Un rapide argent coloration protocole permettant Simple et efficace détection de marqueurs microsatellites à l’aide d’un Gel de Polyacrylamide Non dénaturants

Résumé

Nous rapportons ici un protocole qui nécessite seulement trois réactifs et 7 min de traitement et est adapté pour la Géneration rapide des données de SSR de qualité dans l’analyse génétique de coloration à l’argent simple et peu coûteuse.

Résumé

Simple Sequence Repeat (SSR) est un des marqueurs plus efficaces utilisés dans la recherche en génétique animale et végétale et des programmes de sélection moléculaire. Coloration à l’argent est une méthode largement utilisée pour la détection des marqueurs dans un gel de polyacrylamide. Cependant, les protocoles classiques coloration à l’argent sont techniquement exigeants et chronophage. Comme de nombreux autres laboratoires biologiques techniques, protocoles de coloration à l’argent ont été constamment optimisés pour améliorer l’efficacité de la détection. Nous rapportons ici une coloration méthode significativement réduit les coûts de réactif et améliore la clarté de la résolution et la photo de détection simplifié à l’argent. La nouvelle méthode nécessite deux étapes principales (imprégnation et développement) et trois réactifs (nitrate d’argent, d’hydroxyde de sodium et formaldéhyde) et seulement 7 min de traitement pour un gel de polyacrylamide non dénaturant. Par rapport aux protocoles indiqués précédemment, cette nouvelle méthode est plus facile, plus rapide et utilise moins de réactifs chimiques pour la détection de la SSR. Par conséquent, ce protocole de coloration à l’argent simple, peu coûteux et efficace bénéficiera de cartographie génétique et la sélection assistée par une génération rapide de données marqueur SSR.

Introduction

Le développement de marqueurs PCR a révolutionné la science de la génétique des plantes et reproduction¹. Marqueurs microsatellites (SSR) sont parmi les marqueurs d’ADN plus polyvalents et les plus couramment utilisés. Leur génome large couverture, abondance, spécificité du génome et répétabilité sont quelques-uns des mérites des microsatellites en plus de leur héritage codominant pour la détection des hétérozygotes génotypes². Plusieurs études ont utilisé des microsatellites pour étudier la diversité génétique, suivre ascendance, établir des cartes de liaison génétique et cartographier les gènes pour les caractères économiquement importants^3,4.

Produits PCR des microsatellites sont couramment séparés par électrophorèse sur agarose ou gel de polyacrylamide et puis visualisées avec coloration à l’argent ou sous une lumière UV après coloration au bromure d’éthidium. Coloration à l’argent de fragments d’ADN en gels de polyacrylamide est plus sensible que les autres coloration méthodes^5,6 et a été largement utilisée pour détecter des fragments d’ADN comme marqueurs SSR⁷.

Comme de nombreuses techniques de laboratoire d’analyses biologiques, coloration à l’argent des gels de polyacrylamide a augmenté depuis son tout d’abord rapporté qu’une technique de visualisation de fragment dans 1979⁸. La technique a été initialement modifiée pour la détection de fragments d’ADN par Bassam al. ⁶ en 1991 et ensuite amélioré par Sanguinetti et collaborateurs⁹ en 1994. La méthode a été optimisée en dernier quelques décennies^{6,7,9,10,11,12,13,14 , 15}. Toutefois, la plupart de ces versions mises à jour des protocoles ont encore quelques inconvénients tels que la forte demande technique et long temps pour fixation de traitement et montage⁶, qui limitent l’application de ces protocoles^{7, 11}. Un protocole optimal qui allie faible coût avec le rendement élevé de détection de fragment d’ADN est absolument nécessaire pour l’application systématique de coloration dans la recherche biologique à l’argent.

En outre, gel de polyacrylamide peuvent être divisée en dénaturants et non-dénaturisation de gels de polyacrylamide, et les deux peuvent être utilisés pour la détection des marqueurs à l’aide de la méthode de coloration à l’argent. L’effet et la résolution qui ne diffèrent pas significativement, mais non-dénaturisation de gels de polyacrylamide sont plus faciles à traiter et prendre moins de temps¹⁶.

Sur la base de la recherche précédente¹⁵, l’objectif de la présente étude est de décrire une coloration protocole en détail pour la détection rapide, facile et peu coûteux des microsatellites dans un gel de polyacrylamide non dénaturants optimisée à l’argent.

Protocole

1. préparation des produits PCR des microsatellites

1. Préparer tous les produits chimiques et réactifs pour les réactions de PCR dont l’ADN modèle (30 ng/µL), mélange maître de PCR × 2 (contenant 2 × PCR tampon, 0,4 mM de chaque dNTP, 3 mM de MgCl₂, 0,1 U/µL de l’ADN polymérase Taq et colorants), 10 µM de chacun avant et marche arrière amorces et eau distillée ou désionisée (dH₂O).
   NOTE : Les marqueurs utilisés dans la présente étude ont été PT51333 (séquence d’amorce en avant : 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' et séquence inverse apprêt : 5 « - TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3 ») et PT50903 (séquence d’amorce en avant : 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' et amorce sens inverse : 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ') pour le tabac et CX-43 (séquence d’amorce en avant : 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' et inverser la séquence d’amorce : 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3') et CX-157 (séquence d’amorce en avant : 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' et d’inverser la séquence de l’amorce : 5 « - GGACAGCTTCACACATTTGC - 3 ») de chou chinois floraison.
2. Préparer 10 µL du mélange PCR amplification en ajoutant 2 µL de l’ADN, 5 µL du mélange maître de PCR × 2, 0.2 µL de chaque amorce vers l’avant et l’inverse amorce et 2,6 µL de dH₂O.
3. Effectuer la réaction d’amplification PCR dans un thermocycleur avec une étape initiale de 94 ° C pendant 5 min, procédez par 38 cycles de 45 s à 94 ° C pendant la dénaturation, 45 s à 55 ° C pour apprêt recuit et 1 min à 72 ° C pendant l’extension et une étape finale extension de 10 min à 72 ° C ; puis stockez les produits de PCR à 4 ° C pour une utilisation ultérieure.

2. préparation des Solutions de Polyacrylamide Gels Casting

1. Préparer 1 L de 5 × TBE tampon en dissolvant 54 g de base Tris et 27,5 g d’acide borique dans dH₂O, en ajoutant 20 mL d’EDTA 0,5 M (pH 8,0) et en ajustant la solution pour un volume final de 1 000 mL avec dH₂O.
   Remarque : Le tampon TBE peut être stocké à température ambiante pendant des mois.
2. Préparer 2 L de tampon TBE 0,5 × en ajoutant 200 mL de tampon TBE × 5 dH₂O pour un volume final de 2 L et conserver à température ambiante.
3. Préparer une solution de gel de polyacrylamide non dénaturants 6 % en dissolvant 29 g d’acrylamide grade de biologie moléculaire et 1 g de qualité biologie moléculaire N, N'-methylenebisacrylamide dans le tampon TBE × 0,5 pour un volume final de 500 mL. Couvrir le flacon de solution avec le papier d’aluminium et de conserver à 4 ° C pour une utilisation ultérieure.
   ATTENTION : L’Acrylamide est considéré comme une puissante neurotoxine et doit être manipulé avec soin. Toujours porter des gants pour le pesage de poudre et des solutions de manutention qui le contiennent.
4. Préparer une solution à 20 % d’ammonium persulfate (APS) dissoudre 2 g de APS avec dH₂O pour un volume final de 10 mL. Il peut être stocké à-20 ° C pour le mois.
   Remarque : Pour plus de commodité, 10 mL de solution APS 20 % peut être aliquoté dans 1,5 mL ou 2 mL de tubes à centrifuger pour conservation à-20 ° C. Décongeler et bien mélanger avant utilisation.
5. Préparer une solution diluée de bind-silane en dissolvant 3 µL de bind-silane en 0,997 mL d’éthanol à 95º contenant 0,5 % d’acide acétique. Il peut être stocké à 4 ° C pendant des semaines.
   ATTENTION : Bind-silane est toxique, portez des gants lorsque vous manipulez la solution et garder la chambre ventilée.

3. préparation des Gels de Polyacrylamide pour l’électrophorèse

1. Laver un ensemble de plaques de verre et les entretoises avec un détergent dans l’eau du robinet, suivie d’un rinçage complet avec dH₂Air O. sécher les plaques en les définissant dans une plaque Etendoir.
2. Disperser, 1 mL de solution de bind-silane sur la surface intérieure de la dalle de verre rectangulaire et sec pendant 5 min.
   Remarque : Si la solution de bind-silane n'est pas répartie uniformément sur la surface de la plaque, le gel peut être détaché pendant la coloration et entraîner un effet de coloration insatisfaisant.
3. Disperse 1 mL de repousser-silane sur la surface intérieure d’une plaque de verre cranté avec un écouvillon, essuyer l’excès repousser-silane avec papier de soie et laisser sécher pendant 5 min.
   Remarque : Si le repel-silane ne pas uniformément enduire la surface de la plaque de verre, cela pourrait endommager le gel en privant partiellement.
4. Assembler les plaques de verre avec entretoises avec la plaque de l’encoche sur le dessus et serrez les deux côtés de l’Assemblée avec coulée de pinces.
5. Versez la quantité appropriée (40 mL) de solution d’un gel de polyacrylamide non dénaturants 6 % dans un bécher pour l’ensemble de la plaque de largeur 33 cm × 10 cm de hauteur et entretoise épaisseur de 1,5 mm, ajouter 20 µL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) et 200 µLfresh 20 % APS et mélanger doucement.
   Remarque : La quantité appropriée (40 mL) de solution de gel a été calculée à partir du volume interne des deux plaques d’entretoises (30 cm sur 8,5 cm × 0,15 cm) d’épaisseur. En ce qui concerne la quantité de TEMED et APS pour la polymérisation du gel, il y a un rapport standard de la solution de gel TEMED et APS basé sur la référence¹⁷. La solution de gel décrite ci-dessus est stockée à 4° C. Si la solution de gel est stockée à température ambiante, 20 µL de TEMED et 100 µL de 20 % APS doit être utilisé. Remuer doucement le mélange de la solution de gel avec une baguette de verre pour éviter les bulles d’air dans la solution.
6. Versez la solution immédiatement et soigneusement dans les plaques de verre assemblées le long du bord de la plaque à encoche, remplir l’espace presque jusqu’au sommet et insérer le peigne. Ajouter un petit volume de solution de gel sur le peigne.
   NOTE : Gardez les plaques de verre horizontal pour éviter le gel de la fuite. Éliminez les bulles avec un crochet de bulle, si nécessaire.
7. Laisser le gel à durcir durant 30 min à température ambiante.
   NOTE : Le temps de polymérisation peut changer avec la température de la solution de gel et de l’environnement.
8. Une fois le gel est entièrement polymérisation, retirer les pinces de coulée et positionner la plaque sertie dans l’unité de cuve d’électrophorèse de la plaque crantée orienté vers le réservoir tampon supérieur et grand étau pour fixer la plaque réglé sur l’unité du réservoir.
9. Versez 1 L de tampon TBE 0,5 × dans chacun de la tige et les cavités inférieures. Retirer le peigne et rincer tous les puits avec un tampon à l’aide d’une pipette ou une seringue.
   Remarque : Veiller à ce que le gel "sandwich" en bas de la plaque est complètement trempée dans un tampon sans les bulles.

4. DEROULEMENT gelées

1. Charger environ 1 µL du produit PCR dans chaque puits du gel polyacrylamide. Charger une échelle de taille d’ADN sur les deux côtés du gel ainsi que des échantillons de produits PCR. Fixer le couvercle de sécurité à la chambre supérieure de tampon.
2. Connectez les câbles d’alimentation, correspondant à la couleur rouge à rouge et noir sur noir. Exécutez le gel à une tension constante de 110 V jusqu'à ce que le colorant atteint une position définie, normalement pendant environ 70 min.
   NOTE : Le temps de la tension et la course est réglable selon la taille des produits PCR.

5. coloration pour la détection de marqueurs microsatellites dans un Non-Gel de Polyacrylamide à l’argent

1. Après électrophorèse, vider la mémoire tampon de la chambre haute dans un grand bécher via la vanne. Détacher les pinces de côté, retirer les plaques de l’appareil, soigneusement séparer la plaque de verre entaillé le long d’un côté avec une spatule et veillez à ce que le gel reste attaché à l’autre plaque de verre recouverte de bind silane.
2. Faire 1 L de solution d’imprégnation fraîches en dissolvant 1,5 g de AgNO₃ dans 1 L de dH₂O. préparer 1 L de solution de développement fraîches dissoudre 10 g de NaOH dans 900 mL de dH₂O, ajouter 1 mL de 37 % de formaldéhyde et s’adapter à un volume final de 1 L à l’aide de dH₂O.
   NOTE : Porter des gants et manipuler les produits chimiques ci-dessus et les solutions avec soin. Il n’est pas nécessaire de conserver les solutions et les étapes correspondantes avec les solutions dans l’obscurité.
3. Rincez soigneusement la plaque de gel et verre avec ample dH₂O pour retirer le tampon d’électrophorèse, puis placer la plaque avec le gel vers le haut sur un plateau en plastique et submerger le gel dans 1 L de solution d’imprégnation. Placez le plateau sur un agitateur.
4. Secouez le plateau à 60 tr/min pendant 3-4 min.
   NOTE : Secouant de temps peut être ajustée selon l’épaisseur de gel et de la concentration de nitrate d’argent dans la solution d’imprégnation.
5. Déplacez le plateau hors de la solution d’imprégnation et le déposer sur un autre bac. Rincer la solution d’imprégnation résiduel hors de la surface de la plaque et le gel à l’aide d’ample dH₂O deux fois pour les 3-5 s de chaque.
6. Placer la plaque avec le gel vers le haut sur un autre plateau, plonger la plaque dans 1 L de solution de développement, puis secouez le plateau à 50 tr/min pendant environ 3 min. surveiller l’apparition de l’ADN des fragments et arrêter le développement lorsque le ratio le plus élevé du signal de l’ADN de fragments au bruit de fond est observée (cette étape prend environ 3 min).
7. Rincez la plaque et le gel avec un grand dH₂O deux fois et sécher la plaque de gel avec un papier de soie.
8. Scannez le gel à l’aide d’un scanner approprié. Une résolution de 300 dpi permet une visualisation claire de fragments d’ADN. Le gel peut également être photographié à l’aide d’une caméra.
9. Le marquage chromosomique des microsatellites peut être marqué basée sur les fragments d’ADN dans l’image.

Résultats

Les amplicons PCR ont été produits en utilisant les paires d’amorces SSR correspondantes en floraison pak-choï et le tabac. Après électrophorèse, les gels de polyacrylamide sont colorées à l’aide de l’argent qui précède souillant le protocole, qui a détecté sans ambiguïté les patrons des bandes des microsatellites (Figure 1).

Pour comparer l’efficacité de la détection des dif...

Discussion

Le lavage de gel après l’imprégnation est une étape cruciale. Volume de l’eau et le temps lavage insuffisant pourrait l’élimination incomplète des solution d’imprégnation sur la surface de la plaque et le gel et provoquer dans un fond sombre. Le temps de développement approprié est une autre étape clé, développement excessif peut se traduire par un fond brun foncé avec une image de faible contraste de fragments d’ADN. En outre, l’étape d’imprégnation altèrent l’efficacité coloration des fr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PCR master mix (Green Taq Mix)	Vazyme Biotech Co. Ltd, China	#P131-03
50-2000 bp DNA Ladder	Bio-Rad, USA	#170-8200
DL500 DNA marker	Takara Bio Inc., Japan	#3590A
Tris base	Sangon Biotech Shanghai, China	#77-86-1
Boric acid	Sangon Biotech Shanghai, China	#10043-35-3
EDTA-Na2	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#6381-92-6
Acrylamide	Sangon Biotech Shanghai, China	#79-06-1
N,N'-methylene-bis-acrylamide	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-26-9
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-18-9
Ammonium persulfate	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#7727-54-0
Bind-silane	Solarbio Beijing, China	#B8150
AgNO3	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China	#7761-88-8
Formaldehyde	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#50-00-0
NaOH	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#1310-73-2
Acetic acid	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#64-19-7
Na2CO3	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#497-19-8
Ethanol	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#64-17-5
HNO3	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#7697-37-2
Na2S2O3.5H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China	#10102-17-7
Eriochrome black T(EBT)	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#1787-61-7
Plastic tray	Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China	-
TS-1 Shaker	Qilinbeter JiangSu, China	-
BenQ M800 Scanner	BenQ, China	-
DYY-6C Power supply	Beijing Liuyi Instrument Factory, China	-
High throughout vertical gel systems, JY-SCZF	Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China	-