В естественных условиях оценки разрушения гематоэнцефалический барьер в мышиной модели ишемического инсульта

Резюме

Общая цель этой процедуры заключается в том, обеспечить высокую воспроизводимость технику в естественных условиях оценки разрушения гематоэнцефалический барьер в моделях крыса ишемического инсульта.

Аннотация

Ишемического инсульта приводит к vasogenic церебрального отека и последующих первичного мозга травмы, который опосредовано через разрушение гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Крыс с индуцированных ишемического инсульта были созданы и используются как в естественных условиях модели для изучения функциональной целостности BBB. Спектрофотометрические обнаружение Эванс синий (EB) в образцах с ишемического повреждения мозга может обеспечить надежные основания для исследований и разработок новых терапевтических методов. Этот метод генерирует воспроизводимость результатов и применим в любой лаборатории без необходимости специального оборудования. Здесь мы представляем визуализировать и технического руководства по обнаружению кровоподтек EB после индукции ишемического инсульта в крыс.

Введение

Vasogenic отек мозга вследствие нарушения гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) остается важным осложнение ишемического инсульта и важным фактором, определяющим выживаемость в инсульт пациентов^1,2. Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), который формируется капиллярных эндотелиальных клеток головного мозга (BCECs) и состоит из отдельных нервно-сосудистых компонентов (например, плотные соединения между BCECs, pericytes, астроглиальных и нейрональные клетки³), обеспечивает специализированные и динамический интерфейс между центральной нервной системы (ЦНС) и периферического кровообращения^4,5. Оскорбления как ишемии реперфузии травмы может подорвать функциональную целостность BBB и привести к последующего проникновения циркулирующих лейкоцитов в паренхимы мозга, которая в конечном счете вызвать воспаление головного мозга и первичного мозга травмы ^{6 , 7}. Животные модели необходимы для точного выявления дисфункции BBB, после возникновения инсульта. Такие модели имеют большое значение для изучения основные патофизиологические механизмы и внедрения новых нейропротекторной стратегии. В пробирке клеток на основе культуры модели BBB высоко разработаны и используются для исследования молекулярной BBB физиопатологические^8,9,10. Тем не менее в естественных условиях Животные модели, которые производят ишемического повреждения BBB похож на человека клинических условиях, также очень полезной в этом отношении. Количественные обнаружение кровоподтек Эванс синий (EB) является широко признанным и чувствительной технику, которая была использована для оценки целостности BBB и функции нейродегенеративных заболеваний, в том числе ишемического инсульта^{11, 12 , 13 , 14}. Этот метод является экономически эффективным, возможно, воспроизводимые и полностью применимы в любой экспериментальной лаборатории. Его осуществление не требует современного оборудования, таких, как радиоактивные Трейсеры¹⁵ или магнитно-резонансная томография (МРТ)¹⁶, которые являются предпосылками для других методов. В этой статье мы всесторонне продемонстрировать основные технические процессы оценки BBB, используя EB кровоподтек в моделях крыса ишемического инсульта.

протокол

Все процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами Ардебиль университета медицинских наук исследовательский совет для проведения исследований на животных (этические ID номер: IR. ARUMS. REC.1394.08). В этом исследовании визуализировать, мы использовали взрослых самцов Sprague-Dawley крысы (300-350 г), полученные от пастбищ института (Тегеран, Иран).

1. анестезия и флоуметрия

1. Вызвать обезболивание с помощью 4% изофлюрановая и поддерживать его с изофлюрановая (1-1,5%) в смесь закиси (70% v/v) и кислорода (30% v/v) для продолжительности операции.
2. Анестезированные животного в подверженных позы на обратной управляемой электроодеяло и поддержания температуры тела при 37±0.5 ° C с помощью ректального зонда, подключенных к этой нагревательный элемент.
3. Применять небольшое количество глазная мазь на оба глаза, чтобы избежать сухости.
4. Бритье с электрические Ножницы хирургические региона на левой стороне черепа. Использование Бетадин-раствор с марлевой для дезинфекции кожи. Промойте этот регион с стерильных площадку, содержащие 70% этанол и повторите Оба шага для трех циклов¹⁷.
5. Для обезболивания inject 0,2 мл 0,5% бупивакаин подкожно в области хирургии¹⁷.
6. Сделать разрез кожи длиной 1 см на черепе (простирается от бокового угла глазной щели левого глаза в основание левого уха) и рассечения левой височной мышцы подвергать черепа. Затем создайте небольшой Берр отверстие сбоку 5 мм и 1 мм, задняя bregma¹⁸ легкость размещения кончик зонда карандаш доплеровского расходомера.
7. Поверните крысу из подверженных в лежачем положении, а затем поместить лазерный излучатель карандаш в ранее пробуренных череп слепых отверстие для мониторинга регионарного мозгового кровотока (rCBF).
8. Запись каждого животного базовой rCBF и рассматривать это как 100%. В частности средней мозговой артерии окклюзии (СМАо) запускается всякий раз, когда уменьшение rCBF более чем на 80% обнаруженных^19,20.

2. индукция фокуса церебрально ишемии

1. Бритье области шеи и дезинфекции кожи с Бетадин-раствор и 70% этанола. Придать 0,2 мл 0,5% бупивакаин подкожно в хирургии сайт для анальгезии¹⁷.
2. Сделайте 2 см длиной хирургический разрез в брюшной поверхности шеи для доступа к левой общей сонной артерии (LCCA). Изолируйте LCCA из соседней фасции и блуждающего нерва для доступа к бифуркации наружной сонной артерии (ЭКА) и внутренней сонной артерии (МКА).
3. Перевязать постоянно LCCA или ЭКА, используя 5-0 Шелковый шов и вскрыть ICA бесплатно на уровень крылонебный артерии.
4. Свободно место галстук 5-0 Шелкового шва вокруг LCCA, а затем временно ICA зажим с сосудистой микро клип.
5. Сделать небольшой надрез на LCCA до ранее размещенных потерять галстук и затем вставьте швом нейлона покрытием кремния 4-0 в пространство Люминал ICA и завинтите швом вокруг LCCA для обеспечения швом нейлона и предотвращения утечки крови.
6. Удаление сосудистых микро клип из ЗКИ. Затем заранее накаливания с покрытием внутрипросветная кремния до наблюдения за заметное снижение rCBF, указывающее окклюзии MCA происхождения. В конце периода ишемического (90 мин) запустите реперфузии, снятие швов внутрипросветная²¹.

3. яремной катетеризации и Эванс синий инъекции (EB)

1. Сделать продольный разрез 1 см в шею в левой части средней линии и затем тупо вскрыть прочь поверхностные фасции для доступа к внешней ветви левой яремной (LGV). Затем постоянно перевязать краниального конца LGV с Шелковый шов 5-0. Свободно место два связей вокруг Вены, а затем временно зажим сердца конце LGV с сосудистой микро зажим.
2. Сделать небольшой надрез на LGV между двумя швами и затем вставить катетер гепаринизированным сыворотки заполнены в пространство Люминал LGV и заранее его примерно 10 мм. потом, затяните лигатуры вокруг Вены, чтобы обеспечить катетер и предотвратить кровотечение. Вдохнуть небольшое количество сыворотки, чтобы избежать коллапса Вену.
3. В начале периода реперфузии, медленно вводить EB краска (1 мл/кг 2% раствора EB в солевой раствор) в течение 5 мин. Впоследствии мыть канюлю путем инъекции по 0,5 мл физиологическим и снять канюлю инъекции из вен^12,22.
4. Наконец, шовные шеи и головы разрезов и придать бупренорфин 0,05 мг/кг внутрибрюшинно (IP) и повторять инъекции каждые 6-8 ч в течение периода реперфузии для послеоперационного обезболивания¹⁷.
5. Придать 5 мл подогретым saline(IP) предоставлять гидратации в клетке восстановления¹⁷.
6. Место животное в клетке специального восстановления оснащены температуры и управления кондиционером и контролировать восстановление животного от анестезии.

4. Оценка проницаемости барьер мозга крови

1. Через 24 часа реперфузии глубоко анестезировать животное с тиопентал натрия. Затем откройте грудной полости, сделав небольшое отверстие под грудины.
2. Сделать небольшое отверстие в правое предсердие и залить 250 мл подогретым 0,9% физиологического раствора (37 ° c) при давлении, составляющем 110 мм рт.ст, через 15 мин мыть EB от циркуляции до нормальной солевой выходы из атриума становится бесцветным²³левого желудочка.
3. Немедленно удалите мозг от черепа и поместите его в матрице мозга. Вскрыть обонятельные луковицы и мозжечка, и затем с помощью чистой лезвия бритвы, отдельные правого полушария головного мозга от левого (Lesioned) вдоль средней линии.
4. Взвешивать каждое полушарие и гомогенизации их отдельно в 2,5 мл фосфатный буфер и смешивать это с 2,5 мл трихлоруксусной кислоты (60%), за 2 мин, с помощью машины вихря.
5. Центрифугуйте образцы мозга для 30 мин при 1 322 x g и позволяют образцы остыть в холодильнике 4 ° C на 10 мин.
6. Для оценки EB поглощения на спектрофотометре 610 Нм²³используйте supernatants.
7. Вычислить EB концентрациях против калибровочной кривой и Экспресс результаты как мкг/г ткани мозга.

5. производство EB калибровочной кривой

1. Подготовка 10 пример решения EB с концентрацией 1-10 мкг EB в 5 мл фосфатный буфер.
2. Измерение оптической плотности значений каждого образца в 610 Нм, используя спектрофотометр.
3. Сделайте на точечной диаграмме, с помощью таблицы и настоящем EB концентрации на оси X и значения поглощения на оси Y (рис. 1).
4. Определите линейный тренд для кривой с ее уравнение. Затем используйте его для получения образцами концентрации EB.
5. Доклад окончательные результаты EB кровоподтек как мкг/г массы ткани мозга.

6. Шам операции

1. Выполните процесс же хирургические с крысами в Шам действовали группы (включая делая надрез в области шеи и EB инъекции), но исключает СМАо.

Результаты

Не было никакого существенного различия в уровнях EB в правом полушарии против левого полушария Шам действовали крыс (1,06 ± 0,1 мкг/г и 1.1 ± 0,09 мкг/г, соответственно). Как показано в цифры 2А 2Б, индукция временной ишемии (90 мин ишемии / реперфузии 24 h) вызвало существе?...

Обсуждение

До настоящего времени различные методы, такие как авторадиографии и обнаружения радиоактивных трассеров^24,25,^26,микроскопии иммунофлуоресценции²⁷и EB кровоподтек техника^{20, 23} были использован?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Piramal	AWN 34041100	20 - 25 °C
2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Molekula	31216368	4 years
Sprague–Dawley rats	Pasture Institute (Tehran, Iran)		300-350g
Evans Blue	Sigma-Aldrich	314-13-6
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	76-03-9	2 years
Bupivacaine HCl (0.5%)	Delpharm Tours		below  25 °C
Bupernorphine	Exir (Iran)
Sodium Carbonate	Sigma-Aldrich	497-19-8
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Di- Sodium hydrogen phosphate	EMD Millipore	231-448-7
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Ethanol	Sigma-Aldrich	64-17-5
silicone(Xantopren)	Heraeus	EN ISO 4823
Activator universal plus	Heraeus	66037445
Micro-Dissecting forceps	Stoelting	52100-41
Spring Scisors	Stoelting	52130-00
Operating  Scissors	Roboz	52140-70
Brain matrix	Stoelting	51390
Anesthesia Machine for Small Animals |	Kent Scientific	SS-01
Power Lab system	AD Instruments	ML880
Laser Doppler flowmeter	AD Instruments	ML191
Heating feed back system	Harvard Appratus	72-7560
Vascular micro clamp	FineScience Tools	18055-03
Silk 5-0 suture thread	Ethicon	682G
Ethilon 4-0 suture thread	Ethicon	EH6740G