Kan - beyin bariyerini bozulma iskemik inme, bir fare modeli Vivo içinde değerlendirilmesi

Özet

Bu yordamı genel amacı fare modelleri iskemik inme kan - beyin bariyerini bozulma vivo içinde değerlendirmesi için son derece tekrarlanabilir bir teknik sağlamaktır.

Özet

İskemik inme vasogenic serebral ödem ve kan - beyin bariyerini (BBB) imha aracılık ettiği sonraki birincil beyin hasarı yol açar. Fareler indüklenen iskemik inme ile kurulan ve in vivo modelleri BBB işlevsel bütünlüğü araştırmak için kullanılan. Evans mavi (EB) spektrofotometrik algılama beyin örneklerinde iskemik yaralanma ile araştırma ve geliştirme yeni tedavi yöntemleri için güvenilir gerekçe sağlayabilir. Bu yöntem tekrarlanabilir sonuçlar üretir ve özel ekipman gerek olmadan herhangi bir laboratuvar geçerlidir. Burada, indüksiyon Sıçanlarda iskemik inme takip EB ekstravazasyonu algılamayı görüntülenmeyecektir ve teknik kılavuz mevcut.

Giriş

Vasogenic Beyin ödemi kan - beyin bariyerini (BBB) bozulma nedeniyle iskemik inme önemli bir komplikasyonu ve inme hasta^1,2sağkalım oranı önemli bir belirleyici kalır. Kan - beyin beyin kapiller endotel hücreleri tarafından (BCECs) kurdu ve farklı nörovasküler bileşenler (Örneğin, BCECs, perisitlerden, astroglial ve nöronal hücrelerin³arasında sıkı kavşak) oluşur, bariyerini (BBB), sağlar bir Merkezi sinir sistemi (MSS) ve periferik dolaşım^4,5arasında uzman ve dinamik arabirim. İskemi-reperfüzyon yaralanmalar gibi hakaret BBB işlevsel bütünlüğü bozabilir ve lökosit sonuçta beyin iltihabı ve birincil beyin yaralanmaları tetiklemek beyin parankimi dolaşan sonraki penetrasyon yol ^{6 , 7}. hayvan modelleri felç oluşumunu takip BBB disfonksiyon kesin tespiti için ihtiyaç vardır. Patofizyolojik mekanizmaları temel ve yeni nöroprotektif stratejileri tanıtımı için büyük önem böyle modellerdir. BBB vitro hücre kültür tabanlı modelleri son derece geliştirilmiş ve BBB Fizyopatoloji^8,9,10moleküler çalışma için kullanılan. Yine de, insan klinik koşullara benzer BBB iskemik hasar üretmek, in vivo hayvan modelleri de bu konuda çok değerli bulunmaktadır. Evans mavi (EB) ekstravazasyonu nicel tespiti değerlendirme BBB bütünlüğü ve nörodejeneratif hastalıklar, iskemik inme^11, de dahil olmak üzere bir işlev için kullanılan bir iyi kabul edilen ve hassas teknik olduğunu ^{12 , 13 , 14}. bu deneysel herhangi bir laboratuvarda, tekrarlanabilir mümkün, maliyet-etkin ve tamamen geçerli bir yöntemdir. Onun uygulanması gibi radyoaktif izleyiciler¹⁵ veya diğer yöntemleri için önkoşul olan manyetik rezonans görüntüleme (MRG)¹⁶, gelişmiş donanım gerektirmez. Bu makalede, biz kapsamlı bir şekilde BBB değerlendirme EB ekstravazasyonu iskemik inme fare modellerinde kullanarak temel teknik işlemleri göstermek.

Protokol

Tüm yordamları hayvan çalışmaları yürütmek için: Ardabil Üniversitesi Sağlık Bilimleri Araştırma Konseyi kılavuzlarınıza uygun olarak gerçekleştirilmiştir (etik Sicil No: IR. ARUMS. rec.1394.08). bu görüntülenmeyecektir çalışmada, biz mera Enstitüsü (Tahran, Iran)'nden elde edilen yetişkin erkek Sprague-Dawley Rat (300-350 g) kullanılır.

1. anestezi ve Flowmetry

1. Anestezi % 4 isoflurane kullanarak teşvik ve ameliyat süresince Nitröz oksit (% 70 v/v) ve oksijen (% 30 v/v) karışımı isoflurane (1-%1,5) ile sürdürmek.
2. Anaesthetized bir hayvan üzerinde bir geri besleme kontrollü Isıtma battaniye eğilimli duruş yerleştirin ve bu ısıtıcının bağlı bir rektal sonda aracılığıyla 37±0.5 ° C de vücut ısısını korumak.
3. Oftalmik merhem az miktarda kuruluğu önlemek için her iki gözde uygulanır.
4. Kafatasının sol tarafında cerrahi bölge elektrik makasları ile tıraş. Betadine çözüm bir gazlı bez yastık ile cilt dezenfekte için kullanın. Bu bölge % 70 etanol içeren steril bir yastık ile durulayın ve üç devir¹⁷için her iki adımları yineleyin.
5. Analjezi için 0.2 mL % 0.5 bupivacaine subkutan ameliyat bölgesi¹⁷enjekte.
6. (Sol göz yanal canthus sol kulak tabanına uzanan) kafatası üzerinde 1 cm uzun cilt kesi yapmak ve kafatası ortaya çıkarmak için sol temporalis kas incelemek. Daha sonra bir küçük burr deliği 5 mm lateral için ve 1 mm Doppler Flowmetre kalem sonda ucu yerleşimini kolaylığı için bregma¹⁸ arka oluşturun.
7. Sıçan eğilimli sırtüstü konumuna gelen açın ve sonra lazer kalem sonda önceden delinmiş kafatası kör-bölgesel beyin kan akımı (rCBF) izlemek için deliğe sok.
8. Her hayvanın temel rCBF kaydetmek ve bu % 100 olarak düşünün. Özellikle, her rCBF fazla % 80 azalma tespit edilen^19,20ne zaman orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) başlatılır.

2. indüksiyon Fokal Cerebra iskemi

1. Boyun bölgesi tıraş ve cilt betadin çözüm ve % 70 etanol ile dezenfekte. Analjezi¹⁷için ameliyat sitedeki subkutan %0,5 bupivacaine 0.2 mL enjekte.
2. 2 cm uzun cerrahi kesi sol ortak Karotid arter (LCCA) erişmek için boyun ventral yüzeyinde olun. Bifurkasyon dış Karotid arter (ECA) ve iç Karotis arter (ICA) erişmek için LCCA komşu fasya ve vagus siniri izole et.
3. Ya LCCA ya da 5-0 ipek sütür istihdam ECA kalıcı olarak ligate ve pterygopalatine arter seviyeye ücretsiz ICA incelemek.
4. Gevşek 5-0 ipek sütür LCCA, etrafında kravat yerleştirin ve ardından geçici olarak ICA ile vasküler bir mikro-klip kelepçe.
5. LCCA daha önce yerleştirilmiş gevşek kravat önce küçük bir kesi yapmak ve 4-0 naylon silikon kaplı dikiş ICA luminal uzaya takın ve naylon dikiş güvenli ve kan sızıntı önlemek için LCCA çevresinde dikiş sıkın.
6. Vasküler mikro-klip ICA kaldırın. Sonra bir silikon kaplı intraluminal filament MCA kökenli tıkanıklığı gösterir rCBF belirgin bir düşüş gözlemleyerek kadar ilerlemek. (90 dk) iskemik dönemin sonunda, reperfüzyon intraluminal dikiş²¹çekilerek başlatın.

3. juguler ven Cannulation ve Evans mavi (EB) enjeksiyon

1. 1 cm boyuna kesi boynundan orta çizgi sol tarafında yapmak ve sonra açık açık sol juguler ven (LGV) dış dalı erişmek için uzak yüzeysel fasya incelemek. Sonra kalıcı olarak 5-0 ipek sütür ile LGV kafatası sonuna ligate. Gevşek damar çevresinde iki bağları yerleştirin ve ardından geçici olarak kelepçe LGV bir vasküler mikro-kelepçe ile kardiyak sonu.
2. Arasında iki dikiş, LGV küçük bir insizyon attım kazanmama ve LGV luminal uzaya heparinized serum dolu kateter yerleştirin ve yaklaşık 10 mm. daha sonra ilerlemek, kateter güvenli ve kanama önlemek için damar çevresinde bitişik harfler sıkın. Az miktarda damar çöken önlemek için bir serum enjekte.
3. Reperfüzyon döneminin başlangıcında, yavaş yavaş bir 5 dk süre içinde EB boya (%2 EB çözüm serum fizyolojik içinde 1 mL/kg) enjekte et. Daha sonra kanül 0.5 mL normal salin enjeksiyonu ile yıkama ve enjeksiyon kanül ven^12,22çekilme.
4. Son olarak, boyun ve baş insizyon dikiş ve 0,05 mg/kg buprenorfin intraperitoneally enjekte (IP) ve enjeksiyon ameliyat sonrası analjezi¹⁷reperfüzyon dönemde her 6-8 h tekrarlayın.
5. Hidrasyon kurtarma kafes¹⁷sağlamak için Önceden ısıtılmış saline(IP) 5 mL enjekte.
6. Yer özel kurtarma Kafesteki hayvan sıcaklık ve klima kontrol ile donatılmış ve hayvan kurtarma anestezi üzerinden izleyebilirsiniz.

4. kan beyin bariyerini geçirgenliği değerlendirilmesi

1. Reperfüzyon, 24 saat sonra derin sodyum tiyopental hayvanla anestezi. Göğüs boşluğuna, göğüs kemiğinin altında küçük bir delik yaparak açın.
2. Sağ atrium içinde küçük bir açılış yapmak ve Önceden ısıtılmış % 0,9 serum (37 ˚C) sol ventrikül atrium gelen normal tuzlu çıkar hale gelinceye kadar renksiz²³EB uzak dolaşım yıkamak 15 dakika ile 110 mmHg basınçta 250 mL enjekte.
3. Hemen beyin kafatasından çıkarın ve beyin matris yerleştirin. Olfaktör ampul ve beyincik incelemek ve sonra temiz bir tıraş bıçağı kullanarak orta hat boyunca (Lesioned) sol beynin sağ hemisfer ayırın.
4. Her hemisphere tartmak ve onları ayrı ayrı 2.5 mL fosfat tamponlu tuz homojenize ve bu 2 bir girdap makine kullanarak en az 2.5 mL trichloroacetic asit (% 60) ile karıştırın.
5. Beyin örnekleri 1,322 x g de 30 dk santrifüj kapasitesi ve örnekleri 4 ° C buzdolabı 10 dakika soğumasını bekleyin.
6. EB Absorbans Spektrofotometre tarafından 610 nm²³, tahmin etmek için supernatants kullanın.
7. EB konsantrasyonları standart bir eğri ve hızlı sonuçlar karşı µg/g beyin doku hesaplayın.

5. EB standart eğri imalatı

1. EB 10 örnek çözümler EB fosfat tamponlu tuz 5 ml, 1-10 µg konsantrasyonları ile hazırlayın.
2. Her örneği 610'Absorbans değerleri ölçmek bir Spektrofotometre kullanarak nm.
3. Elektronik tablo ve X ekseni üzerinde mevcut EB konsantrasyonları ve Absorbans değerleri Y ekseni (şekil 1) kullanarak bir dağılım grafik olun.
4. Denklemi ile eğrisi doğrusal bir eğilim-satır tanımlayın. Daha sonra örnekleri EB konsantrasyonu elde etmek için kullanabilirsiniz.
5. EB ekstravazasyonu kesin sonuçları µg/g beyin doku ağırlık rapor.

6. sahte işlem

1. Sham işletilen grubunda (dahil olmak üzere bir kesik boyun bölgesi ve EB enjeksiyon yapma) fareler aynı cerrahi işlemle gerçekleştirmek ancak MCAO dışarıda.

Sonuçlar

Karşı sahte ile çalışan fareler sol hemisfer sağ hemisfer EB düzeylerinde anlamlı bir fark yoktu (1.06 ± 0,1 µg/g ve 1,1 ± 0,09 µg/g, sırasıyla). Rakamlar 2A-2B, indüksiyon geçici iskemi gösterildiği gibi (90 dk iskemi / 24 h reperfüzyon) EB seviyesi önemli bir fark neden (10.41 ± 0,84 µg/g, p < 0.001) ile karşılaştırıldığında ilgili iskemik sıçan sol yarıküre'deki sham çalışan fareler yarımkürede. Toplu olarak, bu bulgular ...

Tartışmalar

Şimdiye kadar autoradiography ve algılama, radyoaktif izleyiciler^24,25, ayirt mikroskobu^26,27ve EB ekstravazasyonu tekniği^20, gibi çeşitli yöntemleri ²³ kan - beyin bariyerini zarar değerlendirmek için kullanılmaktadır. EB boya ve serum albümin bağlamak güçlü yapabiliyor bir izleyici vasküler sızıntı tespit ve BBB arıza

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Piramal	AWN 34041100	20 - 25 °C
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Molekula	31216368	4 years
Sprague–Dawley rats	Pasture Institute (Tehran, Iran)		300-350g
Evans Blue	Sigma-Aldrich	314-13-6
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	76-03-9	2 years
Bupivacaine HCl (0.5%)	Delpharm Tours		below  25 °C
Bupernorphine	Exir (Iran)
Sodium Carbonate	Sigma-Aldrich	497-19-8
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Di- Sodium hydrogen phosphate	EMD Millipore	231-448-7
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Ethanol	Sigma-Aldrich	64-17-5
silicone(Xantopren)	Heraeus	EN ISO 4823
Activator universal plus	Heraeus	66037445
Micro-Dissecting forceps	Stoelting	52100-41
Spring Scisors	Stoelting	52130-00
Operating  Scissors	Roboz	52140-70
Brain matrix	Stoelting	51390
Anesthesia Machine for Small Animals |	Kent Scientific	SS-01
Power Lab system	AD Instruments	ML880
Laser Doppler flowmeter	AD Instruments	ML191
Heating feed back system	Harvard Appratus	72-7560
Vascular micro clamp	FineScience Tools	18055-03
Silk 5-0 suture thread	Ethicon	682G
Ethilon 4-0 suture thread	Ethicon	EH6740G