İzometrik Contractility ölçüm tel Myography kullanarak fare mezenterik arter

Özet

Telli myograph teknik vasküler düz kas fonksiyonları ve ekran yeni ilaçlar araştırmak için kullanılır. Biz fare mezenterik arter izometrik contractility ölçme ve vasküler düz kas yeni gevşetici süzmek için detaylı bir protokol raporu.

Özet

Telli myograph teknik vasküler düz kaslar yanıt-e doğru depolarization, GPCR agonistler/inhibitörleri ve uyuşturucu. contractility değerlendirmek için kullanılır Vasküler düz kas fizyolojik fonksiyonları, vasküler hastalıklar hipertansiyon gibi patogenezi ve düz kas gevşetici ilaçlar gelişimi üzerinde birçok çalışma yaygın olarak kullanılır. Yaygın olarak kullanılan model hayvan hastalık modelleri ve genetiği değiştirilmiş suşları büyük bir havuz faredir. Biz fare mezenterik arter ayrıntılı izometrik kasılma ölçmek için bu yöntem tanıttı. Fare mezenterik direnç arter 1.4 mm segmentinin izole ve onun Lümen ile iki çelik tel geçirerek myograph odası üzerinde monte edilmiş. Denge ve normalleştirme adımlardan sonra gemi kesimi tarafından iki kez önce daralma tahlil bir yüksek-K⁺ çözüm potentiated. Bu yöntemde ilaç geliştirme uygulama örneği, fare mezenterik bir Çin bitki, lotus tohum (Nelumbo nucifera Gaertn.) embriyolar izole bir roman doğal madde, neoliensinine, gevşetici etkisi ölçülen arterler. Myograph odası üzerinde monte edilmiş gemi kesimleri ile a yüksek-K⁺ eriyik teşvik. İstikrarlı bir sürekli faz güç gerilim ulaştığı zaman toplu neoliensinine doz odasına eklenmiştir. Biz o neoliensinine düz kas kasılması, bir doz bağımlı gevşetici etkisi vardı böylece hipertansiyon karşı potansiyel etkinlik ayılar düşündüren bulundu. Buna ek olarak, gemi segment montaj sonra en az 4 saat hayatta kalmak ve çoğu zaman, biz önermek için yüksek-K⁺ çözüm tarafından indüklenen contractility korumak gibi tel myograph sistem uyuşturucu tarama zaman alan işlem için kullanılabilir.

Giriş

Burada kullanılan küçük gemi myograph sistem ölçmek için küçük direniş damarlarının iç çapı 100 400 µm. izole küçük gemiler için (yaklaşık 2 mm uzun) arasında değişen izometrik kasılma iki 40-µm çapı kablo tarafından eklenmiş ve o zamanlar oldu mikrometre tarafı ve dönüştürücü tarafı jaws sıralı olarak monte edilmiş. Bu myograph teknik ilk 1972¹ ' önerdi ve öncelikle Mulvany ve onun meslektaşları^2,3,4,5,6tarafından geliştirildi. Şimdi kararlı donanımları, kolay performans ve bir standart normalleştirme yordamı^7,8,9ile olgun bir tekniktir. Biz bazı değişikliklerle bu yöntem için fare mezenterik arter ölçümlerde kullanılan.

Vasküler düz kas hemen hemen tüm kan damarlarının duvarlarında hatları. Temel işlevleri çeşitli uyaranlara yanıt olarak Kuvvetleri kasılması ile oluşturmaktır. Vasküler düz kas normal contractility için kan basıncı düzenleme esastır ve beslenme ek¹⁰. Anormal kan basıncı sonuçları hastalıkları, hipertansiyon, kalp yetmezliği ve iskemisi. de dahil olmak üzere çeşitli Yönetmeliği Çeşitli çalışmalarda anormal kan basıncı her zaman işlevsel olmayan vasküler düz kas contractility^7,11,12,13ile ilişkili olduğunu düşündürmektedir. Myograph yöntemi izometrik contractility vasoconstrictors, inhibitörleri ve ilaçlar da dahil olmak üzere çeşitli uyaranlara tarafından indüklenen fare damarlarının incelenmesi sağlar. Başarılı ölçümleri daralma kan basıncı bakım ve yeni tedavi yaklaşımları keşfetmek için ve vasküler düz kas ilişkili hastalıkların patogenezinde mekanizmaları anlamamıza yardımcı olacaktır.

Birçok Çince otlar yaygın damar hastalıkları klinik tedavisi için kullanılmıştır; Ancak, onların etkili maddeler genellikle bilinmeyen kalır. Böylece, yalıtım ve etkili bileşenleri kimliği roman uyuşturucu gelişimi için çok önemli. Çoklu tel myograph teknoloji otlar aktif bileşenleri süzmek için basit bir yaklaşım sunmaktadır. Biz fare mezenterik arter daralma araştırmak için küçük gemi myograph sistemini kullanarak çeşitli çalışmalarda bildirdi ve doğal bileşikler ile Anti-hipertansiyon etkinlik^12,13,14tespit. Burada, biz ayrıntılı tarif protokol için myograph yöntemi ve lotus tohum (Nelumbo nucifera Gaertn.) embriyolar izole neoliensinine gevşetici etkisini değerlendirmek ¹⁴.

Protokol

Hayvan manipülasyonlar kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) modeli hayvan araştırma merkezi Nanjing Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. çözüm hazırlık

1. 137.0 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, 5.6 mM D-glukoz ve 10 mM HEPES, kullanarak HEPES Tyrode solüsyonu (H-T) hazırlamak pH 7.3 7.4.
2. Kalsiyum olmadan HEPES Tyrode çözüm hazırlamak (Ca^{2 +}-H-T ücretsiz) 140.6 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, 5.6 mM D-glukoz ve 10 mM HEPES, pH 7.3 7.4 kullanarak.
3. 124 mM 15.7 mM NaCl, 124,0 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, 5.6 mM D-glukoz ve 10 mM HEPES, pH kullanarak KCl (yüksek K⁺) kullanarak HEPES Tyrode solüsyonu hazırlayın 7.3 7.4.

2. deney hazırlık

1. H-T ve 37 ° C su banyosu kullanarak yüksek-K⁺ çözümler onceden.
2. Myograph sistem, veri edinme donanım ve bilgisayarı açın.
3. Dikkatle tüm myograph odaları 5 mL H-T çözeltisi ile doldurun.
4. Petri tabağı 4 ° C H-T ve Ca^{2 +}20 mL ile doldurulması-H-T çözümleri, sırasıyla ücretsiz ve depolamak buzda.
5. 10 cm boyalı Petri kabına 20 mL H-T çözeltisi ile doldurun ve oda sıcaklığında korumak.

3. fare mezenterik arter diseksiyonu

1. 8-12-hafta-yaşlı C57BL/6J kadın ya da erkek fare tarafından servikal çıkığı ötenazi. Fare yukarı bakacak şekilde, karın ile pin.
2. Karın % 70 etanol ile nemlendirin. O zaman, cilt makas ile ventral orta çizgi boyunca kasığından ve kesikler ilk kesik başından itibaren aşağıya doğru bacaklar her iki tarafta yapın. Cilt her iki tarafta çek; Karın zarını açmaya benzer insizyon olun.
3. Makas kullanarak, özofagus, iki nokta üst üste ve tamamen damarlara vücuttan beslenme ile gastrointestinal sistem izole etmek için diğer bağ dokusu kesmek.
4. Forseps ile izole segment kanı yıkamak için H-T 2.4 adımda hazırlanan ve yavaşça doku birkaç kez H-T çözümde Durulama soğuk içeren çanak içine taşıyın.
5. İzole segment içine 2.5 adımda hazırlanan kuşe Petri kabına aktarmak ve mezenterik arter diseksiyonu oda sıcaklığında gerçekleştirin.
6. Mide, değişir, ileum ve caecum yönünde düzeltmek ve mide ve caecum sırasıyla sol ve sağ tarafında, pin.
7. Mezenterik damarlara yatak germek ve bağırsak disseke mezenterik arterler ortaya çıkarmak için pin ile düzeltin.
   Not: Bu koşullar altında üstüne damar damar vardır.
8. Stereoskopik mikroskop iletim ışık kaynağında açmak ve arterler mikroskop altında incelemek. Tüm doku çözümde dalmış emin olun.
9. Forseps ile arterlerin çevresinde yağ dokuları klamp ve diseksiyon makasla keserek bağ dokusu arterler yalıtmak. Damarların yaralanmasına kaçının.

4. arteryel montaj

1. Aktarım ve mezenterik arter ağaç soğuk Ca^{2 +}sokmak-ücretsiz (2.4 adımda hazırlanan) H-T çözüm forseps ile aşırı arterler sıkma tarafından.
2. Arter 1.4 mm kısmı bir mezenterik arcade Bağırsak duvarına proksimal kesmek ve iki forseps bu arter parçasının her iki dikkatlice açın.
3. Paslanmaz çelik tel 2,5 cm uzunluğunda iki kesimi hazırlamak ve onları aynı çanak yerleştirin.
4. Forseps kullanarak atardamara bir ucunu yavaşça kelepçe ve dikkatlice iki tel, başka bir forseps yardımıyla tek tek arter lümen yerleştirin. Teller düz tutulur ve endotel dokunmayın emin olun.
5. İki forseps kullanarak, iki çelik teller dişli geminin dışında aynı anda kelepçe ve dikkatle gemi daha önce H-T çözüm (adım 2.3) ile dolu bir myograph odasına Petri kabına aktarın.
6. Jaws ayrı montaj için yer açmak için canı cehenneme. Her iki tarafında iki forseps kullanarak iki eklenen kablolardan biri klamp ve taşıyıcıyı çene boşluğu (Şekil 1A) koyun.
7. Her iki vidayı mikrometre (Şekil 1B) bağlı çene etrafında klempe tel sarın.
8. Sol taraftaki vidayı saat yönünde büküm tarafından tamir. Sağ forseps kullanarak Tel düzeltmek, daha sonra saat yönünde (Şekil 1 c) büküm sağ taraftaki vidayı düzeltmek. Gemi her zaman çene boşluğu içinde olduğundan emin olun, ama zarar görmemesi için çene dokunmayın.
9. Mikrometre (Şekil 1 d) kullanarak iki jaws kapatın. Onlar birbirleriyle ve sabitlenmemiş tel üst kısmında sabit tel olduğunu dokunma ama bu iki jaws yeterince yakın olduğundan emin olun.
10. Sağ taraftaki forseps kullanarak, dikkatle unscrewed Tel Dönüştürücü zorlamak için bağlı çene köşesinde katlayın ve sağdaki vida (Şekil 1E) etrafında saat yönünde kaydırmak. O zaman, vida saptamak. Tel sol tarafında bu adımı yineleyin ve sol taraftaki vidayı (Şekil 1F) düzeltin.
11. Biraz ayrı jaws dikkatle mikrometre (Şekil 1G) döndürerek hareket ettirin. Gemi germe kaçının. Forseps tel tel dönüştürücü yan yatay düzlemde de mikrometre tarafından taşımak için kullanın. Dikkatle iki çene arasındaki boşluğu sadece iki kablo ağırlayacak mikrometre döndürür.
12. Arterler diğer odaları üzerine takmak için 4.2-4.11 adımları yineleyin. Tüm odalar için RGB sinyali, odaları kapsar, % 100 oksijen kaynağı ve sıcaklık probu takın ve 37 ° C'ye ısınma başlangıç Grafik yazılımı açık ve kayıt işlemini başlatmak için Grafiği görünümü penceresinde Başlat düğmesine basın.
13. Yaklaşık 20 dk equilibrate.

5. normalleştirme

Not: deneysel koşullar standartlaştırmak amacıyla ve gemilerin güvenilir fizyolojik yanıt elde etmek için bir normalleştirme yordam gerekli¹⁵' tir. Aktif güç ve geminin iç çevresi arasındaki ilişkiyi göre Tel myograph sistemi takılı gemi^{5,8iç çevresi (IC) değerlendirmek için bir standart normalleştirme program vardır, 9}. Kısaca, IC (µm) hesapladığınızda, mikrometre okumak ve değeri X değeri ve dönüştürücü giriş çıkış için kuvvet, duvar gerilimi (mN/mm), dinlenme Yani, Y değeri olarak kullanılır. Program ile donatılmış bir eğri (x, Y) dönmek ve 100 mmHg (IC₁₀₀) transmural basınç için karşılık gelen IC hesaplamak. Gemi normalleştirilmiş iç çevresi (IC₁) için küme etkin yanıt maksimal ne zaman.

1. Kuvvetleri tüm kanallar için sıfıra küme aygıtta ve başka bir 1-2 min için equilibrate.
2. Normalleştirme ayarları seçin "DMT menüve parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın:
   Mercek kalibrasyon (mm/div): 0,36; Hedef basınç (kPa): 13,3; IC₁/IC₁₀₀: 0.9; Online ortalama süre (saniye): 2; Gecikme süresi (saniye): 60. DMT normalleştirme ayarları penceresini kapatmak için Tamam düğmesini tıklatın.
3. Kanal ilgi DMT menü bir DMT normalleştirme karşılık gelen kanal penceresini seçin. Sabit değerleri penceresine aşağıdaki gibi girin: doku endpoints a1: 0.1; Doku endpoints a2: 4; Tel çapı (µm): 40. Pencerenin 1,40 mm hesaplanan gemi uzunluğu görüntüler.
4. Uygun doku odası mikrometre okuyun. Mikrometre okuma kutusuna değer girin ve Noktası Ekle düğmesini tıklatın. Bu değer ilk (X0) X değeridir. Sonra 60 s gecikme süresi, kuvvet ve etkili basınç (ERTP) bu mikrometre değerine karşılık gelen pencerede görüntülenir. Aynı anda, mikrometre okuma kutusunu etkin hale gelir.
5. Saat yönünün tersi yönde mikrometre çevirerek normalleştirilmiş gemi germek. Mikrometre değer mikrometre okuma kutusuna girin ve Noktası Ekle düğmesini tıklatın. 60 dinleme için bekleyin tekrar s.
6. Adımları yineleyin 5.5, gemi germek ve pencere "onun IC₁gemi germek için gereken hesaplanan mikrometre ayardır mikrometre X₁" değerini görüntüler kadar ölçüm değerleri eklemek devam edin.
7. Mikrometre X₁ değeri ayarlayın.
   Not: Normalleştirilmiş gerilim genellikle 1-2 mN olduğunu.

6. arter daralma kayıt

Not: H-T ve yüksek-K⁺ çözüm bu bölümde kullanılan da dahil olmak üzere tüm çözümler adım 2.1 hazırlanmıştır.

1. Normalleştirme sonra 15-20 dk odasında gemi equilibrate.
   Not: Bu çözüm bu adımda değiştirmenize gerek yoktur.
2. Gemi yüksek-K⁺ çözüm ile iki kez meydan.
   1. Gemi meydan okumak için 5 mL daralma 10 dk, 3 - 4 kez 5 mL H-T çözeltisi ile yıkayarak takip için ikna etmek için yüksek-K⁺ çözeltisi ile H-T çözüm değiştirin.
      Not: Tipik daralma 3 mN ve 2.5 mN¹²etrafında sabit bir sürekli güç üzerinde bir maksimal kuvvet sahiptir. İlk challenge 2.5 mN aşağıda bir maksimal güç üretir veya sürekli gücü zamanla azalır veya ikinci sorun ilk doz daha daha daha düşük bir kuvvet oluşturur, gemi atılır ve daha fazla araştırma yapılması için kullanılmaz.
3. 5 mL daralma ikna etmek için yüksek-K⁺ çözeltisi ile gemi meydan. 5 dk sonra 0.5 µL neoliensinine hisse senedi çözüm (DMSO 10 mM)¹⁴ gemi 1 µM neoliensinine son bir konsantrasyon, dinlenmek için odasına ekleyin.
4. Kuvvet ne zaman istikrarlı (Bu genellikle birkaç dakika sürer), t oluşturmak için 4, 6, 8 ve 10 µM için konsantrasyonu artırmak için hisse senedi çözüm her zaman konsantrasyonu için 2 µM. eklemek 1 µL artırmak için odasına neoliensinine hisse senedi çözümü başka bir 0.5 µL Ekle o doz-yanıt eğrisi.
   Not: Stok ve çalışma konsantrasyonları ilaçlar arasında değişir.

Sonuçlar

Biz bir çok tel myograph sistemi kullanarak fare mezenterik arter izometrik contractility ölçülen ve lotus tohum (Nelumbo nucifera Gaertn.) embriyo saf neoliensinine gevşetici etkisi değerlendirildi ¹⁴. fare mezenterik direnç arter izole, bağ dokuların temizlenmesi ve 1.4 mm parça halinde kesilmiş. Arter segment Ca^{2 +}iki çelik teller tarafından eklenmiş-ücretsiz bir petri çözümde H-T ve sonra segment myograph odası (

Tartışmalar

Hipertansiyon ciddi komplikasyonlar kardiyovasküler dahil olmak üzere ve böbrek hastalıkları¹⁶nedeniyle yaygın halk sağlığı mücadeledir. Hipertansiyon patogenezinde anlama ve keşfetmek daha fazla Anti-Hipertansif İlaçlar Bu alandaki acil bir görev haline gelmiştir. Kan basıncı oluşturulur ve dolaşım periferik direnç tarafından yapılmaktadır. Poiseuille'nın kanunen nispeten küçük arterlerin dolaşım direnci büyük bir kısmı oluşturmak ve kan basıncı

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi wire myograph system	DMT	610-M
Stainless steel wire	DMT	400447
Geuder dissection scissor	DMT	400431
Dumont forceps	DMT	300413
PowerLab/8SP	ADInstruments	ML785
Software	ADInstruments	LabChart 5
NaCl	SigmaAldrich	S5886
KCl	SigmaAldrich	P5405
CaCl2	SigmaAldrich	C4901
MgCl2·6H2O	SigmaAldrich	M2393
D-Glucose	SigmaAldrich	G6152
HEPES	Sangon Biotech	A100511-0250
NaOH	SigmaAldrich	S8045
DMSO	SigmaAldrich	D2650