19F NMR spektroskopi kullanarak Lipophilicity (logP) ölçüm için yeni bir basit Yöntem

Özet

Bir roman ve shake-balon yönteminin basit varyasyon Fluor bileşikleri doğru lipophilicity ölçüm için ¹⁹F NMR spektroskopisi tarafından geliştirilmiştir.

Özet

Fluorination biyoaktif bileşiklerin Fizikokimyasal özellikleri optimize etmek için etkili bir araç haline gelmiştir. Flor giriş uygulamalardan biri lipophilicity bahçedeki modüle etmektir. Bizim grupta fluorination lipophilicity alifatik fluorohydrins ve Fluor karbonhidratlar üzerinde etkisinin çalışmada ilgilendi. UV-aktif, zorlu bir lipophilicity tayini çıkan bunlar değil. Burada, ¹⁹F NMR spektroskopisi tarafından Fluor bileşikleri lipophilicity ölçümü için basit bir yöntem mevcut. Bu yöntem hiçbir UV-etkinlik gerektirir. Doğru çözünen kitle, solvent ve aliquot birim değildir ayrıca ölçülecek gerekli. Bu yöntemi kullanarak, çok sayıda flüorlu oluşturur ve karbonhidrat lipophilicities ölçülür.

Giriş

Lipophilicity ilaç adaylarının uyuşturucu çözünürlük, bioavailability ve toksisite¹de dahil olmak üzere birçok yönden özelliklerini etkileyen bir anahtar fizikokimyasal ilaç molekülleri parametresidir. Lipophilicity n-octanol ve su bölümleme sonra bileşik konsantrasyonları oranını logaritması (logP) ölçülür. En iyi lipophilicity aralıkları önerdi 5 Lipinski's "kuralı '' en ünlü örnek^2,3olduğu sözlü olarak yönetilen ilaçların istatistiki verilere dayalı. Gerçekten de, lipophilicity kontrol ilaç adaylarının umudu geliştirmek için temel olarak göstermiştir. Uyuşturucu bağlama benzeşimi tarafından yükseltilmiş lipophilicity artan uyuşturucu keşif projelerinde ana sorunlardan biri olarak son birkaç yılda yüksek yıpratma oranları³' e lider olduğu belirlendi. Bu nedenle, başarılı ilaç geliştirme sırasında benzeşimi en iyi duruma getirme işlemi^3,4moleküler lipophilicity ilaç adaylarının en uygun sınırları içinde tutma ile ilişkili olduğunu sürülmüştür. Bu bağlamda, yeni kavramlar (örneğin lipofilik verimlilik endeksi) tanıttı^5,6olmuştur.

Böylece doğru lipophilicity ilaç geliştirme süreci sırasında ölçmek için büyük önem taşımaktadır. Ayrıca, temel araştırma olarak talep lipophilicity ölçüm için basit yöntemleri durumu olduğunu amaçları için çözümler tanımlamak için oturumP modülasyon. Şu anda, çok sayıda kurulan yöntemleri lipophilicity belirlenmesi¹için erişilebilir. Standart 'shake-şişesi (SF)' Yöntem⁷ve türevlerini yaygın olarak günlükP değerleri doğrudan, hangi miktar için UV-VIS spektroskopisi bağlıdır çoğu durumda ölçmek için istihdam edilmektedir. Bu klasik SF yöntemin olumsuz yanı, emek yoğun doğası olduğunu. Buna ek olarak, emülsiyonlar oluşumu, özellikle son derece lipofilik bileşikler^8,9için oluşabilir. Akış enjeksiyon analiz, diyaliz boru, vbkullanarak gibi bu tür sorunları aşmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. ⁹,¹⁰. Ancak, bu yöntemlerden hiçbiri olmayan uzman laboratuvarlarda basit veya kolayca uygulanabilir.

Orada da birçok dolaylı Yöntem için kullanımı, potentiometric titrasyon¹¹, elektroforetik Yöntem^12,13, kromatografik yöntemler RP-HPLC tabanlı, kütle spektrometresi temelli yöntemleri¹⁴, gibi vb. GünlükP değerleri kalibrasyon eğrileri tarafından elde edilen gibi bunlar dolaylı yöntemlerdir. Çünkü Kullanıcı dostu ve zaman kazandıran bu yöntemler arasında RP-HPLC yöntemi yaygın olarak kullanılmıştır. Yine de, onun doğruluğunu kalibrasyon eğrisi kurmak için kullanılan eğitim kümesi üzerinde bağlıdır ve tahmini lipophilicity bölümü kullanılan sistem¹³tarihinde^,15bağlıdır.

Lipophilicity tayini için literatürde bildirilen ¹H NMR tabanlı yöntemleri vardır. Mo ve ark. ¹H NMR deuterated çözücüler olmadan kullanarak günlükP ölçü için bir yöntem geliştirdi. Su ve octanol, Bölüm solvent olarak referans olarak her aşama¹⁶çözünen konsantrasyon miktar için kullanılmıştır. Herth ve iş arkadaşları tarafından bölümü deneme nerede NMR veri alt D₂O sulu katmanın önce ve sonra dağıtım elde etmek için 1-octanol ile ekstraksiyon toplanmıştır doğrudan bir NMR tüp içinde oluştuğu bir yaklaşım da bildirdi katsayısı¹⁷. Ayrıca, Soulsby ve ark. ¹H NMR sinyallerin genlik genlik frekanslı tablo yazılımı için tam azaltma kullanarak belirleme bir analiz aracı olarak kullandı. Her iki katmanı genlikleri oranını ölçülen bölüm¹⁸katsayısı yol açtı. Bu yöntemler kullanmak ama genellikle uygun çözelti bastırılması sağlamak ve seçicilik sinyal için degrade bakliyat şeklinde seçici bakliyat ve güç seviyeleri kalibrasyonu veya kullanımı gerektirir nispeten kolaydır.

Bileşikler için hesaplanan günlükP (takunyaP) değerleri de edinilebilir. Birkaç hesaplama yöntemleri ve ticari olarak mevcut yazılım mevcuttur. Çok sayıda ilaç molekülleri değerlendirirken bu takunyaP değerleri ilaç endüstrisinde yaygın olarak kullanılır. Ancak, takunyaP değerleri gelen büyük hatalar nadir^19,20değildir.

UV-etkinlik konsantrasyon analizi için gereksinimleri ve kalibrasyon eğrileri günlükP hesaplaması için kurulması bu alanda araştırma ilerleme engel. Özellikle, UV etkin olmayan alifatik bileşikler için durum böyle. Fluorlu alifatik moieties son yıllarda giderek ilaç tasarımı için cazip hale gelmiştir ve tesisin genel lipophilicity onların etkisi bizim grup²¹bir araştırma konusu. Buna ek olarak, ¹⁹F ¹⁹F NMR Fluor bileşikleri analiz etmek için yararlı bir araç yapmak son derece hassas bir NMR aktif çekirdek olduğunu. Ayrıca ¹H. kıyasla daha geniş bir kimyasal üst karakter aralığı vardır Bu nedenle, ¹⁹F NMR spektroskopisi tarafından günlüğüP kararlılık UV etkin olmayan Fluor bileşikleri için basit bir yöntem geliştirmek için faydalıdır. Bu nedenle, bu yöntem genel amacı Fluor bileşikleri belirlenmesi uygun lipophilicity ulaşmaktır.

Bizim ¹⁹F NMR tabanlı yöntemi anahtar bölümü deneme (Şekil 1)²¹' bileşik bir flüorlu başvuru eklemek için ilkedir. Bileşik X ve başvuru bileşik (ref) su ve n- octanol arasında bölümlendirilir. Sıcaklığına sonra bir aliquot her aşamasından bir NMR tüp içine alınır ve ¹⁹F NMR deneyler her iki NMR örnekleri üzerinde çalıştırılır. Flor doruklarına yoğunluğunu konsantrasyon (C) ve flor atomları bileşikler (n) sayısı bileşik orantılıdır. Bileşik X ve ref arasında ayrılmaz oranları her iki aşama için elde edilebilir. N- octanol katmanında oranı ρ tanımlanır_Ekimve ρ_aq su katmanı (EQ 1) için. ρ değerleri oranı bileşik X ve ref (EQ 2) bölüm katsayıları (P) oranı eşittir. Bu günlük bileşik XP ölçümü için son Denklem (EQ 4) yol açar. Bu nedenle, günlük bilinmeyen bir bileşik X, sadece entegrasyon oranları (ρ_Ekim ve ρ_aq)P değerini belirlemek için her iki katmanı ¹⁹tarafından F NMR ölçülecek ihtiyaç vardır.

Protokol

1. bölümleme

1. 4,4,4-trifluorobutan-1-ol eklemek (X, ca. bileşik 6.0 mg) ve 2,2,2-trifluoroethanol (başvuru bileşik, ca. 3.0 mg) armut biçimli bir 10 mL şişe için n- octanol içinde erimesi (HPLC sınıf, ca. 2 mL) ve su ekleyin (HPLC sınıf, ca. 2 mL).
   Not: Bu deneme nüsha çalıştırılır. Su ve n- octanol bileşik çözünürlük kontrol edilmelidir. Bölüm için kullanılan bileşik miktarı dikkatle oversaturation bahçedeki herhangi bir katmanda önlemek için dikkate alınmalıdır. Bileşik X ve bileşik hakem de bu önlemek için kabul gerekir başvurusu arasındaki kütle oranı 10/1-1/10 aralığın dışında verilen NMR örneği ayrılmaz oranları vardır. Örneğin, bir fark ise < 2 günlükP adet bileşik X ve ref arasında en iyi kitle oranı temin ederim ki su ve 1-octanol NMR örnekleri Tümleştirme oranlarının 10/1-1/10 Aralık içinde vardır. Buna ek olarak, 50/1 bir katman bir entegrasyon oranı elde ettiyseniz, olacak daha büyük olasılıkla nispeten daha büyük hataları daha düşük konsantrasyon ile zirve için entegrasyonundaki. Aşağıdaki denklemi en uygun bileşik kütle oranı tahmin etmek için kullanılabilir:
   m_X / m_ref = {(cP X/P_ref)^-0,5 * (M_X/ M_ref) * [(1 + cP_X) / (1 + P_ref)]} / (N_X / N_ref)
   m, kitle; M, molekül ağırlığı; N, F atomu sayısı; P, Bölüm katsayıları; cP, hesaplanan bölüm katsayıları.
2. Şişeler bir ısı kontrollü receptacle yukarıda bir stirplate içine yerleştirin ve dolaşım bir soğutucu bağlayın. Bifazik karışımı 25 ° c için 2 h, 600 devir / dakikada ayarla hız karıştırma ile ilave edin.
3. 25 ° C'de izin vermek için bir gecede (ca. 16 h), karışımı tam faz ayrılması için equilibrate.
   Not: bazı durumlarda, n- octanol su sınırı arasındaki bir köpük oluşumu gözlenen. Bu durumda, karışımı 4 mL Cam şişe transfer ve köpük kaybolması kadar centrifuged. Sonra sol equilibrate yeniden 25 ° C'de gecede bifazik karışımı oldu.

2. NMR numune hazırlama

1. Şişeye bir imbik stand için bir kelepçe ile düzeltmek.
2. Bir aliquot ca. 0,70-0.85 ml hem su ve n- octanol katmanlar, uzun iğnelerle 1 mL tek kullanımlık plastik şırınga kullanarak al.
   1. Aliquot su almak, ca. hava 0,02 mL şırınga iğne karışım içine koymadan önce çizin. İğneyi üst n- octanol katmanı yoluyla su katmanına hareket ederken, yavaşça hava n- octanol çözüm iğne girmesini önlemek için itin.
   2. Uzun iğne karışım kaldırın. Su örneği, ca. örnek sol 0.6 mL şırıngada bırakarak küçük bir miktar atmak. Dikkatli bir şekilde Kuru doku iğneyle silin ve ca. 0,5 mL su örneği temiz NMR tüp içine enjekte. Hızlı bir şekilde NMR tüp bir kap ile kapatın.
   3. N- octanol örnek için n- octanol katmandan uzun iğne kaldırabilirsiniz. N- octanol örnek, ca. örnek sol 0.6 mL şırıngada bırakarak küçük bir miktar atmak. Dikkatle ve ca. 0,5 mL n- octanol örnek bir temiz NMR tüp içine enjekte iğne kuru doku ile silin. Hızlı bir şekilde NMR tüp bir kap ile kapatın.
3. Her iki n- octanol ve su örnekleri herhangi bir kirlenme için kontrol edin (Örn., küçük n- octanol su örneği veya küçük damlacıklar n- octanol örnek su damlacıkları).
   Not: herhangi bir kirlenme varsa, aliquot örnek yeniden bifazik karışım hazır olması gerekir. Nüsha ölçüm yapılır gibi altı NMR tüpler elde edilir.
4. Her NMR tüp için n- octanol ve su ile karışan deuterated bir NMR çözücü 0.1 mL ekleyin (Örn., aseton-d₆) sinyal kilit NMR alım sırasında etkinleştirmek için.
5. Düşük kaynama noktaları ile bileşikler için (Örn., < 120 ° C), bir darbe meşale kullanarak NMR tüpler mühür ve, soğutma sonra herhangi bir sızıntı için kontrol etmek için tüp tersine çevirin. Dikkatlice ters çevir'i ¹⁹F NMR için homojen bir çözüm elde etmek için 20 kez korumalı veya mühürlü NMR tüpler deneyleri.

3. NMR deneyler

1. Koş, standart NMR parametre ayarlarını kullanarak (NS 64, D1 1 s, SW 300 ppm, O1P-100 ppm), 4,4,4-trifluorobutan-1-ol (bileşik X) ve 2,2,2-trifluoroethanol (başvuru bileşik) her iki n kimyasal vardiya tanımlamak için ¹⁹F {¹H} NMR deneyler - octanol ve su NMR örnekleri.
2. Tanılama Flor çekirdek spin-kafes gevşeme zamanı (T1) bir inversiyon-kurtarma sırası²²kullanarak ölçün. Uygun darbe gecikme zamanı düzeyini ölçmek (≥ 5 ayarla D1 * T1) doğru nicel NMR tümleştirme için elde edilen T1 değerlerinden.
   Not: Bu çok zaman alıcı ama 60 D1 a s su faz örneği için ve 30 s octanol faz örnek için güvenli bir şekilde D1 yerine getireceğiz muhafazakar ayarı vardır ≥ 5 * T1 kriter.
3. ¹⁹çalıştırmak F {¹H} NMR deneyler tekrar ile parametre ayarları aşağıdaki gibi ayarlanır: bir) kullanım D1 ≥ 5 * T1; b) Merkezi sıklığı arasında her iki çekirdek aynı derecede heyecanlı bu yüzden iki tanılama Flor sinyal noktası (O1P) ofset; c) spektral Genişlik (SW) 300 ppm ayarlayın, ama eğer gerekirse daha iyi bir SNR oranı azaltmak; d) geçişler (NS) 64 ayarlamak, ancak daha yüksek SNR gerekliyse artırır.
   Not: Sigara decoupled ¹⁹F NMR deneyler NMR veri toplama için de kullanılabilir. Ancak, proton decoupled ¹⁹F NMR deneyler tercih edilir burada da sinyal-gürültü oranı artar proton-Flor kuplajları kaldırarak Flor sinyalleri basitleştirir. Biz tersini geçitli ayırımı nOe (nükleer Overhauser etki) geliştirmeler²³olmadan bilgisini iletmiyor bir spektrum elde etmek için kullanın. Nicel tümleştirme için bir sinyal-gürültü oranı (≥300) arzu edilir. ²⁴

4. veri işleme

1. ACD/NMR işlemci Academic Edition veya diğer özel NMR işleme yazılımı kullanarak elde edilen verileri işlemek.
   1. NMR veri dosyasını açın ve sonra klasör 1tarafından ardından pdata klasörünü açın. 1r dosyasını silin.
   2. NMR veri dosyasına dönün ve FID dosya ACD/NMR işlemci penceresine sürükleyin.
   3. WFunctions düğmesini tıklatın, üstelseçin, LB değerini 2olarak ayarlayın ve Tamam düğmesini tıklatın.
   4. Sıfır doldurma düğmesini tıklatın, Tamam ' ı tıklatın ve numarası yanında küçük bir düğmesi onun Orijinal puan sayısı 4 kez düğme için Puan sayısı artış.
   5. Fourier Tr. düğmesini tıklatın.
   6. Faz düğmesini tıklatın, sonra Fare Ph. düğmesini tıklatın, tıklatın ve sol fare düğmesini basılı tutun fareyi hareket ettirin ileri veya geri kadar spektrumunun önemli tepe düzgün aşamalı.
      1. ' I tıklatın ve farenin sağ düğmesini basılı tutun fareyi hareket ettirin ileri veya geri kadar yelpazenin diğer peak(s) düzgün aşamalı. Fare Ph. düğme seçimini kaldırın, flor zirveleri ile spektral alan yakınlaştırmak, İnce ayar' ı tıklatın, tüm doruklarına doğru aşamalı kadar daha önce anlatıldığı gibi gerekirse faz düzeltme yapmak ve sonra onay ' ı tıklatın düğme.
   7. Temel düğmesini, sonra Seçenekler düğmesini tıklatın. Spektrum ortalama için otomatik modelleri seçin, puanlar kutusunu yarım genişlik için (özellikle düşük S/R oranı ile spektrum için) gerekirse belirleyin, Tamam ' ı tıklatın | Otomatikve onay düğmesini tıklatın.
   8. Entegrasyontıklatın, tanılama Flor doruklarına entegre ve onay düğmesini tıklatın.
      Not: Eğer ayrılmaz eğrisi satır taban çizgisine paralel değil, Önyargı çelişmemesi düğmesini tıklatın ve tilt ve eğimi eğrinin satır taban çizgisine paralel olana ayarlayın.
2. N- octanol ve su NMR örnekleri Tümleştirme oranları elde etmek ve günlükP hesaplama denklemi (Şekil 1, EQ 4) günlükP değerini elde etmek için 4,4,4-trifluorobutan-1-ol (bileşik X) kullanın.

Sonuçlar

Kontrol deneyleri Şekil 2²¹' de gösterilen gibi iki veri türlerini belirler. 2,2,2-trifluoroethanol başvuru bileşik kullanarak, günlükP değerleri 2-fluoroethanol ve 3,3,3,2,2-pentafluoropropanol için-0.75 ve +1.20, anılan sıraya göre elde edilmiştir (Şekil 2A). Daha sonra 2-fluoroethanol lipophilicity yine ama 3,3,3,2,2-pentafluoropropanol ile (P değeri +1.20 önceki, deney...

Tartışmalar

Gazetede açıklanan günlükP ölçüm Fluor bileşikleri için basit bir yöntem protokolüdür. Bu yöntem için Fluor bileşikleri bir logP değeri ile 3 -3 üzerinden geçerlidir. Daha fazla bilgi için hidrofilik (P oturum < -3) ya da lipofilik bileşikler (günlükP > 3), bu yöntem hala kullanılabilir ama iyi bir sinyal / gürültü oranı elde etmek için genişletilmiş geçişler sayısını gerektiğinde daha fazla NMR deney zaman gerektirecektir. Bu nedenle, bu yöntem bi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
NMR (400 MHz) with Bruker 5 mm SEF probe	Bruker	n/a	AVIIIHD400
NMR (400 MHz) with Bruker 5 mm SMART probe	Bruker	n/a
DrySyn Snowstorm reactor	Asynt	ADS13-S
recirculating chiller	Asynt	n/a	model:Grant-LTC2
magnetic stirplate	Asynt	ADS-HP-NT
ACD/NMR processor software	ACD/Labs	n/a	ACD/NMR processor academic edition or ACD/Spectrus processor 2015