierend auf den experimentellen Beobachtung, dass die dotterhäutchen Membran (VM) die dorsale Seite des Embryos einschränkt, vermutet wir, dass die VM liefert die Kraft für das sich entwickelnde Gehirn Torsion unabdingbar. Daher bei dieser Methode entfernt wir den Teil des virtuellen Computers, der den Bereich des Gehirns um herauszufinden, die Auswirkungen auf Gehirn Torsion abdeckt. Darüber hinaus wurde die Methode zur Anwendung von flüssigen Oberflächenspannung zur mechanischen Rolle des virtuellen Computers zu bestätigen und eine Schätzung von der Kraftaufwand für Gehirn Torsion, die zuvor nicht getan haben. Messung der Kräfte während der embryonalen Morphogenese ist eine anspruchsvolle Aufgabe. Vor allem in einer bahnbrechenden Studie entwickelt Campàs und Mitarbeiter²⁴ eine neuartige Methode zur Quantifizierung der zellulären betont mit eingespritzten Microdroplets. Dennoch war diese Methode beschränkt sich auf Kräfte auf zellulärer Ebene, daher gilt nicht für Kräfte auf Gewebe oder Organismus-Ebene Sonde messen. Das Protokoll in diesem Papier präsentiert wurde entwickelt, um diese Lücke teilweise zu füllen.

Protokoll

1. Vorbereitung des Gewebes Nährmedien

1. Verwenden Sie eine 0,5 L Flasche von Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) mit 4,5 g/L Glukose, Natriumbicarbonat und L-Glutamin als Basis für die Nährmedien.
2. Fügen Sie in einem sterilen Laminar-Flow-Haube 10 mL von Antibiotika bis 0,5 L von DMEM hinzu
3. Mit einer sterilen Pipette, 50 mL DMEM-Antibiotika-Lösung auf einem sterilen 50 mL konische Rohr übertragen.
4. Die restliche DMEM-Antibiotika-Lösung in der 0,5 L Flasche in der sterilen Haube Küken Serum 50 mL hinzufügen.
5. Speichern Sie die endgültige Lösung (genannt jenseits Küken Nährmedien [CCM]) in 50 mL konische Rohr Aliquote bei-20 ° C.

2. Ei Ausbrüten

1. Verwendung zarte wischt mit 70 % Ethanol befruchteten bestimmten Pathogen-freies weiße Leghorn Hühnereier zu reinigen. Eier in einer longitudinalen Ausrichtung auf Inhaber zu arrangieren.
2. Schalten Sie eine eibrutkasten eine Solltemperatur von 37,5 ° C und die Luftfeuchtigkeit bei 48-55 %. Die Luftfeuchtigkeit wird gesteuert, indem man eine entsprechende Menge an Wasser in den Inkubator.
3. Brüten Sie die Eier, HH11-13, ca. 40-44 h.
4. Lassen Sie die Eier bei Raumtemperatur für ca. 15-30 min vor dem Sprühen/Reinigung mit 70 % Ethanol abkühlen.

3. ziehen Sie Glaskapillaren

1. Montieren Sie eine 10 cm lange Glas-Kapillarröhrchen mit einem äußeren Durchmesser von 1,0 mm und einem Innendurchmesser von 0,5 mm auf einer Mikropipette Abzieher.
2. Hitze und Parameter bzw. 750 und 400, zu ziehen. Das Kapillarrohr in dünne Nadeln ziehen mit der Taste ziehen.

(4) Filterpapier Carrier Methode

1. Schneiden Sie die Kreise von ca. 3 cm Durchmesser aus Filterpapier.
2. Schneiden Sie ein Rechteck etwa 1 cm x 2 cm aus dem Kreis mit einem Loch-Puncher. Achten Sie darauf, entfernen alle hervorstehenden oder scharfe Ecken.

5. Embryo Ernte und Vorbereitung

1. Eier von unten, ziehen Sie die Schale vorsichtig auseinander und Zahlen Sie Inhalt sorgfältig auf eine 150 x 15 mm Petrischale ein. Um sicherzustellen, dass der Embryo-Seite nach oben zeigt, halten Sie die Eier in der gleichen Ausrichtung, die sie beim knacken sie inkubiert wurden.
2. Entfernen Sie die dünnen Albumin mit einer Einweg-Pasteurpipette.
3. Trennen Sie die dicken Albumin aus dem Dotter mit stumpfen Pinzette endete. Sicherstellen Sie, dass die dicken Albumin durch kratzen leicht oben auf das Eigelb mit der stumpfen endete Pinzette entfernt wurde.
4. Verwenden Sie feine Spitzen Pinzette zu zentrieren und legen einen Filterpapier Ring über dem Embryo, Abgleich der Längsachse des Ringes mit der Längsachse des Embryos.
5. Schneiden Sie das Eigelb, die rund um das Filterpapier-Ring mit einer Schere.
6. Ziehen Sie den Ring und Embryo aus dem Eigelb in eine schräge Richtung der Website wo das Eigelb zuerst geschnitten wurde.
7. Spülen Sie die Embryonen in zwei sequentielle 100-mm-Gerichte mit Raumtemperatur 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
8. Legen Sie einen Filterpapier Ring in einer 35-mm-Petrischale zunächst. Dann stellen Sie die Embryo dorsale Seite nach oben auf das Filterpapier bereits in 35-mm-Petrischale.
9. Legen Sie einen Edelstahl-Ring auf das Filterpapier Sandwich. Achten Sie darauf, nicht den Embryo schädigen.
10. Jede Petrischale 3 mL der vorbereiteten CCM hinzufügen.
11. Entfernen Sie die VM von jedem Embryo durch leicht überfliegen die gezogene Kapillare Nadel am oberen Rand der Embryo und peeling entfernt die VM, ab dem vorderen Ende (rechts oben das Vorderhirn) und Sie fortfahren, um die Chorda (Abbildung 1A).
12. Legen Sie acht 35 mm Petrischalen in einer 150 mm-Gericht, das mit Wasser gesättigt heikle Aufgabe Tücher (um die Feuchtigkeit zu erhalten) ausgekleidet war.
13. Ort der 150-mm-Petrischale in einem verschließbaren Plastikbeutel füllen Sie den Beutel mit einem Gasgemisch, bestehend aus 95 % O₂ und 5 % CO₂.
14. Den Beutel und legen Sie es in einem Inkubator 37,5 ° C.
15. Inkubieren Sie die Embryonen für weitere 27 h bis HH15-HH16 (Abbildung 1 b).

(6) induzieren Oberflächenspannung

1. Entfernen Sie die Embryonen aus dem Inkubator und verwenden Sie eine optische Kohärenz Tomographie (OCT) System, um sie Bild. Verwendung OCT Verdrehwinkel des Neuralrohrs (NT) (Abbildung 2) zu bestimmen.
2. Transfer der Embryonen zu einem Lichtmikroskop und visualisieren Sie bei 10-facher Vergrößerung. Verwenden Sie eine 200 Mikroliter-Pipette, um inkrementell 0,2 mL von Medien aus der Petrischale zu entfernen.
3. Nehmen Sie Hellfeld Bilder bei jedem Intervall, die Auswirkungen der Medien-Luftschnittstelle auf den Embryo zu beobachten.
4. Medien zu entfernen, bis die Oberflächenspannung in den Embryo Torsion (Abbildung 1) induziert.
5. Bild des Embryos mit dem OCT-System wieder herstellen einer endgültigen Verdrehwinkel zum Vergleich, Embryonen zu kontrollieren.  Hinweis: Die Bright-Field-Bilder wurden mit einem sezierenden Mikroskop erworben. Eine optische Kohärenz Tomographie System mit einem angehängten Mikroskop wurde verwendet, um Cross-Sectional Bild Stapel von live Embryonen zu erwerben. Bilder waren in einer 3 x 10 x 3 mm³ Scan Domäne erhalten, dann in eine imaging-Software verarbeitet. Zu guter Letzt wurden die physikalischen modelbilder mit einer digitalen Spiegelreflexkamera aufgenommen.

(7) physikalische Modellierung der Oberflächenspannung/VM Kräfte

1. Entwickeln Sie eine vereinfachte 3D Geometrie, die einen Embryo zwischen HH14-17 in kommerziellen Modellierungssoftware (Abbildung 3A) ähnelt.
2. Die Negativform der 3D-Geometrie in kommerziellen 3D Computer-Grafik-Software zu entwerfen.
3. Verwendung ein 3D-Druckers mit 1,75 mm Acrylnitril Butadien Styrol Filament zu 3D geladen Drucken die Form, in köraform (STL) Format.
4. Um die Form gegossen, mischen Sie Silikon-Kautschuk-Elastomer-Komponenten A und B zu gleichen Teilen und Gießen Sie die Mischung in die Form sofort; Legen Sie die Gussform, bei Raumtemperatur für 12 h (Abb. 3 b) zu heilen.
5. Markieren Sie das physikalische Modell des Embryos entlang der NT an der dorsalen Seite Torsion zu visualisieren.
6. Verwenden Sie ein Deckglas Replizieren der Krafteinwirkung auf das physische 3D-Modell der VM oder Oberflächenspannung (Abbildung 3D) nachahmt.
7. Legen Sie eine Reihe von starren Drähte gleichlang auf die Seite des physikalischen Modells. Nachdem das Deckglas eine externe Kraft auf das Gehirn Modell ausübt, werden die Drähte in einem Winkel geneigt, die von der Lage abhängt. Bestimmen Sie den Drehwinkel von Arctan die projizierte Länge über die ursprüngliche Länge jedes Drahtes (Abbildung 3E).

8. ändern die Richtung der Herz-Schleife

1. Folgen Sie den Schritten in 3.1 und 3.2, zog Kapillarrohr zu erhalten.
2. Folgen Sie den Schritten in 5.1 durch 5.10 Embryos vorzubereiten.
3. Verwenden Sie ein paar der Zange, um das Filterpapier zu kippen, so dass der Embryo Ventral-Side-Up wird.
4. Verwenden Sie zog Kapillarrohr einen Schlitz in der Splanchnopleure (SPL) Membran aufzuschneiden.
5. Verwenden Sie das Kapillarrohr, um eine mechanische Kraft, das Herz von der rechten Seite auf die linke Seite schieben.
6. Folgen Sie den Schritten in 5.12 durch 5.15, die Veränderung der Torsion zu beobachten.

Ergebnisse

In dieser Studie wurde die VM des Embryos bei HH11 an der thorakalen Biegung vom vorderen Ende entfernt. Die Embryonen wurden durch ein OCT-System abgebildet. In diesem Stadium ist die Torsion des Gehirns Rohr (Abbildung 1A) nicht gestartet. Nach HH15-16 inkubiert werden, stellte Embryonen mit ihrer VM entfernt reduzierte Gehirn Rohr Torsion, ca. 35 Grad (Abbildung 1 b) im Vergleich zur Steuerung von Embryonen, die Torsion von ru...

Diskussion

Während physikalische Phänomene eine wesentliche Rolle in Morphogenese^{26,27,28,29,30}, die spezifischen mechanische Mechanismen sowie die Koordination von mechanischen spielen und Molekulare Mechanismen bleiben weitgehend unerforscht. Es ist bekannt, dass die ventrale Biegung und rechts Torsion des primitiven Gehirns sind zwei zentrale Prozesse, die zur früh...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fertilized Specific pathogen-free White Leghorn chicken eggs	Charles River
Optical Coherent Tomography Microscope	Thorlabs	GAN220C1
Silicone elastomer	Smooth-On, Inc.	EcoFlex 00-50
Dissecting microscope	Leica	MZ8
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Lonza	12-604F
Antibiotics	Sigma	P4083
Chick serum	Sigma	C5405
Micropipette puller	Sutter Instrument	Model P-30
Filter paper	Whatman	5202-110
Phosphate buffered saline (PBS)	Corning	21-040-CV
Comsol MultiPhysics	Comsol
3D computer graphics software	Rhino 5
Microscope attached with OCT	Nikon	FN1
Digital single-lens reflex camera	EOS	Rebel T3i