Bir hızlı gümüş boyama Protokolü etkinleştirme basit ve SSR bir sigara denaturing Polyacrylamide jel kullanarak işaretleri, verimli algılama

Özet

Burada, sadece üç reaktifler ve 7 min işleme gerektirir ve yüksek kaliteli SSR veri genetik analiz hızlı üretimi için uygundur Protokolü boyama basit ve düşük maliyetli bir gümüş raporu.

Özet

Basit dizi tekrar (SSR) bitki ve hayvan genetik araştırma ve moleküler ıslah programlarında kullanılan en etkili işaretleri biridir. Gümüş boyama SSR işaretleri polyacrylamide jel içinde tespiti için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Ancak, gümüş boyama için geleneksel teknik olarak zor ve zaman alıcı iletişim kurallarıdır. Gibi birçok biyolojik laboratuvar teknikleri, iletişim kuralları boyama gümüş sürekli algılama verimliliği artırmak için optimize edilmiştir. Burada, önemli ölçüde reaktif maliyetlerini azaltır ve algılama çözünürlük ve görüntü netliğini artırır yöntem boyama basitleştirilmiş bir gümüş raporu. Yeni yöntem için sigara denaturing polyacrylamide jel iki önemli adım (emprenye ve geliştirme) ve üç reaktifler (Gümüş nitrat, sodyum hidroksit ve formaldehit) ve sadece 7 dakika işleme gerektirir. Daha önce raporlanmış iletişim kurallarına göre bu yeni yöntem daha hızlı, daha kolaydır ve daha az kimyasal reaktifler SSR algılama için kullanır. Bu nedenle, bu basit, düşük maliyetli ve verimli gümüş Protokolü boyama genetik haritalama ve marker-yardım etmek üreme SSR işaretçisi veri hızlı bir nesil tarafından yararlanacaktır.

Giriş

PCR tabanlı işaretleri gelişimi bilim üreme¹ve bitki genetik devrim yarattı. Basit sıralı tekrar (SSR) işaretleri arasında en sık kullanılan ve en çok yönlü DNA işaretlerine vardır. Onların geniş genom kapsamı, bereket, genom özgüllük ve tekrarlanabilirlik heterozigoz genotip²tespiti için ek olarak kendi codominant devralma SSR işaretleri yararları bazılarıdır. Çeşitli çalışmalarda SSR işaretleri genetik çeşitlilik araştırmak, soy izlemek, genetik bağlantı haritalar oluşturmak ve ekonomik açıdan önemli özellikleri^3,4için gen eşlemek için kullandık.

PCR ürünleri SSR işaretleri kullanarak özel veya polyacrylamide Jel Elektroforez ve etidyum bromür ile boyama sonra gümüş boyama ile veya UV ışığı altında görüntülenir yaygın olarak ayrılır. Polyacrylamide jeller DNA parçalarının gümüş boyama diğer boyama yöntemleri^5,'⁶ dan daha duyarlı ve yaygın olarak DNA parçalarının SSR işaretleri⁷gibi algılamak için kullanılan.

Gibi birçok biyolojik laboratuvar teknikleri, gümüş polyacrylamide jeller boyama giderek onun ilk bir parçası görselleştirme teknik 1979⁸' olarak rapor ediliyor beri geliştirdi. Teknik DNA parçalarının tespiti için başlangıçta Bassam vd tarafından güncellenmiştir ⁶ 1991 ve 1994 yılında Sanguinetti ve iş arkadaşlarınızla⁹ tarafından geliştirilmiş. Yöntem daha son birkaç on yıl^{6,7,9,10,11,12,13,14} ' te optimize ^{, 15}. ancak, iletişim kurallarının Güncellenme Zamanı bu sürümleri çoğu hala bu protokolleri^{7uygulama sınırı, yüksek teknik talep ve uzun süre fiksasyon için işleme ve6, montaj gibi bazı dezavantajları var 11}. DNA parçası algılama yüksek verimlilik ile düşük maliyetli birleştiren bir en iyi Protokolü acilen biyolojik araştırmada boyama gümüş rutin uygulama için gereklidir.

Buna ek olarak, polyacrylamide jel denaturing ve sigara denaturing polyacrylamide jeller bölünmüş olabilir ve her ikisi de gümüş boyama yöntemi kullanarak SSR işaretleri tespiti için kullanılabilir. Etkisi ve kararlılık-in hangi önemli ölçüde farklı değildir, ama sigara denaturing polyacrylamide jeller süreci daha kolay ve daha az zaman¹⁶almak.

Önceki araştırma¹⁵temel alınarak, geçerli çalışmanın amacı ayrıntılı SSR işaretleri bir sigara denaturing polyacrylamide jel içinde hızlı, kolay ve düşük maliyetli algılanması için protokol boyama en iyi duruma getirilmiş bir gümüş tarif etmektir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. SSR işaretleri PCR ürünlerinin hazırlanması

1. Tüm kimyasallar ve Kimyasalları şablon DNA içeren PCR reaksiyonları için hazırlamak (30 ng/µL), 2 × PCR ana mix (2 × PCR arabellek, her dNTP, 3 mM MgCl₂, 0.1 U/µL Taq DNA polimeraz ve boyalar 0.4 mM içeren), her 10 µM ileriye ve geriye doğru astar ve distile veya deiyonize su (dH₂O).
   Not: mevcut çalışmada kullanılan SSR işaretleri PT51333 idi (ileri astar sıra: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' ve ters astar Sıralaması: 5 '- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3') ve PT50903 (ileri astar sıra: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' ve ters astar sıra: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ') tütün ve CX-43 (ileri astar sıra: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' ve ters astar sıra: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3') ve CX-157 (ileri astar sıra: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' ve ters astar sıra: 5 '- GGACAGCTTCACACATTTGC - 3') için çiçekli Çin lahanası.
2. 2 µL şablonunun DNA, 2 × PCR ana karışımı, her ileri astar ve ters astar 0.2 µL ve dH₂O. 2.6 µL 5 µL ekleyerek amplifikasyon için 10 µL PCR karışımı hazırlayın
3. PCR güçlendirme tepki thermocycler 94 ° C 5 min için bir ilk adım ile gerçekleştirmek, 45 38 döngüsü tarafından takip için denatürasyon, 45 94 ° C'de s s astar tavlama için 55 ° c ve 1 dk. uzantılı 72 ° C'de ve son uzantısı adım 10 dk 72 ° C; o zaman PCR ürünleri daha sonra kullanmak için 4 ° C'de depolayın.

2. Polyacrylamide için çözümler hazırlanması döküm jelleri

1. 5 × TBE tampon 1 L 54 g Tris temel ve 27,5 g Borik asit dH₂O içinde eriterek, 20 mL 0.5 M EDTA (pH 8.0) ekleme ve çözüm için 1, 000 mL dH₂O. son hacmi ayarlama hazırlayın
   Not: TBE tampon oda sıcaklığında ay depolanabilir.
2. 0,5 × TBE tampon 2 L 200 mL 5 × TBE tampon dH₂O 2 L son hacmiyle ekleyerek hazırlamak ve oda sıcaklığında saklayın.
3. 29 g moleküler biyoloji sınıf Akrilamid ve moleküler biyoloji sınıf N, N 1 g çözülerek % 6 Sigara denaturing polyacrylamide jel çözüm hazır olun '-0,5 × TBE tampon son hacmiyle 500 mL methylenebisacrylamide. Alüminyum folyo ve daha sonra kullanmak için 4 ° C'de mağaza ile çözüm şişe kapağı.
   Dikkat: Akrilamid güçlü bir nörotoksin kabul edilir ve dikkatle ele alınmalıdır. Her zaman ne zaman toz ve o içermek işleme çözümleri tartı eldiven.
4. Bir % 20 amonyum persülfat (APS) çözüm APS 2 g dH₂O son hacmiyle 10 mL ile çözülerek hazırlayın. -20 ° C'de ay depolanabilir.
   Not: kolaylık sağlamak için 10 mL % 20 APS çözeltisi 1,5 mL veya santrifüj tüpleri için depolama-20 ° C'de 2 mL bölünmemeli olabilir Çözülme ve de kullanmadan önce karıştırın.
5. Seyreltilmiş bağlama-silane çözüm bağlama-silane %0,5 Asetik asit içeren % 95 etanol 0.997 ml 3 µL çözülerek hazırlayın. Bu hafta için 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
   Dikkat: Bind-silane zehirlidir, çözüm işlerken eldiven giymek ve havalandırılmış Oda tutmak.

3. hazırlanması Polyacrylamide Jel Elektroforez için

1. Musluk suyu, bir tam dH₂ile O. hava kuru plakaları raf kurutma bir tabak içinde ayarlayarak durulama tarafından takip bir dizi cam plakanın ve çubukları deterjan ile yıkayın.
2. 1 mL bağlama-silane çözeltisi bir dikdörtgen cam levha ve 5 min için Kuru iç yüzeyine dağıtmak.
   Not: bind-silane çözüm plaka yüzeyinde düzgün yaymamak jel boyama sırasında ayrılmış olarak ve tatmin edici bir boyama etkisi sonucunda.
3. Çentikli cam levha bir bez ile iç yüzeyine püskürtmek-silane 1 mL dağıtmak, aşırı püskürtmek-silane kağıt mendil ile yok etmek ve 5 min için kurutma.
   Not: repel-silane cam levha yüzeyine eşit şekilde kat değil, jel kısmen sıyırma tarafından zarar verebilir.
4. Çentikli plakalı Paspayı ile cam plakanın üzerine montajı ve montaj kelepçeleri döküm ile her iki kelepçe.
5. Uygun miktarda (40 mL) 33 cm genişlik × 10 cm yükseklik ve spacer kalınlığı 1.5 mm plaka kümesi için bir ölçek için % 6 Sigara denaturing polyacrylamide jel çözüm dökün, tetramethylethylenediamine (TEMED) 20 µL ve 200 µLfresh %20 eklemek APS ve karışımı yavaşça.
   Not: Uygun miktarda jel çözüm (40 mL) iki tabak iç birimden çubukları (30 cm × 8,5 cm × 0,15 cm) kalınlığı ile hesaplanır. Jel polimerizasyon için TEMED ve APS miktarı gelince jel eriyik-e doğru TEMED ve başvuru¹⁷tarihinde dayalı APS standart bir oran vardır. Yukarıda açıklanan jel çözüm 4 ° C'de depolanan Jel çözüm oda sıcaklığında, TEMED 20 µL ve APS kullanılması gereken % 20 100 µL depolanır. Jel çözüm çözüm içinde hava kabarcıkları önlemek için bir cam sopa ile karışımı hafifçe karıştırın.
6. Hemen solüsyonu dökün ve dikkatle çentikli tabak kenarı boyunca monte cam kalıplara neredeyse tepeye boşluğu doldurmak ve tarak ekleyin. Jel çözüm küçük hacmi tarak ekleyin.
   Not: cam plakanın jel sızıntı gelen önlemek için yatay tutun. Herhangi bir kabarcıklar balonu kanca ile kaldırın.
7. Jel 30 dk için oda sıcaklığında ayarlamak izin verir.
   Not: Jel çözüm ve ortam sıcaklıklarında polimerizasyon süre değişebilir.
8. Sonra jel tamamen polimerizasyonu, döküm kelepçeler kaldırmak ve üst arabellek rezervuar doğru bakan çentikli plakalı Elektroforez tankı biriminde tabak seti getirin ve büyük kelepçeler tank birimine ayarla plaka bağlamak için kullanın.
9. 1 L 0,5 × TBE tampon her üst ve alt rampaları dökün. Tarak kaldırmak ve tüm wells bir pipet veya şırınga kullanarak arabellek ile kanül.
   Not: jel sandviç alt plaka tamamen olmadan herhangi bir kabarcıklar arabellekte batırılmış olun.

4. koşma jelleri

1. Yaklaşık 1 µL PCR ürününün polyacrylamide jel her kuyunun içine yükleyin. DNA boyutu merdivenle jel örnekleri PCR ürünlerinin yanı sıra her iki taraf için yükleyin. Emniyet kapak üst arabellek odasına düzeltmek.
2. Müşteri adaylarını kırmızı-kırmızı ve siyah-siyah renk kodlu eşleşen güç kaynağına bağlayın. Jel boya normal ~ 70 dk için tanımlanmış bir konuma ulaşana kadar 110 V sabit bir gerilim çalıştırın.
   Not: Gerilim ve çalışan zaman PCR ürünleri büyüklüğüne göre ayarlanabilir.

5. gümüş sigara-Polyacrylamide jel içinde SSR işaretleri algılamak için boyama

1. Elektroforez sonra bir büyük kabı üzerinden kapak üst odası arabelleğinden drenaj. Yan kelepçeler ayırmak, tabakları cihazları kaldırmak, dikkatle çentikli cam levha bir kenarı boyunca bir spatula ile ayırmak ve diğer cam levha bağlı jel kalır bağlama silane ile kaplı olduğundan emin olun.
2. AgNO₃ ' te 1 litre dH₂O. hazırlamak 1 L / taze geliştirme çözümü 1,5 g NaOH 10 g dH₂O 900 ml çözülerek çözülerek taze emprenye çözüm 1 L yapmak, 1 mL % 37 formaldehit ekleyin ve 1 L dH₂O. kullanarak son bir seviyesini ayarlamak
   Not: eldiven giymek ve yukarıdaki kimyasallar ve çözümleri itina ile başa. Çözümler ve çözümleri ile ilgili adımlar bıraktığımız gerek yoktur.
3. Dikkatle jel ve cam plaka Elektroforez arabellek kaldırma sonra plaka jel plastik bir tepsi yukarı dönük olacak şekilde yerleştirin ve emprenye çözüm 1 litre jel daldırın geniş dH₂O ile yıkayın. Tepsiyi bir shaker koymak.
4. Tepsiyi hafifçe 60 r/dk 3-4 dk için salla.
   Not: Saat sallayarak jel kalınlığı ve emprenye çözümde gümüş nitrat yoğunluğuna göre ayarlanabilir.
5. Emprenye çözüm dışarı plaka taşımak ve başka bir tepsi koydu. Plaka ve geniş dH₂O iki kez 3-5 s için her kullanarak jel yüzeyi kapalı kalan emprenye çözümden durulayın.
6. Yukarı dönük olacak şekilde başka bir tepsi jel ile plaka koyun, geliştirme çözüm, 1 L plaka daldırın sonra tepsiyi hafifçe 50 r/dak ~ 3 dakika DNA görünümünü parçaları monitör süreyle sallamak. ve en yüksek oranı sinyal DNA parçaları geliştirme durdurur arka plan gürültü görülmektedir (Bu adım ~ 3 dakika sürer).
7. Plaka ve jel ile geniş dH₂O iki kez durulama ve jel tabak kağıt mendil ile kurulayın.
8. Uygun bir tarayıcı kullanarak jel inceden inceye gözden geçirmek. 300 dpi çözünürlüğe DNA parçalarının açık bir görselleştirme verir. Jel de bir kamera ile fotoğrafı olabilir.
9. SSR işaretleri bantlama deseni tabanlı görüntü DNA parçalarının üzerinde toplam.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

PCR amplicons çiçekli Çin lahanası ve tütün ilgili SSR astar çiftleri kullanılarak üretildi. Elektroforez sonra belirsizliğe yer bırakmadan SSR işaretleri (şekil 1) bantlama şekillerinin Algılandı iletişim kuralı boyama yukarıdaki gümüş kullanarak polyacrylamide jeller lekeli.

Farklı gümüş protokolleri boyama algılama verimliliğini karşılaştırmak için PCR ürünleri ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Jel yıkandıktan sonra emprenye kritik bir adımdır. Yetersiz yıkama zaman ve su hacmi plaka ve jel yüzeyi üzerinde emprenye çözüm eksik kaldırılmasına neden ve karanlık bir arka planda neden. Uygun gelişmekte olan zaman başka bir önemli adım, aşırı geliştirme koyu kahverengi arka plan DNA parçalarının düşük kontrast görüntü ile sonuçlanabilir. Buna ek olarak, emprenye adım DNA parçalarının boyama verimliliğini önemli ölçüde etkiler. Her ne kadar boyama kalite emprenye süresi 5 dk ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
PCR master mix (Green Taq Mix)	Vazyme Biotech Co. Ltd, China	#P131-03
50-2000 bp DNA Ladder	Bio-Rad, USA	#170-8200
DL500 DNA marker	Takara Bio Inc., Japan	#3590A
Tris base	Sangon Biotech Shanghai, China	#77-86-1
Boric acid	Sangon Biotech Shanghai, China	#10043-35-3
EDTA-Na2	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#6381-92-6
Acrylamide	Sangon Biotech Shanghai, China	#79-06-1
N,N'-methylene-bis-acrylamide	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-26-9
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-18-9
Ammonium persulfate	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#7727-54-0
Bind-silane	Solarbio Beijing, China	#B8150
AgNO3	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China	#7761-88-8
Formaldehyde	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#50-00-0
NaOH	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#1310-73-2
Acetic acid	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#64-19-7
Na2CO3	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#497-19-8
Ethanol	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#64-17-5
HNO3	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#7697-37-2
Na2S2O3.5H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China	#10102-17-7
Eriochrome black T(EBT)	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#1787-61-7
Plastic tray	Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China	-
TS-1 Shaker	Qilinbeter JiangSu, China	-
BenQ M800 Scanner	BenQ, China	-
DYY-6C Power supply	Beijing Liuyi Instrument Factory, China	-
High throughout vertical gel systems, JY-SCZF	Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China	-