Быстро Серебряный пятнать протокол позволяет простой и эффективного обнаружения ССР маркеры с помощью Non Денатурирующий гель полиакриламида

Резюме

Здесь мы приводим простой и недорогой Серебряный пятнать протокол, который требует только три реагентов и 7 минут обработки и подходит для быстрого поколения высокого качества данных ССР в генетический анализ.

Аннотация

Просто повторить последовательность (ССР) является одним из наиболее эффективных маркеров, используемые в растительных и животных генетических исследований и молекулярных селекционных программ. Серебряный пятнать это широко используемый метод для обнаружения маркеров ССР в геле полиакриламида. Однако обычные протоколы для Серебряные пятная технически сложных и трудоемких. Как многие другие биологические лаборатории методики, Серебряные пятная протоколы неуклонно оптимизирован для повышения эффективности обнаружения. Здесь мы приводим упрощенная Серебряный пятнать метод, который существенно снижает затраты реагента и обнаружения резолюции и картина усиливает. Новый метод требует два важных шага (пропитка и развития) и три реагентов (нитрата серебра, гидроксид натрия и формальдегид) и только в 7 мин обработки для не Денатурирующий гель полиакриламида. По сравнению с ранее сообщалось протоколов, этот новый метод проще, быстрее и использует меньше химических реагентов для обнаружения ССР. Таким образом этот простых, недорогостоящих и эффективных Серебряный пятнать протокол выиграют генетическое картирование и селекции Селекция с помощью маркеров путем быстрого поколения ССР маркер данных.

Введение

Развитие на основе ПЦР маркеров революционизировало наука генетики растений и разведения¹. Среди наиболее часто используемые и наиболее универсальным ДНК маркеров простой последовательности повторить (ССР) маркеры. Их генома широкое освещение, изобилие, специфика генома и повторяемости являются некоторые из достоинств ССР маркеров в дополнение к их кодоминантного наследования для обнаружения гетерозиготных генотипов². Несколько исследований использовали ССР маркеры для изучения генетического разнообразия, отслеживать родословную, построить генетическая связь карт и карта гены для экономически важных черт^3,4.

Продукты PCR маркеров SSR обычно разделяются с помощью электрофореза агарозы или геля полиакриламида и затем визуализируется с Серебряный пятнать или под УФ света после окрашивания бромидом ethidium. Серебряный пятнать фрагментов ДНК в полиакриламидных гелей более чувствительны, чем другие пятная методы^5,6 и широко используется для обнаружения фрагментов ДНК как ССР маркеры⁷.

Как много методов биологической лаборатории серебро Окрашивание акриламидных гелей неуклонно улучшилось после ее первых сообщанными как метод визуализации фрагмента в 1979 году⁸. Техника первоначально была изменена для обнаружения фрагментов ДНК Бассам и др. ⁶ в 1991 году и затем улучшить Сангинетти и coworkers⁹ в 1994 году. Метод был оптимизирован в последние несколько десятилетий^{6,7,9,10,11,12,13,14 , 15}. Однако, большинство этих обновленных версий протоколов до сих пор некоторые недостатки, такие как высокий спрос технических и долго время для фиксации обработки и монтажа⁶, которые ограничивают применение этих протоколов^{7, 11}. Это оптимальный протокол, который сочетает в себе лоу кост с высокой эффективностью обнаружения фрагментов ДНК срочно необходима для обычного применения Серебряный пятнать в биологических исследованиях.

Кроме того гель полиакриламида можно подразделить денатурируя и не денатурации полиакриламидные гели, и оба могут быть использованы для обнаружения маркеров SSR с помощью Серебряный пятнать метод. Эффект и разрешение которых существенно не отличается, но не денатурации полиакриламидных гелей проще процесс и занять меньше времени¹⁶.

На основе предыдущих исследований¹⁵целью настоящего исследования является описать оптимизированный Серебряный пятнать протокол в деталях для быстро, просто и лоу кост обнаружения маркеров SSR-Денатурирующий гель полиакриламида.

протокол

1. Подготовка продуктов ПЦР маркеров SSR

1. Подготовка всех химических веществ и реактивов для ПЦР-реакции, включая шаблон ДНК (30 нг/мкл), 2 × ПЦР главный микс (содержащие 2 × буфер ПЦР, 0,4 мм каждого dNTP, 3 мм MgCl₂, 0.1 U/мкл полимеразы дна Taq и красители), 10 мкм каждого вперед и назад грунтовки и дистиллированной или деионизированной воды (dH₂O).
   Примечание: ССР маркеров, используемые в настоящем исследовании были PT51333 (вперед грунтовка последовательности: 5 ' - GCACCTTTGGTTATCCGACA - 3' и последовательность обратная грунтовка: 5 «- TGCTTTAAGTCATGTACCAAATTGA - 3») и PT50903 (вперед грунтовка последовательности: 5 ' - AAATTTCTTTCGGTGTGATAACTG - 3' и обратной последовательности грунтовка: 5'-AGAGACTGCCGTTTGATTTGA-3 ') для табака и CX-43 (вперед грунтовка последовательности: 5'-TGGGGATGTGAGCTTCTTCT-3' и обратить вспять грунтовка последовательности: 5' - AGGGTTCCTTTGGGGTGATA-3') и CX-157 (вперед грунтовка последовательности: 5 '- TCGACGCTGACTTCACTGAC-3 ' и обратной последовательности грунтовка: 5 «- GGACAGCTTCACACATTTGC - 3») для цветения китайская капуста.
2. Подготовка 10 мкл смеси ПЦР для амплификации, добавив 2 мкл шаблона ДНК, 5 мкл 2 × ПЦР Мастер микс, 0.2 мкл каждого вперед грунтовка и обратный грунтовка и 2.6 мкл dH₂O.
3. Выполняют реакции амплификации PCR в Термоциклер с начальным шагом 94 ° c за 5 мин, следуют 38 циклов 45 s на 94 ° C для денатурации, 45 s при 55 ° C для отжига праймера и 1 мин при 72 ° C для расширения и окончательное расширение шаг 10 мин при 72 ° C; Затем, храните продукты PCR на 4 ° C для последующего использования.

2. Приготовление растворов для полиакриламидные гели для литья

1. Подготовка 1 Л, 5 × КЭ буфера, растворяя 54 g Tris база и 27,5 г борной кислоты в dH₂O, добавив 20 мл 0,5 М ЭДТА (рН 8.0) и регулируя решение окончательное объемом 1 000 мл с dH₂O.
   Примечание: TBE буфер может храниться при комнатной температуре для месяцев.
2. Приготовить 2 Л, 0.5 × КЭ буфера путем добавления 200 мл 5 × КЭ буфера dH₂O в окончательный объем 2 Л и хранить при комнатной температуре.
3. Приготовляют раствор Денатурирующий гель полиакриламида 6%, растворяя 29 g молекулярной биологии класса акриламида и 1 g молекулярной биологии класса N, N'-methylenebisacrylamide в 0,5 буфере TBE × окончательный объемом 500 мл. Обложка решения бутылка с алюминиевой фольгой и хранить при 4 ° C для последующего использования.
   Предупреждение: Акриламид считается мощный нейротоксин и должны быть обработаны с осторожностью. Всегда надевайте перчатки при взвешивании порошок и решения, которые содержат его.
4. Подготовьте путем растворения 2 g APS с dH₂O окончательный объемом 10 мл 20% раствора Аммония пероксодисульфат (APS). Он может храниться при температуре-20 ° C для месяцев.
   Примечание: Для удобства, 10 мл 20% раствора APS может быть aliquoted в 1,5 мл или 2 мл пробирок для хранения при температуре-20 ° C. Размораживание и перемешайте перед использованием.
5. Приготовляют раствор разреженных bind силана, растворяя 3 мкл bind-силана в 0.997 мл 95% этиловом спирте, содержащий 0,5% уксусной кислоты. Он может храниться при температуре 4 ° C для недель.
   Предупреждение: Bind силана токсичных, надевайте перчатки при работе с решением и держать комнату проветривается.

3. Подготовка полиакриламидных гелей для электрофореза

1. В водопроводной воде, затем полный полоскания с dH₂O. воздух сухой плиты, установив их в тарелку, сушка для мыть один набор стеклянные пластины и прокладки с моющим средством.
2. Разогнать 1 мл раствора bind силан на внутреннюю поверхность прямоугольной стеклянной пластины и сухой за 5 мин.
   Примечание: Если bind силана решения не распространяется равномерно на поверхности пластины, гель может быть отключена во время окрашивания и привести к неудовлетворительной эффект окрашивания.
3. Разогнать 1 мл оттолкнуть силан на внутреннюю поверхность зубчатый стеклянной пластины с помощью тампона, стереть избыток оттолкнуть силана с папиросной бумаги и воздух сухой за 5 мин.
   Примечание: Если Отрази силана не равномерно пальто поверхности стеклянной пластины, это может повредить гель, частично зачистки.
4. Соберите стеклянные пластины с прокладки с зубчатая пластина на вершине и закрепите обе стороны Ассамблеи с литьем зажимы.
5. Налейте достаточное количество 6%-Денатурирующий гель полиакриламида решения стакан для набора пластина 33 см Ширина × высота 10 см и прокладку толщиной 1,5 мм (40 мл), добавить 20 мкл tetramethylethylenediamine (TEMED) и 200 µLfresh 20% APS и осторожно перемешать.
   Примечание: Соответствующее количество решения гелем (40 мл) была рассчитана из внутреннего объема двух пластин толщиной распорки (30 см × 8,5 × 0,15 см). Что касается количества APS и TEMED полимеризации геля существует стандартное соотношение решения гелем TEMED и APS, основанные на ссылку¹⁷. Решения гелем, описанные выше хранится при 4° C. Если решения гелем хранится при комнатной температуре, 20 мкл TEMED и 100 мкл APS должны использоваться на 20%. Аккуратно перемешайте смесь решения гелем с палкой стекла, чтобы избежать воздушных пузырей в решении.
6. Залейте раствор немедленно и тщательно в собранном стеклянные пластины вдоль края зубчатая пластина, заполнить пространство почти до вершины и вставить гребень. Добавьте небольшой объем решения гелем над гребнем.
   Примечание: Держите стеклянные пластины горизонтально для предотвращения гель от утечки. При необходимости удалите любые пузыри с крюком пузырь.
7. Разрешить гель для задания на 30 минут при комнатной температуре.
   Примечание: Время полимеризации может измениться с температурой решения гелем и окружающей среды.
8. После гель полностью полимеризации, снимите зажимы литья и положение пластины набор в танковом подразделении электрофорез с зубчатая пластина, обращенной к верхней буфера водохранилища и использовать большие зажимы для присоединения плита, набор в танковом подразделении.
9. Залейте 1 Л 0.5 × КЭ буфер, в каждой из верхней и нижней палат. Снимите гребень и тщательно промыть лунки с буфера с помощью шприца или пипетки.
   Примечание: Убедитесь, что гель сэндвич в нижней части пластины полностью замачивают в буфер без каких-либо пузыри.

4. Запуск гели

1. Загрузите 1 мкл ПЦР продукта в каждой скважине геля полиакриламида. Загрузите размер лестница ДНК для обеих сторон геля вместе с образцами продуктов ПЦР. Зафиксировать крышку безопасности к палате верхнего буфера.
2. Подключайте к сети питания, соответствующие цветом красный в красный и черный-черный. Побегите гель на постоянное напряжение 110 V, до тех пор, пока краска достигает определенной позиции, обычно на ~ 70 мин.
   Примечание: Время напряжения и работает можно отрегулировать согласно размер продуктов PCR.

5. Серебряный пятнать для обнаружения маркеров ССР в не полиакриламидный гель

1. После электрофореза Слейте буфер из верхней палаты в большой стакан через клапан. Отсоединить зажимы стороне, удалить пластины из аппарата, тщательно отделить зубчатый стеклянной пластины вдоль одной стороны с помощью шпателя и убедитесь, что остатки геля прилагается к стеклянной пластине покрытием с bind силана.
2. Сделать 1 Л раствора свежие пропитки, растворяя 1.5 g AgNO₃ в 1 Л dH₂O. подготовить 1 Л раствора свежие разработки, растворяя 10 г NaOH в 900 мл dH₂O, добавляют 1 мл 37% формальдегида и приспособиться к конечный объем 1 Л, с использованием dH₂O.
   Примечание: Надевайте перчатки и обрабатывать выше химических продуктов и решений с осторожностью. Нет необходимости поддерживать решения и соответствующие шаги с решениями в темноте.
3. Тщательно промойте гель и стеклянной пластины с достаточно dH₂O удалить буфер электрофореза, а затем установите пластину с гелем вверх на пластиковый лоток и погружать гель в 1 Л раствора пропитки. Поставьте лоток в шейкере.
4. Слегка встряхните лоток 60 r/мин для 3-4 мин.
   Примечание: Время встряхивания можно отрегулировать согласно толщины геля и концентрация нитрата серебра в растворе пропитки.
5. Переместить пластину из раствора пропитки и положил его на другой лоток. Промойте остаточного пропитки решение покинуть от поверхности пластины и гель, с помощью достаточно dH₂O дважды для 3-5 s.
6. Установите пластину с гелем вверх на другой лоток, опускайте пластины в 1 Л раствора развития, затем осторожно встряхнуть лоток в 50 r/мин ~ 3 мин монитор, внешний вид ДНК фрагментов и остановить развитие, когда самый высокий коэффициент сигнал ДНК фрагментов шума фона наблюдается (этот шаг занимает ~ 3 мин).
7. Промойте пластины и гель с достаточно dH₂O дважды и сухой пластину гель с папиросной бумаги.
8. Сканировать гель, используя соответствующие сканера. Разрешение 300 dpi дает четкие визуализации фрагментов ДНК. Гель также могут быть сфотографированы с помощью камеры.
9. Кромконаносящий шаблон ССР маркеров может быть забит на основе фрагментов ДНК в изображении.

Результаты

Ампликонов PCR были произведены с использованием соответствующих пар грунтовка ССР в цветущий китайская капуста и табак. После электрофореза полиакриламидные гели были пятнами, с использованием выше Серебряный пятнать протокол, который однозначно обнаружен диапазон...

Обсуждение

Стиральной гель после пропитки является важным шагом. Объем времени и воды недостаточно Стиральная может привести к неполному удалению пропитки решения на поверхности пластины и гель и привести в темном фоне. Соответствующее время развивающихся является еще одним ключевым шагом, чре?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PCR master mix (Green Taq Mix)	Vazyme Biotech Co. Ltd, China	#P131-03
50-2000 bp DNA Ladder	Bio-Rad, USA	#170-8200
DL500 DNA marker	Takara Bio Inc., Japan	#3590A
Tris base	Sangon Biotech Shanghai, China	#77-86-1
Boric acid	Sangon Biotech Shanghai, China	#10043-35-3
EDTA-Na2	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#6381-92-6
Acrylamide	Sangon Biotech Shanghai, China	#79-06-1
N,N'-methylene-bis-acrylamide	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-26-9
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine	Sangon Biotech Shanghai, China	#110-18-9
Ammonium persulfate	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#7727-54-0
Bind-silane	Solarbio Beijing, China	#B8150
AgNO3	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China	#7761-88-8
Formaldehyde	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#50-00-0
NaOH	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#1310-73-2
Acetic acid	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#64-19-7
Na2CO3	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#497-19-8
Ethanol	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#64-17-5
HNO3	Guangzhou Chemical Reagent Factory, China	#7697-37-2
Na2S2O3.5H2O	Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co.,Ltd, China	#10102-17-7
Eriochrome black T(EBT)	Tianjin DaMao Chemical Reagent Factory, China	#1787-61-7
Plastic tray	Shanghai Yi Chen Plastic Co., Ltd, China	-
TS-1 Shaker	Qilinbeter JiangSu, China	-
BenQ M800 Scanner	BenQ, China	-
DYY-6C Power supply	Beijing Liuyi Instrument Factory, China	-
High throughout vertical gel systems, JY-SCZF	Beijing Tunyi Electrophoresis Co., Ltd, China	-