Une nouvelle méthode simple pour la mesure de lipophilie (logP) à l’aide de 19F-RMN

Résumé

Un roman et une simple variante de la méthode de shake-flacon a été développé pour la mesure précise lipophilie de composés fluorés par ¹⁹F RMN.

Résumé

La fluoration est devenu un outil efficace pour optimiser les propriétés physico-chimiques des composés bioactifs. Une des applications d’introduction de fluor est de moduler la lipophilie du composé. Dans notre groupe, nous nous intéressons à l’étude de l’impact de la fluoration sur lipophilie de fluorohydrins aliphatiques et hydrates de carbone fluoré. Ce ne sont pas UV-active, ce qui entraîne une détermination de lipophilie difficile. Nous présentons ici une méthode simple pour la mesure de la lipophilie de composés fluorés par RMN du ¹⁹F. Cette méthode ne nécessite aucun UV-activité. Masse de soluté précise, volume de solvant et aliquot doivent également pas être mesuré. En utilisant cette méthode, nous avons mesuré le lipophilicities d’un grand nombre des alcanols fluorés et des glucides.

Introduction

Lipophilie est un paramètre clé physico-chimiques des molécules médicamenteuses qui influe sur les propriétés des candidats-médicaments dans de nombreux aspects, y compris la solubilité de la drogue, la biodisponibilité et la toxicité¹. Lipophilie est mesuré comme le logarithme (logP) du rapport des concentrations composés après le partitionnement entre n-octanol et l’eau. Plages de lipophilie optimal ont été proposées, basées sur des données statistiques des médicaments administrés par voie orale, dont la « règle de 5'' de Lipinski est le plus célèbre exemple^2,3. En effet, contrôlant la lipophilie s’avéré indispensable pour améliorer la perspective de candidats-médicaments. Affinité de liaison de drogue a augmenté de lipophilie élevée a été identifié comme l’un des principaux problèmes dans les projets de découverte de médicaments au cours des dernières décennies, conduisant à une usure accrue des taux³. Par conséquent, il a été suggéré que le développement de médicaments réussie est associé à garder la lipophilie moléculaire des candidats médicaments dans des limites optimales au cours de l’affinité optimisation processus^3,4. À cet égard, les nouveaux concepts (comme les indices d’efficacité lipophiles) ont été introduites^5,6.

Il est donc très important de mesurer précisément la lipophilie pendant le processus de développement de médicaments. En outre, la disponibilité des méthodes simples pour la mesure de la lipophilie est en demande comme recherche fondamentale vise à identifier des solutions pour connecterP modulation. Actuellement, nombreuses méthodes établies sont accessibles pour la lipophilie dosage¹. La méthode standard « shake-fiole (SF) »⁷et ses variations sont couramment employées pour mesurer des valeurs de logP directement, qui, dans la plupart des cas, dépendent de la spectroscopie UV-Vis pour la quantification. Le principal inconvénient de cette méthode classique de la SF est son caractère fastidieux. En outre, la formation d’émulsions peut-être survenir, en particulier pour les composés lipophiles hautement^8,9. Plusieurs méthodes ont été développées pour contourner ces problèmes, comme en utilisant l’analyse par injection de flux, tube à dialyse, etc.. ⁹,¹⁰. Toutefois, aucune de ces méthodes sont simples ou facilement applicable dans les laboratoires non spécialisés.

Il y a également plusieurs méthodes indirectes utilisables, tels que le titrage potentiométrique¹¹, méthodes électrophorétiques^12,13, RP-HPLC-basé des méthodes chromatographiques, méthodes basées sur la spectrométrie de masse¹⁴, etc.. Ce sont des méthodes indirectes, comme les valeurs de logP sont obtenues par les courbes d’étalonnage. Parmi ces méthodes, la méthode CLHP-pi a été largement utilisée car il est facile à utiliser et gagner du temps. Néanmoins, sa précision dépend de l’ensemble d’apprentissage utilisée pour établir la courbe d’étalonnage et la lipophilie estimée dépend de la partition système utilisé^13,15.

Il y a un certain nombre de méthodes RMN H ¹rapportées dans la littérature pour la détermination du caractère lipophile. Mo et coll. mis au point une méthode de mesure avec ¹H RMN sans solvants deutérés le logP . L’eau et l’octanol, comme les solvants de la partition, ont été utilisés comme références pour la quantification de la concentration en soluté dans chaque phase¹⁶. Herth et ses collègues a également signalé une approche, par lequel l’expérience de la partition est produite directement dans un tube de NMR, où les données de la RMN de la couche inférieure D₂O aqueuse ont été prélevées avant et après l’extraction avec 1-octanol, afin d’obtenir la distribution ¹⁷de coefficient. En outre, Soulsby et coll. exploités ¹H RMN comme un outil d’analyse, de déterminer l’amplitude des signaux à l’aide de réduction complète au logiciel de table amplitude / fréquence. Le rapport des amplitudes en deux couches a conduit à la partition mesurée coefficient¹⁸. Ces méthodes sont relativement simples à utiliser, mais nécessitent souvent l’étalonnage des impulsions sélectives et niveaux de puissance ou l’utilisation d’en forme d’impulsions dégradées pour assurer la répression solvant appropriée et de sélectivité du signal.

Les valeurs deP (sabotP) calculée pour les composés peuvent aussi être obtenues. Plusieurs méthodes de calcul et logiciel disponible dans le commerce sont disponibles. Ces valeurs de sabotP sont utilisés couramment dans l’industrie pharmaceutique lors de l’évaluation d’un grand nombre de molécules de médicaments. Cependant, des erreurs importantes de sabotP valeurs ne sont pas rare^19,20.

Les exigences de l’UV-activité d’analyse de la concentration et l’établissement des courbes d’étalonnage pour le calcul de logP entravent les progrès de la recherche dans ce domaine. En particulier, c’est le cas pour les composés aliphatiques non-UV-actifs. Moitiés aliphatiques fluorés sont devenus plus en plus attrayantes pour la conception de médicaments au cours des dernières années, et leur influence sur la lipophilie globale du composé est un sujet de recherche dans notre groupe²¹. En outre, ¹⁹F est un noyau de NMR actifs hautement sensible, faisant ¹⁹F RMN un outil utile pour l’analyse des composés fluorés. Il a également une plus grande portée de déplacement chimique par rapport à celle de ¹H. Il est donc utile de développer une méthode simple pour logP détermination de composés fluorés non UV-actifs par RMN du ¹⁹F. L’objectif général de cette méthode est donc, pour atteindre la détermination pratique lipophilie de composés fluorés.

Le principe-clé de nos ¹⁹méthode basée sur la RMN F consiste à ajouter une référence de fluorés composée présent dans la partition expérience (Figure 1)²¹. Composé X et composé de référence (réf) sont répartis entre l’eau et le n- octanol. Après équilibration, une partie aliquote de chaque phase est prise dans un tube de NMR, et des expériences de RMN F ¹⁹sont exécutées sur les deux échantillons de NMR. L’intensité des pics de fluor est proportionnelle au composé concentration (C) et le nombre d’atomes de fluor (n) des composés. Entre le composé X et ref, les ratios intégrale peuvent être obtenus pour les deux phases. Le ratio de n- octanol couche désigne ρ_octet ρ_aq pour la couche d’eau (EQ. 1). Le rapport des valeurs ρ est égal au rapport des coefficients de partage (P) du composé X et ref (EQ. 2). Cela conduit à l’équation finale (EQ 4) pour logP mesure du composé X. Donc, afin de déterminer la valeur de logP d’un composé inconnu X, seulement des rapports de l’intégration (ρ_oct et ρ_aq) dans les deux couches sont nécessaires pour être mesurées par ¹⁹F RMN.

Protocole

1. partitionnement

1. Ajouter 4,4,4-trifluorobutan-1-ol (composé X, ca. 6,0 mg) et 2,2,2-trifluoroéthanol (référence composé, env. 3,0 mg) dans une fiole en forme de poire de 10 mL, dissoudre dans le n- octanol (qualité HPLC, ca. 2 mL) et ajouter de l’eau (qualité CLHP, ca. 2 mL).
   Remarque : Cette expérience est exécutée en trois exemplaires. Composé solubilité dans l’eau et le n- octanol doit être vérifiée. La quantité du composé utilisé pour la partition doit être examinée attentivement afin d’éviter la sursaturation du composé dans n’importe quel calque. Le rapport de masse entre le composé X et réf composé doit également être examiné afin d’éviter que les ratios intégrale d’un échantillon donné de NMR sont à l’extérieur d’une gamme de 10/1 au 1/10. Par exemple, s’il y a une différence de < 2 unités logarithmiquesP entre composé X et ref, ratio masse optimal peut assurer que les rapports d’intégration dans des échantillons de l’eau et le 1-octanol NMR varient dans une fourchette de 10/1 au 1/10. En revanche, si un rapport d’intégration de 50/1 dans une couche est obtenu, il y aura plus probables erreurs relativement plus importantes dans l’intégration pour le sommet avec la plus faible concentration. L’équation suivante peut servir à prédire le ratio optimal de masse composé :
   m_X / m_ref = {(cP X/P_réf)^-0,5 * (M_X/ M_ref) * [(1 + cP_X) / (1 + P_réf)]} / (N_X / N_réf)
   m, masse ; M, masse moléculaire ; N, le nombre d’atomes de fluor ; P, coefficients de partage ; cP, coefficient calculé.
2. Placer les fioles à l’intérieur un récipient isotherme au-dessus d’un stirplate et se connecter à un refroidisseur de recirculation. Remuez le mélange biphasique à 25 ° C pendant 2 h, avec en mélangeant vitesse fixée à 600 tr/min.
3. Equilibrer le mélange à 25 ° C durant la nuit (env. 16 h), pour permettre à la séparation de phase complète.
   Remarque : Dans certains cas, peut être observée la formation d’une mousse entre la frontière de l’eau et le n- octanol. Dans ce cas, le mélange a été transféré dans un flacon de verre de 4 mL et centrifugé jusqu'à la disparition de la mousse. Le mélange biphasique était alors gauche s’équilibrer à nouveau à 25 ° C la nuit.

2. préparation de l’échantillon RMN

1. Fixer le ballon à un statif avec une pince.
2. Prendre une partie aliquote de ca. 0,70-0,85 mL de l’eau et le n- octanol couches, en utilisant des seringues en plastique de 1 mL avec longues aiguilles.
   1. Pour prendre l’eau aliquote, aspirer env. 0,02 mL d’air dans la seringue avant de mettre l’aiguille dans le mélange. Tout en déplaçant l’aiguille à travers la haute n- octanol couche dans la couche d’eau, poussez doucement l’air pour empêcher l’entrée de l’aiguille de n- octanol solution.
   2. Retirez l’aiguille longue du mélange. Jetez une petite quantité d’échantillon d’eau, laisser env. 0,6 mL d’échantillon de gauche dans la seringue. Essuyer soigneusement l’aiguille avec le tissu sec et l’injecter env. 0,5 mL d’échantillon d’eau dans un tube propre de NMR. Fermer rapidement le tube NMR avec une casquette.
   3. Pour l’échantillon de n- octanol, retirez l’aiguille longue de la couche de n- octanol. Jetez une petite quantité de n- octanol échantillon, laissant env. 0,6 mL d’échantillon de gauche dans la seringue. Essuyer l’aiguille avec tissu sec soigneusement et injecter env. 0,5 mL de n- octanol échantillon dans un tube propre de NMR. Fermer rapidement le tube NMR avec une casquette.
3. Inspecter visuellement les deux échantillons de n- octanol et l’eau de toute contamination (e.g., petites gouttelettes de n- octanol dans l’échantillon d’eau ou de petites gouttelettes d’eau dans le n- octanol échantillon).
   Remarque : Si il n’y a aucune contamination, l’aliquote doit être re-prêt du mélange biphasique. Comme la mesure se faite en trois exemplaires, six tubes de NMR sont obtenus.
4. Dans chaque tube de NMR, ajouter 0,1 mL de solvant deutéré NMR qui est miscible avec la n- octanol et l’eau (p. ex.., acétone-d₆) pour activer le signal verrouillage lors de l’acquisition de NMR.
5. Pour les composés à faible point d’ébullition (e.g., < 120 ° C), sceller le NMR de tubes à l’aide d’un chalumeau et, après refroidissement, inverser le tube pour vérifier les éventuelles fuites. Soigneusement inverser que la RMN scellée ou non scellées tubes 20 fois pour obtenir une solution homogène pour ¹⁹F RMN expériences.

3. des expériences RMN

1. Exécuter, à l’aide des paramètres standards NMR (NS 64, D1 1 s, SW 300 ppm, O1P-100 ppm), expériences de F {¹H} RMN de ¹⁹pour identifier les déplacements chimiques des 4,4,4-trifluorobutan-1-ol (composé X) et 2,2,2-trifluoroéthanol (composé de référence) dans les deux n échantillons de NMR - octanol et l’eau.
2. Mesurer le temps de relaxation spin-réseau (T1) pour les noyaux de fluor diagnostique en utilisant une inversion-récupération séquence²². Évaluer le niveau de temps de retard d’impulsions approprié (D1, défini comme ≥ 5 * T1) depuis les valeurs de T1 obtenues pour l’intégration de NMR quantitative précise.
   Note : Ceci est très long, mais une D1 de 60 s pour l’échantillon de phase de l’eau et de 30 s pour l’échantillon de phase octanol, sont des paramètres conservateurs qui remplissent en toute sécurité la D1 ≥ 5 * T1 critérium.
3. Exécutez ¹⁹expériences RMN F {¹H} à nouveau avec ajusté des paramètres comme suit : un) utilisation D1 ≥ 5 * T1 ; b) centre la fréquence décaler point (O1P) entre les deux signaux de diagnostic fluor donc les deux noyaux peut être tout aussi excité ; c) définir la largeur spectrale (SW) que 300 ppm, mais réduire si un meilleur rapport SNR le cas échéant ; d) définir le nombre de transitoires (NS) en 64 mais augmenter si SNR plus élevé est requis.
   Remarque : Non découplé ¹⁹F RMN expériences peuvent être utilisés également pour l’acquisition de données de NMR. Cependant, des expériences de F RMN proton-découplé ¹⁹on préfère ici car il simplifie les signaux de fluor en enlevant les couplages proton-fluor qui augmente également le rapport signal-sur-bruit. Nous utilisons l’inverse-dépendants de découplage pour obtenir un spectre découplé sans nOe (effet Overhauser nucléaire) améliorations²³. Pour intégration quantitative, un rapport signal-bruit (≥300) est souhaité. ²⁴

4. traitement des données

1. Traiter les données obtenues à l’aide de ACD/NMR Processor Academic Edition ou autre logiciel de traitement de NMR personnalisé.
   1. Ouvrez le fichier de données de NMR, puis ouvrez le dossier pdata , suivi de dossier 1. Supprimez le fichier 1r .
   2. Retourner au fichier de données NMR et glissez le fichier de dif dans la fenêtre ACD/NMR Processor.
   3. Cliquez sur le bouton WFunctions , sélectionnez exponentiel, valeur LB 2et cliquez sur le bouton OK .
   4. Cliquez sur le bouton de Remplissage de zéro , augmenter le Nombre de Points pour 4 fois de son Nombre de Points initial en cliquant sur un petit bouton à côté du nombre, puis cliquez sur OK bouton.
   5. Cliquez sur le bouton Tr. transformée de Fourier .
   6. Cliquez sur le bouton de Phase , puis cliquez sur le bouton de la Souris Tél. , cliquez et maintenez le bouton gauche de la souris, déplacez la souris vers l’avant ou vers l’arrière jusqu'à ce que le pic important du spectre est éliminé correctement.
      1. Cliquez et maintenez le bouton droit de la souris, déplacez la souris vers l’avant ou vers l’arrière jusqu'à ce que les autres pics du spectre est éliminé correctement. Puis décochez le bouton de la Souris Ph. , zoomez sur la zone spectrale avec les pics de fluor, cliquez sur Affiner, effectuer la correction de phase si nécessaire comme décrit précédemment, jusqu'à ce que tous les sommets sont correctement éliminés et puis cliquez sur la coche bouton.
   7. Cliquez sur le bouton de base , puis sur le bouton Options . Sélectionnez l’Étalement de spectre pour les modèles automatiques, ajuster le nombre de points pour boîte de demi-largeur si nécessaire (en particulier pour le spectre avec faible ratio S/R), cliquez sur OK | Automatiqueet puis cliquez sur le bouton de la tique .
   8. Cliquez sur intégration, intégrer les pics de fluor diagnostique et cliquez sur le bouton de la tique .
      Remarque : Si la courbe intégrale n’est pas parallèle à la ligne de base, cliquez sur le bouton Corr. de partialité et régler l’inclinaison et la pente jusqu'à ce que la courbe est parallèle à la ligne de base.
2. Obtenir les rapports d’intégration de n- octanol et NMR échantillons d’eau et utiliser dans l’équation de calcul logarithmiqueP (Figure 1, EQ 4) pour obtenir la valeur de logP du 4,4,4-trifluorobutan-1-ol (composé X).

Résultats

Deux ensembles de données des expériences de contrôle sont indiquées dans la Figure 2²¹. En utilisant 2,2,2-trifluoroéthanol comme composé de référence, logP valeurs ont été obtenues pour le 2-fluoroéthanol et 3,3,3,2,2-pentafluoropropanol-0,75 et +1.20, respectivement (Figure 2 a). Par la suite, la lipophilie du 2-fluoroéthanol a été déterminée à nouveau mais avec 3,3,3,2,2-penta...

Discussion

Le protocole décrit dans le livre est une méthode simple pour logP mesure de composés fluorés. Cette méthode est applicable aux composés fluorés avec un logP valeur de -3 à 3. Pour en savoir plus hydrophile (logP < -3) ou composés lipophiles (logP > 3), cette méthode peut encore être utilisée mais il faudra beaucoup plus longtemps d’expérience NMR comme grand nombre de transitoires est nécessaires pour obtenir un bon rapport signal sur bruit. Par conséquent, il s’agi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
NMR (400 MHz) with Bruker 5 mm SEF probe	Bruker	n/a	AVIIIHD400
NMR (400 MHz) with Bruker 5 mm SMART probe	Bruker	n/a
DrySyn Snowstorm reactor	Asynt	ADS13-S
recirculating chiller	Asynt	n/a	model:Grant-LTC2
magnetic stirplate	Asynt	ADS-HP-NT
ACD/NMR processor software	ACD/Labs	n/a	ACD/NMR processor academic edition or ACD/Spectrus processor 2015