Mesure de la contractilité isométrique de l’artère mésentérique de souris à l’aide de fil myographie

Résumé

La technique de myographe fil est utilisée pour étudier les fonctions des muscles lisses vasculaires et les nouveaux médicaments écran. Nous rapportons un protocole détaillé permettant de mesurer la contractilité isométrique de l’artère mésentérique de souris et de dépistage des nouveaux décontractants de muscle lisse vasculaire.

Résumé

La technique de myographe fil sert à évaluer la contractilité des muscles lisses vasculaires en réponse à une dépolarisation, GPCR agonistes/inhibiteurs et drogues. Il est largement utilisé dans de nombreuses études sur les fonctions physiologiques du muscle lisse vasculaire, la pathogenèse des maladies vasculaires comme l’hypertension et le développement de médicaments relaxants musculaires lisses. La souris est un animal modèle largement utilisé avec une grande piscine de modèles de maladies et de souches génétiquement modifiées. Nous avons introduit cette méthode pour mesurer la contraction isométrique de l’artère mésentérique souris en détail. Un segment de 1,4 mm d’artère mésentérique résistance souris a été isolé et monté sur une chambre myographe en passant les deux fils d’acier dans sa lumière. Après les étapes de l’équilibration et la normalisation, le segment du navire était potentialisé par une solution riche en K⁺ deux fois avant l’essai de contraction. Comme exemple de l’application de cette méthode dans le développement de médicaments, nous avons mesuré l’effet relaxant d’une nouvelle substance naturelle, neoliensinine, isolée à partir d’une herbe chinoise, les embryons de la graine de lotus (Nelumbo nucifera Gaertn.) sur des souris mésentérique artères. Les segments vasculaires montés sur la chambre myographe sont stimulées avec une solution riche en K⁺ . Lorsque la tension de force a atteint une phase stable soutenue, des doses cumulatives de neoliensinine ont été ajoutés à la chambre. Nous avons trouvé que neoliensinine avait un effet relaxant dose-dépendante sur la contraction du muscle lisse, ce qui suggère qu’il porte une activité potentielle contre l’hypertension. En outre, que le segment du navire peut survivre au moins 4 heures après le montage et la maintenance de contractilité induite par la solution high-K⁺ pour plusieurs fois, nous suggérons que le système de myographe wire peut servir pour le long processus de dépistage des drogues.

Introduction

Le système de myographe petite embarcation utilisé ici était pour mesurer la contraction isométrique des navires de faible résistance avec des diamètres intérieurs allant de 100 à 400 µm. petits vaisseaux isolés (environ 2 mm de long) ont été insérés par deux fils de diamètre de 40 µm et ont ensuite été monté sur les mâchoires du transducteur-côté et micromètre séquentiellement. Cette technique myographe était la première fois suggérée en 1972¹ et puis développée principalement par Mulvany et ses collègues^2,3,4,5,6. C’est maintenant une technique mature avec Etables, aisée des performances et une normalisation standard procédure^7,8,9. Nous avons utilisé cette méthode avec quelques modifications pour les mesures dans l’artère mésentérique de souris.

Le muscle lisse vasculaire lignes les murs de presque tous les vaisseaux sanguins. Leur fonction fondamentale est de générer des forces par l’intermédiaire de contraction en réponse à divers stimuli. La contractilité normale du muscle lisse vasculaire est indispensable pour la régulation de la pression artérielle et nutrition supplément¹⁰. Règlement anormale de la tension artérielle se traduit par une variété de maladies, y compris l’hypertension artérielle, insuffisance cardiaque et l’ischémie. Plusieurs études ont suggéré que la pression artérielle anormale est toujours associée avec le muscle lisse vasculaire dysfonctionnel contractilité^7,11,12,13. La méthode myographe permet enquête de contractilité isométrique des vaisseaux de souris induite par des stimuli différents y compris vasoconstricteurs, les médicaments et les inhibiteurs. Des mesures réussies de contraction nous aidera à comprendre les mécanismes de maintien de la pression artérielle et la pathogenèse des maladies associées aux muscles lisses vasculaires et d’explorer de nouvelles approches thérapeutiques.

Beaucoup d’herbes chinoises ont été largement utilisées pour le traitement clinique des maladies vasculaires ; Cependant, leurs ingrédients efficaces restent généralement inconnues. Ainsi, l’isolement et l’identification des composants efficaces est très important pour le développement de nouveaux médicaments. Plusieurs fils myographe technologie offre une approche simple pour le dépistage des composants actifs dans les herbes. Nous avons signalé plusieurs études utilisant le système de myographe petit navire d’enquêter sur la contraction de l’artère mésentérique souris et identifié des composés naturels avec activité de lutte contre l’hypertension^12,13,14. Nous décrivons ici les modalités du protocole pour la méthode myographe et évaluer l’effet relaxant de neoliensinine isolé à partir d’embryons de graine de lotus (Nelumbo nucifera Gaertn.) ¹⁴.

Protocole

Des manipulations animales ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de modèle Animal Research Center de Nanjing.

1. préparation de la solution

1. Préparer une solution HEPES-Tyrode (H-T) à l’aide de 137,0 mM NaCl, KCl 2,7 mM, 1,8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, D-glucose à 5,6 mM et 10 mM HEPES, pH 7,3 à 7,4.
2. Préparer une solution HEPES-Tyrode sans calcium (Ca^{2 +}-libre H-T) à l’aide de 140,6 mM NaCl, KCl 2,7 mM, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, 5,6 mM D-glucose et 10 mM HEPES, pH 7,3 à 7,4.
3. Préparer une solution HEPES-Tyrode utilisant 124 mM KCl (High K⁺) à l’aide de 15,7 mM NaCl, KCl, 124,0 mM 1,8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, 5,6 mM D-glucose et 10 mM HEPES, pH 7,3 à 7,4.

2. préparation de l’expérience

1. Préchauffer le H-T et la solutions de High-K⁺ à l’aide d’un bain-marie à 37 ° C.
2. Allumez le système myographe, matériel d’acquisition de données et l’ordinateur.
3. Remplir soigneusement toutes les chambers myographe avec 5 mL de solution de H-T.
4. Remplir deux boîtes de Pétri avec 20 mL de 4 ° C H-T et Ca^{2 +}-gratuité haded solutions, respectivement et stocker sur la glace.
5. Remplir une boîte de Pétri couché 10 cm avec 20 mL de solution de H-T et maintenir à température ambiante.

3. souris Dissection de l’artère mésentérique

1. Euthanasier une souris femelle ou mâle de 8-12-week-old C57BL/6J par dislocation cervicale. Épinglez la souris vers le bas avec son abdomen vers le haut.
2. Humidifier l’abdomen avec l’éthanol à 70 %. Ensuite, couper la peau avec des ciseaux le long de la ligne médiane ventrale de l’aine et faire des incisions dès le début de la première incision vers le bas pour les jambes des deux côtés. Tirez la peau sur les deux faces ; faire des incisions similaires pour ouvrir le péritoine.
3. À l’aide de ciseaux, coupez l’oesophage, du côlon et autres tissus conjonctifs d’isoler complètement le tractus gastro-intestinal avec alimentation système vasculaire du corps.
4. Avec une pince, déplacez le segment isolé dans le plat contenant le froid haded préparées à l’étape 2.4 et rincer doucement le tissu dans une solution de H-T plusieurs fois pour laver le sang.
5. Transférer le segment isolé dans la boîte de Pétri enduit préparé à l’étape 2.5, puis effectuez la dissection de l’artère mésentérique à température ambiante.
6. Lisser l’estomac, jéjunum, iléon et le caecum dans le sens horaire, et la broche de l’estomac et le caecum sur le côté gauche et droit, respectivement.
7. Étirer le lit vasculaire mésentérique et difficulté de l’intestin avec des épingles pour exposer les artères mésentériques disséqués.
   Remarque : Dans ces conditions, les artères sont sur le dessus les veines.
8. Allumez la source de lumière de transmission d’un microscope stéréoscopique et disséquer les artères sous le microscope. Assurez-vous que le tissu entier est immergé dans la solution.
9. Serrer les tissus adipeux autour des artères avec une pince et isoler les artères en coupant tous les tissus conjonctifs avec des ciseaux de dissection. Ne pas blesser les artères.

4. artériel de montage

1. Transfert et plonger l’arbre de l’artère mésentérique dans le froid Ca^{2 +}-solution de H-T (préparée à l’étape 2.4) sans en pinçant les artères excédentaires avec une pince.
2. Couper une partie de 1,4 mm de l’artère proximale à la paroi de l’intestin d’une arcade mésentérique et utiliser deux pinces pour ouvrir des deux côtés de ce segment de l’artère avec précaution.
3. Préparer deux segments de fil d’acier inoxydable 2,5 cm de longueur et placez-les dans le même plat.
4. Serrer doucement une extrémité de l’artère à l’aide de pinces et insérez avec précaution les deux fils dans la lumière de l’artère un par un avec l’aide de pinces à un autre. Assurez-vous que les fils restent droites et ne pas touchent l’endothélium.
5. À l’aide de deux pinces, serrer les deux fils d’acier à l’extérieur du navire fileté simultanément et transvaser avec soin le navire de la boîte de Pétri à une chambre myographe précédemment remplie de solution H-T (point 2.3).
6. Vissez les mâchoires dehors pour faire de la place pour le montage. Serrer les deux côtés de l’un des deux câbles insérés à l’aide de deux pinces et placer le récipient dans le fossé de la mâchoire (Figure 1 a).
7. Enrouler les deux côtés du fil serré autour de la vis de la mâchoire connecté au micromètre (Figure 1 b).
8. Fixer la vis gauche en tournant dans le sens horaire. Redresser le fil à l’aide de pinces à droite, puis fixez la vis droite en tournant dans le sens horaire (Figure 1). Assurez-vous que le bateau est toujours à l’intérieur de l’écart de la mâchoire, mais ne pas toucher la mâchoire pour éviter tout dommage.
9. Fermer les deux mâchoires à l’aide du micromètre (Figure 1). Assurez-vous que les deux mâchoires sont assez proches mais qu’ils ne touchent pas les uns les autres et que le fil non fixée soit sur le dessus du fil fixe.
10. À l’aide de la pince droite, soigneusement plier le fil dévissé à l’angle de la mâchoire connectée pour capteur de force et enroulez-la dans le sens horaire autour de la vis de droite (Figure 1E). Ensuite, fixez la vis. Répétez cette étape sur le côté gauche du fil et fixez la vis à gauche (Figure 1F).
11. Déplacer la mâchoire légèrement écartée en tournant délicatement le micromètre (Figure 1). Éviter les étirements le navire. Forceps permet de déplacer le fil sur le côté du micromètre au plan horizontal du fil sur le côté du transducteur. Tourner soigneusement le micromètre pour que l’écart entre les deux mâchoires pouvant accueillir juste les deux fils.
12. Répétez les étapes 4.2 – 4.11 pour monter des artères sur les autres chambres. Connecter toutes les chambres à l’équipement, couvrir les chambres, attacher l’alimentation en oxygène de 100 % et une sonde de température et démarrer le chauffage à 37 ° C. Ouvrez le logiciel de cartographie et appuyez sur le bouton Démarrer dans la fenêtre d’Affichage graphique pour démarrer l’enregistrement.
13. Équilibrer pendant environ 20 min.

5. normalisation

Remarque : Afin d’uniformiser les conditions expérimentales et d’obtenir une réactivité physiologique fiable des vaisseaux, une procédure de normalisation est nécessaire¹⁵. Selon la relation entre la force active et la circonférence interne du navire, le système de myographe wire a un programme de normalisation norme pour évaluer la circonférence interne (IC) du navire monté^{5,8, 9}. Brièvement, calculer IC (µm), de lire le micromètre et d’entrer la valeur que la valeur de X et le transducteur de sortie force, c'est-à-dire, tension de la paroi (mm/mN), de repos tant que la valeur de Y. Le programme reviendra une courbe équipée de (X, Y) et calculer l’IC correspondant à une pression transmurale de 100 mmHg (IC₁₀₀). Le navire est sur la circonférence interne normalisée (IC₁) quand la souplesse active est maximale.

1. Positionnez les forces à zéro pour tous les canaux de l’appareil et équilibrer pendant 1-2 min.
2. Sélectionnez paramètres de normalisation à partir du "menu DMTet mettre en place les paramètres comme suit :
   Étalonnage de l’oculaire (mm/div) : 0,36 ; Cibler la pression (kPa) : 13,3 ; IC₁/IC₁₀₀: 0,9 ; En ligne avec une moyenne de temps (secondes) : 2 ; Temps (secondes) : 60. Cliquez sur le bouton OK pour fermer la fenêtre Paramètres de normalisation DMT .
3. Sélectionnez le canal d’intérêt dans le menu de la DMT pour ouvrir une fenêtre de normalisation DMT du canal correspondant. Entrez les valeurs constantes dans la fenêtre comme suit : tissu aboutissements a1 : 0,1 ; Tissu aboutissements a2 : 4 ; Diamètre de fil (µm) : 40. La fenêtre affiche la longueur du navire calculé que 1,40 mm.
4. Lire le micromètre de la chambre de tissu approprié. Entrez la valeur dans la zone de lecture de micromètre et cliquez sur le bouton Ajouter un Point . Cette valeur est la valeur initiale de X (X0). Après un temps de retard s 60, la fenêtre affiche la force et la pression effective (ERTP) correspond à cette valeur de micromètre. Simultanément, la boîte de micromètre lire devient active.
5. Étirer le navire étant normalisé en tournant le micromètre dans le sens anti-horaire. Entrez la valeur de micromètre dans la zone de lecture de micromètre et cliquez sur le bouton Ajouter un Point . Attendre un temps de retard de 60 s à nouveau.
6. Répétez l’étape 5.5, continuez à étirer le navire et ajoutez les valeurs de micromètre jusqu'à ce que la fenêtre affiche la valeur de « micromètre X₁», qui est le réglage micrométrique calculé pour étirer le navire à son IC₁.
7. Définissez le micromètre à X la valeur₁ .
   Remarque : La tension normalisée est habituellement 1 à 2 mN.

6. artère Contraction enregistrement

Remarque : Toutes les solutions, y compris H-T et solution High-K⁺ utilisées dans cette section, ont été préparées à l’étape 2.1.

1. Après normalisation, équilibrer le navire dans la chambre pendant 15-20 min.
   Remarque : Ces n’est pas nécessaire de changer la solution dans cette étape.
2. Défi du navire avec une solution riche en K⁺ deux fois.
   1. Pour défier le navire, remplacer haded solution avec 5 mL de solution de High-K⁺ pour provoquer la contraction pendant 10 min, lavé avec 5 mL de solution de H-T 3 - 4 fois.
      Remarque : Contraction typique a une force maximale sur 3 mN et une force constante et soutenue autour de 2,5 mN¹². Si le premier défi génère une force maximale inférieure à 2,5 mN ou la force soutenue diminue avec le temps ou le deuxième défi génère une force beaucoup plus faible que la dose de première fois, le navire est ignoré et ne servira pas pour plus d’investigations.
3. Contester le navire avec 5 mL de solution de High-K⁺ pour provoquer la contraction. Après 5 min, ajouter 0,5 µL de la solution mère (10 mM dans le DMSO) de neoliensinine¹⁴ dans la chambre pour se détendre le navire à une concentration finale de 1 µM neoliensinine.
4. Lorsque la force est stable (cela prend généralement quelques minutes), ajouter une autre 0,5 µL de la solution mère de neoliensinine dans la chambre pour augmenter la concentration de 2 µM. Ajouter 1 µL de la solution mère chaque fois d’augmenter la concentration de 4, 6, 8 et 10 µM pour générer t courbe de dose-réponse de HE.
   Remarque : Les actions et les concentrations de travail varient selon les médicaments.

Résultats

Nous avons mesuré la contractilité isométrique de l’artère mésentérique de souris en utilisant un système multi-fil myographe et évalué l’effet relaxant de neoliensinine purifiée à partir d’embryons de graine de lotus (Nelumbo nucifera Gaertn.) ¹⁴. l’artère mésentérique résistance de souris a été isolé, nettoyé des tissus conjonctifs et coupé en segments de 1,4 mm. Le segment de l’artère a été inséré par deux fils d’aci...

Discussion

L’hypertension est une faute très répandue de santé publique en raison de ses graves complications, notamment cardiovasculaires et les maladies de rein¹⁶. Compréhension de la pathogenèse de l’hypertension et l’exploration plus les médicaments antihypertenseurs sont devenue une tâche urgente dans ce domaine. La pression artérielle est générée et maintenue par la résistance périphérique de la circulation. Conformément à la Loi de Poiseuille, relativement petites artères génè...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Multi wire myograph system	DMT	610-M
Stainless steel wire	DMT	400447
Geuder dissection scissor	DMT	400431
Dumont forceps	DMT	300413
PowerLab/8SP	ADInstruments	ML785
Software	ADInstruments	LabChart 5
NaCl	SigmaAldrich	S5886
KCl	SigmaAldrich	P5405
CaCl2	SigmaAldrich	C4901
MgCl2·6H2O	SigmaAldrich	M2393
D-Glucose	SigmaAldrich	G6152
HEPES	Sangon Biotech	A100511-0250
NaOH	SigmaAldrich	S8045
DMSO	SigmaAldrich	D2650