Um novo método simples para a medição de Lipofilicidade (logP) usando 19espectroscopia RMN de F

Resumo

Um romance e uma variação simples do método agitar-balão foi desenvolvido para a medição exata Lipofilicidade de compostos fluorados por espectroscopia de RMN de F ¹⁹.

Resumo

Fluoração tornou-se uma ferramenta eficaz para otimizar as propriedades físico-químicas de compostos bioativos. Uma das aplicações da introdução de flúor é de modular a lipofilicidade do composto. No nosso grupo, estamos interessados no estudo do impacto da fluoração na Lipofilicidade da fluorohydrins alifáticos e fluorados hidratos de carbono. Estes não são UV-ativo, resultando em uma determinação de Lipofilicidade desafiador. Aqui, apresentamos um método simples para a medição da Lipofilicidade de compostos fluorados por espectroscopia de RMN de F ¹⁹. Este método não requer nenhuma atividade-UV. Massa exata de soluto, solvente e alíquota volume também não são obrigados a ser medido. Usando esse método, Nós medimos as lipophilicities de um grande número de alkanols de gases fluorados e hidratos de carbono.

Introdução

Lipofilicidade é um parâmetro chave e físico-químico das moléculas de drogas que influencia as propriedades de candidatos da droga em muitos aspectos, incluindo a solubilidade da droga, biodisponibilidade e toxicidade¹. Lipofilicidade é medida como o logaritmo (logP) da razão de concentrações de compostos após particionamento entre n-octanol e água. Intervalos de Lipofilicidade ideal têm sido propostos com base em dados estatísticos de medicamentos administrados por via oral, de que a regra de Lipinski"de 5 ' é o mais famoso exemplo^2,3. Com efeito, controlar Lipofilicidade mostrou para ser essencial para melhorar a perspectiva de candidatos da droga. Aumentando a afinidade de ligação da droga pela elevada Lipofilicidade foi identificado como um dos principais problemas em projetos de descoberta de drogas durante as últimas décadas, levando ao aumento do atrito taxas³. Portanto, sugeriu-se que o desenvolvimento de drogas bem sucedida é associado com manter a lipofilicidade molecular dos candidatos dentro dos limites ideais droga durante o processo de otimização do afinidade^3,4. A esse respeito, novos conceitos (tais como índices de eficiência lipofílicos) foram introduzidos^5,6.

Assim, é de grande importância para medir com precisão a lipofilicidade durante o processo de desenvolvimento de drogas. Além disso, a disponibilidade de métodos simples para medição Lipofilicidade está na demanda como investigação fundamental visa identificar soluções para logP modulação. Actualmente, numerosos métodos estabelecidos são acessíveis para Lipofilicidade determinação¹. O método de 'agitar-aferido (SF)'⁷e suas variações são comumente empregadas para medir valores logP diretamente, o que, na maioria dos casos, dependem de espectroscopia UV-Vis para quantificação. A principal desvantagem deste método clássico de SF é a sua natureza de trabalho intensiva. Além disso, pode ocorrer a formação de emulsões, especialmente para compostos altamente lipofílicos^8,9. Vários métodos foram desenvolvidos para contornar esses problemas, tais como utilizando análise de injeção de fluxo, tubulação da diálise, etc. ⁹,¹⁰. No entanto, nenhum desses métodos são simples ou facilmente aplicável em laboratórios não especializados.

Existem também muitos métodos indiretos disponíveis para uso, tais como titulação potenciométrica¹¹métodos eletroforética^12,13, métodos cromatográficos baseados em RP-HPLC, métodos baseados em massa-espectrometria de¹⁴, etc. Estes são os métodos indiretos, como os valores de logP são obtidos por curvas de calibração. Entre esses métodos, o método de RP-HPLC foi amplamente utilizado porque é fácil de usar e economia de tempo. No entanto, sua precisão depende do conjunto de treinamento usado para estabelecer a curva de calibração, e a lipofilicidade estimada depende a partição sistema utilizado^13,15.

Há um número de métodos baseados em H NMR de ¹relatados na literatura para determinação de Lipofilicidade. Et al . mo desenvolveu um método para a medição de logP usando ¹H NMR sem solventes deuterados. Água e octanol, como solventes de partição, foram utilizados como referências para a quantificação da concentração de soluto em cada fase¹⁶. Heath e colegas de trabalho também relataram uma abordagem, por que o experimento de partição ocorreu diretamente num tubo NMR, onde os dados NMR da camada aquosa inferior D₂O foram coletados antes e após a extração com o 1-octanol, para obter a distribuição coeficiente de¹⁷. Além disso, Soulsby et al explorados ¹H NMR como uma ferramenta de análise, determinar a amplitude dos sinais por meio de redução completa ao software de tabela de frequência de amplitude. A relação entre as amplitudes em ambas as camadas que levou para o coeficiente de partição medido¹⁸. Estes métodos são relativamente simples de usar, mas muitas vezes requerem a calibração de pulsos seletivos e os níveis de energia ou o uso de em forma de pulsos de gradientes para garantir a supressão de solvente apropriado e seletividade do sinal.

Valores deP (Pde tamanco) log calculado para compostos também podem ser obtidos. Estão disponíveis vários métodos de cálculo e software comercialmente disponível. Tais valores de tamancoP são comumente usados na indústria farmacêutica, ao avaliar um grande número de moléculas de drogas. No entanto, grandes erros de entupirP valores não são incomuns^19,20.

Os requisitos de UV-atividade para análise da concentração e o estabelecimento de curvas de calibração para cálculo de logP impedem o progresso de pesquisa neste campo. Em particular, este é o caso dos compostos alifáticos não-UV-ativas. Fluorados alifáticos metades tornaram-se cada vez mais atraentes para o design de drogas nos últimos anos, e sua influência na Lipofilicidade total do composto é um tópico de pesquisa em nosso grupo²¹. Além disso, ¹⁹F é um núcleo ativo de NMR altamente sensível, fazendo ¹⁹F NMR uma ferramenta útil para a análise de compostos fluorados. Ele também tem uma gama maior de shift química comparada com a de ¹H. Portanto, vale a pena desenvolver um método simples para logP determinação de compostos fluorados UV-inativos por espectroscopia de RMN de F ¹⁹. Portanto, o objetivo geral deste método é conseguir a determinação Lipofilicidade conveniente de compostos fluorados.

O princípio-chave da nossa ¹⁹método baseado em F NMR é adicionar uma referência de fluorados composta na partição experimento (Figura 1)²¹. Compostos X e composto de referência (ref) são divididos entre água e n- octanol. Após desenroscada, uma alíquota de cada fase é levada em um tubo de NMR e ¹⁹F NMR experimentos são executados em ambas as amostras de NMR. A intensidade dos picos do flúor é proporcional aos compostos concentração (C) e o número de átomos de flúor (n) dos compostos. Entre compostos X e ref, rácios integrais podem ser obtidos por ambas as fases. A relação em n- octanol camada é definida como ρ_octe ρ_aq para a camada de água (EQ. 1). A relação dos valores ρ é igual a proporção dos coeficientes de partição (P) dos compostos X e ref (EQ. 2). Isto conduz à equação final (EQ. 4) para logP medição do composto X. Portanto, a fim de determinar o valor deP de um desconhecido X composto, rácios de integração somente (ρ_oct e ρ_aq) de log em ambas as camadas são necessárias para ser medido por ¹⁹F NMR.

Protocolo

1. particionamento

1. Adicionar 4,4,4-trifluorobutan-1-ol (composto X, ca. 6,0 mg) e 2, 2,2-trifluoroethanol (referência composto, ca. 3,0 mg) para um balão em forma de pera com 10 mL, dissolver em n- octanol (grau HPLC, ca. 2 mL) e adicionar água (grau HPLC, ca. 2 mL).
   Nota: Este experimento é executado em triplicado. Composto solubilidade em água e n- octanol deve ser verificada. A quantidade do composto usado para partição deve ser considerada com cuidado para evitar supersaturação do composto em qualquer camada. A proporção de massa entre compostos X e referência ref composto também deve ser considerado para evitar que os rácios integrantes de uma determinada amostra NMR são fora um intervalo de 10/1 a 1/10. Por exemplo, se há uma diferença de < 2 unidades logarítmicasP entre compostos X e ref, óptima relação massa posso assegurar que os rácios de integração em amostras de água e 1-octanol NMR são dentro de um intervalo de 10/1 a 1/10. Em contrapartida, se uma relação de integração de 50/1 em uma camada é obtida, haverá mais prováveis relativamente maiores erros na integração para o pico com concentração mais baixa. A equação abaixo pode ser usada para prever a óptima relação massa composta:
   m_X / m_ref = {(cP X/P_ref)^-0,5 * (M_X/ M_ref) * [(1 + cP_X) / (1 + P_ref)]} / (N_X / N_ref)
   m, em massa; M, massa molecular; N, o número de átomos de F; P, coeficientes de partição; cP, coeficientes de partição calculado.
2. Coloque os frascos dentro de um recipiente de temperatura controlada, acima de um stirplate e se conectar a um chiller de recirculação. Agite a mistura bifásica a 25 ° C, durante 2 h, com agitando a velocidade de 600 rpm.
3. Equilibrar a mistura a 25 ° C durante a noite (ca. 16 h), para permitir a separação completa fase.
   Nota: Em alguns casos, a formação de uma espuma entre a n- octanol e água limite pode ser observada. Neste caso, a mistura foi transferida para um frasco de vidro de 4 mL e centrifugada até o desaparecimento da espuma. A mistura bifásica foi então esquerda para equilibrar novamente a 25 ° C durante a noite.

2. preparação da amostra NMR

1. Corrigi o frasco a um carrinho de retorta com uma pinça.
2. Tirar uma alíquota de ca. 0,70-0,85 mL da água e n- octanol camadas, usando seringas de plástico descartáveis de 1ml com agulhas longas.
   1. Para tomar a água alíquota, desenhe ca. 0,02 mL de ar para a seringa antes de colocar a agulha na mistura. Ao mover a agulha através da superior n- octanol camada camada de água, empurre suavemente para fora o ar para impedir a entrada da agulha de n- octanol solução.
   2. Retire a agulha longa da mistura. Descarte uma pequena quantidade de amostra de água, deixando ca. 0,6 mL de amostra de esquerda na seringa. Cuidadosamente Limpe a agulha com pano seco e injetar ca. 0,5 mL de amostra de água em um tubo limpo de NMR. Feche rapidamente o tubo NMR com um boné.
   3. Para a amostra de n- octanol, retire a agulha longa da camada n- octanol. Descarte uma pequena quantidade de amostra de n- octanol, deixando ca. 0,6 mL de amostra de esquerda na seringa. Cuidadosamente Limpe a agulha com o tecido seco e injetar ca. 0,5 mL de n- octanol amostra em um tubo limpo de NMR. Feche rapidamente o tubo NMR com um boné.
3. Inspecione visualmente as duas amostras de n- octanol e água para qualquer contaminação (EG., pequenas gotas de n- octanol em amostra de água ou pequenas gotas de água na amostra de n- octanol).
   Nota: Se houver qualquer contaminação, a alíquota amostra precisa ser re-preparado a mistura bifásica. Como a medição é feita em triplicado, obtêm-se seis tubos NMR.
4. A cada tubo NMR, adicionar 0,1 mL de solvente deuterado NMR é miscível com água e n- octanol (EG., acetona-d₆) para habilitar o bloqueio de sinal durante a aquisição de NMR.
5. Para compostos com pontos de ebulição baixos (EG., < 120 ° C), selar os tubos NMR usando um maçarico e, após resfriamento, inverta o tubo para verificar se há fugas. Cuidadosamente, invertido que o NMR selada ou não seladas tubos 20 vezes para obter uma solução homogénea para ¹⁹F NMR experiências.

3. NMR experimentos

1. Executar, usando as configurações padrão do parâmetro NMR (NS 64, D1 1 s, SW 300 ppm, O1P-100 ppm), experiências de NMR F {¹H} ¹⁹para identificar mudanças químicas de 4,4,4-trifluorobutan-1-ol (composto X) e 2, 2,2-trifluoroethanol (composto de referência) em ambos os n amostras de NMR - octanol e água.
2. Medir o tempo de relaxação spin-lattice (T1) para núcleos de flúor diagnóstico usando uma sequência de inversão-recuperação²². Medir o nível de tempo de atraso de pulso apropriada (D1, definido como ≥ 5 * T1) dos valores obtidos de T1 para integração de NMR quantitativo preciso.
   Nota: Isto é muito demorado, mas uma D1 de 60 s para a amostra de fase da água e de 30 s para a amostra de fase octanol, são configurações conservadoras que cumprirá com segurança o D1 ≥ 5 * T1 criterium.
3. Executar ¹⁹experiências NMR F {¹H} novamente com ajustado as configurações de parâmetros como segue: um) uso D1 ≥ 5 * T1; b) a frequência de centro deslocamento ponto (O1P) entre os dois sinais de diagnóstico flúor, então ambos os núcleos podem ser igualmente animados; c) definir a largura espectral (SW) como 300 ppm, mas reduzir-se uma melhor relação SNR se necessário; d) definir o número de transientes (NS) como 64 mas aumentar se SNR superior é exigido.
   Nota: Não-dissociado ¹⁹F NMR experimentos podem ser usados também para aquisição de dados NMR. No entanto, dissociados de próton ¹⁹F NMR experimentos são preferidos aqui como simplifica os sinais de flúor através da remoção de acoplamentos de próton-flúor, que também aumenta a relação sinal-ruído. Nós usamos o inverso-bloqueadas dissociação para obter um espectro dissociado sem nOe (nuclear Overhauser efeito) melhorias²³. Para integração quantitativa, uma relação sinal-ruído (≥300) é desejada. ²⁴

4. processamento de dados

1. Processe os dados obtidos usando ACD/NMR processador Academic Edition ou outro software de processamento personalizado NMR.
   1. Abra o arquivo de dados NMR e, em seguida, abra a pasta pdata , seguida de pasta 1. Exclua o arquivo 1r .
   2. Retornar ao arquivo de dados NMR e arraste o arquivo fid para a janela ACD/NMR processador.
   3. Clique no botão WFunctions , selecione exponencial, defina o valor LB como 2e clique no botão OK .
   4. Clique no botão Preenchimento Zero , aumentar a Contagem de pontos para 4 vezes de sua Contagem de pontos Original clicando em um pequeno botão ao lado do número e clique o Okey botão.
   5. Clique no botão de Fourier TR.. .
   6. Clique no botão de fase , então clique no botão do Mouse PhD , clique e mantenha pressionado o botão esquerdo do mouse, mova o mouse para a frente ou para trás até os maiores picos do espectro é corretamente em fases.
      1. Clique e mantenha pressionado o botão direito do mouse, mova o mouse para a frente ou para trás até que a outra técnica do espectro é corretamente em fases. Em seguida, desmarque o botão do Mouse PhD , ampliar a área espectral com os picos de flúor, clique em Sintonia fina, realizar a correção de fase, se necessário, conforme descrito anteriormente, até que todos os picos estão corretamente em fases e, em seguida, clique o carrapato botão.
   7. Clique no botão de linha de base , em seguida, o botão Opções . Selecione Uma média de espectro para modelos automáticos, ajuste o número de pontos para a caixa a metade da largura, se necessário (em especial para o espectro com baixa relação S/R), clique em Okey | Autoe, em seguida, clique no botão de carrapato .
   8. Clique em integração, integrar os picos de diagnóstico flúor e clique no botão de carrapato .
      Nota: Se a curva integral não é paralela à linha de base, clique no botão de Corr. de Bias e ajustar a inclinação e a inclinação até a curva é paralela à linha de base.
2. Obter as relações de integração de n- octanol e água NMR amostras e usar a equação de cálculo logP (Figura 1, EQ. 4) para obter o valor de logP de 4,4,4-trifluorobutan-1-ol (composto X).

Resultados

Dois conjuntos de dados, como controle de experimentos são mostrados na Figura 2,²¹. Usando 2, 2,2-trifluoroethanol como composto de referência, valores logP foram obtidos por 2-fluoroethanol e 3,3,3,2,2-pentafluoropropanol-0,75 e +1.20, respectivamente (Figura 2A). Posteriormente, a lipofilicidade da 2-fluoroethanol determinou-se novamente, mas com 3,3,3,2,2-pentafluoropropanol como a referênc...

Discussão

O protocolo descrito no documento é um método simples para logP medição de compostos fluorados. Este método é aplicável a compostos fluorados com um logP valor de -3 a 3. Para obter mais hidrófila (logP < -3) ou compostos lipofílicos (logP > 3), este método pode ainda ser usado, mas vai exigir muito mais tempo de experiência NMR como número alargado de transientes é necessárias para obter uma boa relação sinal-ruído. Portanto, esta é uma limitação do método. Não h...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
NMR (400 MHz) with Bruker 5 mm SEF probe	Bruker	n/a	AVIIIHD400
NMR (400 MHz) with Bruker 5 mm SMART probe	Bruker	n/a
DrySyn Snowstorm reactor	Asynt	ADS13-S
recirculating chiller	Asynt	n/a	model:Grant-LTC2
magnetic stirplate	Asynt	ADS-HP-NT
ACD/NMR processor software	ACD/Labs	n/a	ACD/NMR processor academic edition or ACD/Spectrus processor 2015