Medição de contratilidade isométrica da artéria mesentérica Mouse usando fio miografia

Resumo

A técnica de myograph do fio é usada para investigar as funções do músculo liso vascular e tela novas drogas. Nós relatamos um protocolo detalhado para medir a contratilidade isométrica da artéria mesentérica de rato e para a seleção de novos relaxantes do músculo liso vascular.

Resumo

A técnica de myograph do fio é usada para avaliar a contratilidade da musculatura de Lisa vascular em resposta à despolarização, GPCR agonistas/inibidores e drogas. É amplamente utilizado em muitos estudos sobre as funções fisiológicas do músculo liso vascular, a patogênese de doenças vasculares, como hipertensão e desenvolvimento de fármacos relaxante músculo liso. O rato é um animal modelo amplamente utilizado com uma grande piscina de doença modelos e variedades geneticamente modificadas. Nós introduzimos esse método para medir a contração isométrica de artéria mesentérica de rato em detalhe. Um segmento de 1,4 mm da artéria mesentérica resistência de rato foi isolado e montado em uma câmara de myograph, passando dois fios de aço por meio de seu lúmen. Após etapas de equilíbrio e normalização, o segmento de navio foi potencializado por uma solução de alta-K⁺ duas vezes antes do ensaio de contração. Como um exemplo da aplicação desse método no desenvolvimento de drogas, Nós medimos o efeito relaxante de uma substância natural romance, neoliensinine, isolado de uma erva chinesa, embriões da semente de Lótus (Nelumbo nucifera Gaertn.) no mouse mesentérico artérias. Os segmentos de embarcação montados na câmara de myograph foram estimulados com uma solução de alta-K⁺ . Quando a força de tensão atingiu uma fase estável e sustentada, doses cumulativas de neoliensinine foram adicionadas para a câmara. Encontramos que essa neoliensinine teve um efeito relaxante dose-dependente na contração do músculo liso, sugerindo assim, que tem atividade potencial contra a hipertensão. Além disso, como o segmento de navio pode sobreviver pelo menos 4 horas após a montagem e manter a contratilidade induzida pela solução high-K⁺ por muitas vezes, sugerimos que o sistema de myograph do fio pode ser utilizado para o moroso processo de despistagem de drogas.

Introdução

O sistema de myograph de pequeno vaso usado aqui foi para medir a contração isométrica dos vasos de resistência pequena com diâmetro interno que variam de 100 a 400 µm. isolados pequenos vasos (cerca de 2 mm de comprimento) foram inseridos por dois fios de diâmetro de 40 µm e foram então montado sobre as garras do micrômetro-lado e lado do transdutor sequencialmente. Esta técnica de myograph foi sugerida primeiramente em 1972¹ e então desenvolvida principalmente por Mulvany e seus colegas^2,3,4,5,6. Agora é uma técnica madura com equipamento estável, desempenho fácil e um padrão de normalização procedimento^7,8,9. Utilizamos este método com algumas modificações para medições na artéria mesentérica de rato.

Músculo liso vascular as linhas das paredes de quase todos os vasos sanguíneos. Sua função fundamental é gerar forças através da contração em resposta a vários estímulos. A contratilidade normal do músculo liso vascular é essencial para a regulação da pressão de sangue e nutrição complementar¹⁰. Regulamento anormal da pressão arterial resulta em uma variedade de doenças, incluindo hipertensão, insuficiência cardíaca e isquemia. Vários estudos têm sugerido que a pressão anormal de sangue sempre é associada com disfuncional músculo liso vascular contratilidade^7,11,12,13. O método myograph permite investigação da contratilidade isométrica dos navios de rato induzida por vários estímulos, incluindo vasoconstritores, inibidores e drogas. Medições bem sucedidas de contração nos ajudará a compreender os mecanismos de manutenção da pressão arterial e a patogênese de doenças associadas a músculo liso vasculares e explorar novas abordagens terapêuticas.

Muitas ervas chinesas têm sido amplamente utilizadas para tratamento clínico de doenças vasculares; no entanto, seus ingredientes eficazes geralmente permanecem desconhecidos. Assim, o isolamento e identificação dos componentes eficazes é muito importante para o desenvolvimento de novos medicamentos. Tecnologia multi fio myograph oferece uma abordagem simples para a seleção de componentes ativos em ervas. Nós temos relatado vários estudos utilizando o sistema de myograph de pequeno vaso para investigar a contração de artéria mesentérica de rato e identificados compostos naturais com atividade anti-hipertensão^12,13,14. Aqui, descrevemos o detalhada do protocolo para o método de myograph e avaliar o efeito relaxante do neoliensinine isolada de embriões de sementes de Lótus (Nelumbo nucifera Gaertn.) ¹⁴.

Protocolo

Manipulações de animais foram aprovadas pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade modelo Animal Research Center de Nanjing.

1. preparação da solução

1. Preparar a solução de Tyrode-HEPES (H-T) usando 137,0 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, 5,6 mM D-glicose e 10 mM HEPES, pH 7.3-7.4.
2. Preparar a solução de Tyrode HEPES sem cálcio (Ca^{2 +}-livre H-T) usando 140,6 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, 5,6 mM D-glicose e 10 mM HEPES, pH 7.3-7.4.
3. Preparar a solução de Tyrode HEPES usando 124 mM KCl (alta K⁺) usando 15,7 mM NaCl, 124,0 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, pH de 5,6 mM D-glicose e 10 mM HEPES, 7.3-7.4.

2. preparação do experimento

1. Pré-aqueça o H-T e High-K⁺ soluções usando banho maria a 37 ° C.
2. Ligue o sistema de myograph, o hardware de aquisição de dados e o computador.
3. Com cuidado, encha todas as câmaras de myograph com 5 mL de solução de H-T cada.
4. Preencher dois pratos de Petri com 20 mL de 4 ° C H-T e Ca^{2 +}-livre soluções H-T, respectivamente e armazenar no gelo.
5. Encha um prato de Petri 10 cm revestido com 20 mL de solução de H-T e mantê-lo em temperatura ambiente.

3. Mouse dissecação de artéria mesentérica

1. Eutanásia em um 8-12-week-old C57BL/6J masculino ou feminino do mouse por deslocamento cervical. Segure o mouse com o abdômen voltado para cima.
2. Umedeça o abdômen com etanol a 70%. Em seguida, cortar a pele com a tesoura ao longo da linha mediana ventral da virilha e fazer incisões desde o início da primeira incisão para baixo para as pernas em ambos os lados. Puxamos a pele para trás em ambos os lados; Faça incisões semelhantes para abrir o peritônio.
3. Com uma tesoura, corte o esófago, cólon e outros tecidos conectivos para isolar completamente o trato gastrointestinal com alimentação vasculatura do corpo.
4. Com fórceps, mova o segmento isolado na cápsula contendo o frio H-T preparado no passo 2.4 e delicadamente, lave o tecido na solução H-T várias vezes para lavar o sangue.
5. Transferir o segmento isolado para o prato de Petri revestida, preparado na etapa 2.5 e faz dissecação da artéria mesentérica em temperatura ambiente.
6. Suavizar o estômago, jejuno, íleo e ceco no sentido horário, e fixar o estômago e o ceco no lado esquerdo e direito, respectivamente.
7. Esticar a cama da vasculatura mesentérica e corrigir o intestino com pinos para expor as artérias mesentéricas dissecadas.
   Nota: Nestas condições, as artérias estão no topo das veias.
8. Ligue a fonte de transmissão de luz de um microscópio estereoscópico e dissecar as artérias sob o microscópio. Certifique-se de que o tecido inteiro está imerso na solução.
9. Prenda os tecidos adiposo em torno das artérias com fórceps e isolar as artérias cortando todos os tecidos conjuntivos com tesoura de dissecação. Evite ferir as artérias.

4. arterial montagem

1. Transferência e imergir a árvore de artéria mesentérica o frio Ca^{2 +}-livre solução do H-T (preparada na etapa 2.4), fixando as artérias em excesso com a pinça.
2. Corte uma parte de 1,4 mm da artéria proximal à parede intestinal de uma arcada mesentérica e usar duas pinças para abrir ambos os lados deste segmento de artéria cuidadosamente.
3. Prepare-se dois segmentos de 2,5 cm de comprimento de fio de aço inoxidável e colocá-los no mesmo prato.
4. Delicadamente, prenda uma extremidade da artéria usando fórceps e Introduza cuidadosamente os dois fios no lúmen da artéria um por um com a ajuda de outra pinça. Certifique-se que os fios são mantidos em linha reta e não toque o endotélio.
5. Usando duas pinças, prenda os dois fios de aço fora do navio roscado simultaneamente e transferir cuidadosamente o navio do prato de Petri a uma câmara de myograph anteriormente preenchida com solução de H-T (passo 2.3).
6. Que se lixe os mordentes separados para fazer espaço para montagem. Prenda os dois lados de um dos dois fios inseridos usando duas pinças e coloque o recipiente na abertura mandíbula (figura 1A).
7. Envolva ambos os lados do fio preso por parafusos da mandíbula conectado para o micrômetro (figura 1B).
8. Fixe o parafuso esquerdo girando no sentido horário. Endireitar o fio usando fórceps da direita e, em seguida, fixar o parafuso da direita girando no sentido horário (Figura 1). Certifique-se de que o navio está sempre dentro da abertura da mandíbula, mas não toque no queixo para evitar danos.
9. Feche as duas mandíbulas usando o micrômetro (Figura 1). Certifique-se que as duas garras estão perto o suficiente, mas que não tocam uns aos outros e que o fio não fixado na parte superior do fio fixo.
10. Usando a pinça direita, cuidadosamente dobre o fio retirado no canto da mandíbula conectado para forçar o transdutor e envolvê-la no sentido horário em torno do parafuso do lado direito (Figura 1E). Em seguida, fixe o parafuso. Repita essa etapa no lado esquerdo do fio e fixar o parafuso do lado esquerdo (Figura 1F).
11. Mova a mandíbula ligeiramente afastada girando cuidadosamente o micrômetro (Figura 1). Evite esticar o navio. Use a pinça para mover o fio no lado de micrômetro para o plano horizontal do fio ao lado do transdutor. Gire o micrômetro cuidadosamente para que a lacuna entre as duas garras só pode acomodar os dois fios.
12. Repita as etapas 4.2 – 4.11 para montar as artérias para as outras câmaras. Conecte todas as câmaras para o equipamento, cobrir as câmaras, anexar o fornecimento de oxigênio a 100% e uma sonda de temperatura e começar aquecendo-se a 37 ° C. Abra o software de gráfico e pressione o botão Iniciar na janela de Visualização de gráfico para iniciar a gravação.
13. Equilibrar-se por cerca de 20 min.

5. normalização

Nota: A fim de padronizar as condições experimentais e obter a capacidade de resposta fisiológica confiável dos navios, um processo de normalização é necessário¹⁵. De acordo com a relação entre a força activa e a circunferência interna do navio, o sistema de myograph do fio tem um programa de normalização de padrão para avaliar a circunferência interna (IC) do navio montado^{5,8, 9}. Brevemente, calcular IC (µm), ler o micrômetro e o valor de entrada como o valor de X e o transdutor de saída de força, ou seja, descansando a tensão parede (mN/mm), como o valor de Y. O programa irá retornar uma curva equipada de (X, Y) e calcular o IC correspondente à pressão transmural de 100 mmHg (IC₁₀₀). A embarcação é definida como a circunferência interna normalizada (IC₁) quando a capacidade de resposta ativa é máxima.

1. Conjunto de forças para zero para todos os canais no dispositivo e equilibrar por mais 1-2 minutos.
2. Selecione configurações de normalização do "menu DMTe configurar os parâmetros da seguinte forma:
   Calibração de ocular (mm/div): 0,36; Alvo de pressão (kPa): 13,3; IC₁/IC₁₀₀: 0,9; On-line com média de tempo (segundos): 2; Atraso de tempo (segundos): 60. Clique no botão para fechar a janela de Configurações de normalização de DMT Okey .
3. Selecione o canal de interesse do menu de DMT para abrir uma janela de normalização de DMT para o canal correspondente. Inserir os valores constantes na janela da seguinte forma: a1 de pontos de extremidade de tecido: 0.1; A2 de pontos de extremidade de tecido: 4; Diâmetro de fio (µm): 40. A janela exibe o comprimento do navio calculado como 1,40 mm.
4. Leia o micrômetro da câmara de tecido apropriado. Digite o valor na caixa de leitura do micrômetro e clique o botão Adicionar ponto . Esse valor é o valor inicial de X (X0). Depois de um tempo de atraso 60 s, a janela exibe a força e a pressão eficaz (ERTP) correspondente a esse valor de micrômetro. Simultaneamente, a caixa de leitura micrômetro se torna ativa.
5. Estica o navio sendo normalizado girando o micrômetro no sentido anti-horário. Digite o valor de micrômetro na caixa de leitura do micrômetro e clique o botão Adicionar ponto . Esperar por um tempo de atraso de 60 s novamente.
6. Repita a etapa 5.5, continuar a esticar o navio e adicionar valores de micrômetro até a janela exibe o valor de "micrômetro X₁", que é a configuração de micrômetro calculado necessária para esticar a embarcação para sua IC₁.
7. Defina o micrômetro para X o valor₁ .
   Nota: A tensão normalizada é geralmente 1-2 mN.

6. artéria contração gravação

Nota: Todas as soluções, incluindo o H-T e High-K⁺ solução usado nesta seção, foram preparadas na etapa 2.1.

1. Após a normalização, equilibrar o navio na câmara para 15-20 min.
   Nota: Estas é nenhuma necessidade de mudar a solução nesta etapa.
2. Desafie o recipiente com solução High-K⁺ duas vezes.
   1. Para desafiar o navio, substitua a solução H-T com 5 mL de solução de High-K⁺ para induzir a contração por 10 min, seguido por lavagem com 5 mL de solução de H-T 3 - 4 vezes.
      Nota: Contração típica tem uma força máxima sobre 3 mN e uma força constante e sustentada em torno de 2,5 mN¹². Se o primeiro desafio gera uma força máxima abaixo de 2,5 mN ou a força sustentada diminui com o tempo ou o segundo desafio gera uma força muito menor do que a dose pela primeira vez, o navio é Descartado e não será usado para investigação futura.
3. Desafie o vaso com 5 mL de solução de High-K⁺ para induzir a contração. Depois de 5 min, adicione 0,5 µ l de solução-mãe (10mm em DMSO) neoliensinine¹⁴ na câmara para relaxar o navio em uma concentração final de 1 µM de neoliensinine.
4. Quando a força é estável (isto geralmente leva vários minutos), adicionar outra 0,5 μL de solução-mãe de neoliensinine na câmara para aumentar a concentração de µ l 2 µM. adicionar 1 da solução-mãe cada vez para aumentar a concentração de 4, 6, 8 e 10 µM para gerar t curva de dose-resposta.
   Nota: O estoque e as concentrações de trabalho variam entre drogas.

Resultados

Podemos medir a contratilidade isométrica de artéria mesentérica de rato usando um sistema multi fio myograph e avaliou o efeito relaxante da neoliensinine purificado a partir de embriões de sementes de Lótus (Nelumbo nucifera Gaertn.) ¹⁴. a artéria mesentérica resistência do rato foi isolada, limpo dos tecidos conjuntivos e cortada em segmentos de 1,4 mm. O segmento de artéria foi inserido por dois fios de aço em Ca^{2 +}-livre solução...

Discussão

Hipertensão é um desafio da saúde pública generalizada devido a suas complicações graves, incluindo cardiovascular e renal doenças¹⁶. Compreender a patogênese da hipertensão e explorar mais anti-hipertensivos drogas tornou-se uma tarefa urgente neste campo. Pressão arterial é gerado e mantido pela resistência periférica da circulação. De acordo com a lei de Poiseuille, as relativamente pequenas artérias geram uma grande proporção de resistência circulatória e servem como o prod...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi wire myograph system	DMT	610-M
Stainless steel wire	DMT	400447
Geuder dissection scissor	DMT	400431
Dumont forceps	DMT	300413
PowerLab/8SP	ADInstruments	ML785
Software	ADInstruments	LabChart 5
NaCl	SigmaAldrich	S5886
KCl	SigmaAldrich	P5405
CaCl2	SigmaAldrich	C4901
MgCl2·6H2O	SigmaAldrich	M2393
D-Glucose	SigmaAldrich	G6152
HEPES	Sangon Biotech	A100511-0250
NaOH	SigmaAldrich	S8045
DMSO	SigmaAldrich	D2650