Tek hücreli RNA sıralama Fluorescently etiketli fare nöronların el ile sıralama ve çift Vitro transkripsiyon mutlak sayar (DIVA-Seq) sıralama kullanarak

Özet

Bu iletişim kuralı vitro transkripsiyon tabanlı mRNA amplifikasyon yüksek-derinlik tek hücreli RNA sıralama için ardından tek fluorescently etiketli nöronların izole etmek için yordam sıralama kılavuzu açıklanır.

Özet

Tek hücreli RNA sıralama (RNA-seq) şimdi gen ekspresyonu raporlaması için yaygın olarak uygulanan bir araçtır. Piyasada bulunan tek hücreli RNA-sıralama platformlar ayrım gözetmeksizin tüm giriş hücresi işlemek. Bazen, floresans aktif hücre (FACS) sıralama akıntıya karşı faiz özel olarak etiketlenmiş bir nüfusa izole etmek için kullanılır. Bir FACS önemli ölçüde etiketli kesirli sayıları, giriş hücresi sayısının fazlalığı için ihtiyaç hangi toplamak ve nadir veya seyrek etiketli nöron popülasyonları--dan fare beyin profil oluşturma zordur kısıtlamasıdır. Burada, el ile fluorescently tek neurons taze etiketli seyrek toplama fare beyin dokusu ayrışmış için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu işlem için esir alma tek etiketli nöronlar yüksek saflıkta ve endojen transkript oranları korur bir vitro amplifikasyon transkripsiyon tabanlı iletişim kuralı ile sonraki entegrasyon sağlar. Biz bireysel mRNA sayar oluşturmak için benzersiz molekül tanımlayıcıları (UMIs) kullanan bir çift doğrusal amplifikasyon yöntemi açıklanmaktadır. Yüksek derecede gen algılama tek hücre başına amplifikasyon sonuçlarında iki mermi.

Giriş

Tek hücreli RNA sıralama (RNA-seq) transcriptomic çalışmalar dönüştürdü. Büyük ölçekli tek hücreli RNAseq damlacıkları^1,2, havacilik³, nanogrids⁴ve microwells⁵, gibi teknikler kullanılarak gerçekleştirilebilir iken pek çok yöntem tanımlı hücre tipleri sıralama yapamazsınız genetik olarak kodlanmış fluorophores express. Floresans aktif hücre (FACS) sıralama hücresini seçin popülasyon yalıtmak için sık sık etiketli hücreleri tek hücre modunda sıralama için kullanılır. Ancak, FACS bazı kısıtlamaları vardır ve titiz örnek işlem adımları gerektirir. Birincisi, genellikle çok sayıda giriş hücresi vardır (genellikle milyon başına birkaç hücreleri mL), önemli bir kısmı ile gerekli (> % 15-20) etiketli nüfus içeren. İkinci olarak, hücre hazırlıklar yoğunluk gradient Santrifüjü adımları gliyal kesir, enkaz ve aksi takdirde meme veya akış hücre yapışmasına neden hücre kümeleri kaldırmak için birden fazla mermi gerektirebilir. Üçüncü olarak, FACS genellikle boyama ve adımları Canlı/Boyama (Örneğin, ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), propidium iyodür (PI) ve Cytotracker boyalar), hangi ek sefer ölüme destaining kullanır. Dördüncü olarak, kural iki renkli sıralama (örneğin, DAPI ve yeşil/kırmızı floresan protein (GFP/RFP)), genellikle iki örnek ve bir denetim için gerekli gibi istenen fare zorlanma ek olarak işlenecek şekilde etiketlenmemiş bir örnek gerektiren. Beşinci olarak, süzme genellikle birden çok kez önce ve proaktif bir FACS makine tıkanmış örnek satırları önlemek için örnek sıralama sırasında gerçekleştirilir. Altıncı, zamanı başlatmak ve sıvı akışını dengelemek ve damlacık kalibrasyon gerçekleştirmek için en sık kullanılan FACS kurulumları ayrılmış gerekir. Yedinci, denetimi örnekleri genellikle gerçek örnek toplama kadar tazminat matrisler, kütleye ret ayarla, altı ve yedi kendilerini vaktinden adımları gates, vb kullanıcılar da ayarlama veya gerektirir için önce sırayla çalıştırma paralel bir teknisyeni yardımıyla. Son olarak, post-FACS, çoğu zaman sadece tek etiketli hücreleri her kuyuya; bulunduğundan emin olmak için adımlar Örneğin, bir yüksek-içerik tarama kurulum hızlı plaka Imager gibi örnekleri kontrol ederek.

Biz son derece hassas içinde vitro iki tur tarafından takip yordam sıralama a elle yapılan tarif yukarıda özetlenen adımları engelleyecek ve nispeten hızlı, tek fluorescently etiketli nöronlar, küçük bir nüfusa sıralama hedef kolaylaştırmak Çift In vitro transkripsiyon mutlak sayar (DIVA-Seq) sıralama adlı amplifikasyon protokolü. RNA amplifikasyon ve cDNA Kütüphanesi nesil Eberwine vd adapte olmuşlardır ⁶ ve Hashimshony vd. ⁷, küçük hücresel birimleri var fare interneurons uygun bazı değişiklikler ile; Ayrıca, aynı zamanda eşit eksitatör piramidal nöronların için yararlı olduğunu bulduk.

Protokol

Hayvan konular da dahil olmak üzere tüm yordamları IACUC soğuk Spring Harbor Laboratuvarı, NY (IACUC #16-13-09-8) tarafından onaylanmıştır.

1. Manuel Fluorescently etiketli fare nöronlar sıralama

1. (Bkz: Malzemeler tablo) cam microcapillaries 10-15 µm çıkış çapı aşağıdaki ayarlara sahip bir kılcal çektirmenin kullanarak çekin: ısı: 508, çekme: boş, vel: boş, zaman: boş.
2. 120-150 cm esnek silikon tüp (~0.8 mm iç çapı) 0.2 µm polivinilidin difluoride (PVDF) membran şırınga filtre ve uygun boru bağlayıcıları kullanarak iki yönlü boru Vana ekleyin.
3. Soğutulmuş (4 ° C) yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF, Tablo 1) 500 mL hazırlamak ve bir airstone 15 dk ya da çözüm tamamen temizlenene kadar kabarcıklanma % 5 karbon dioksit dengeli oksijeni tarafından oksijen.
4. ACSF 100 mL etkinlik blokerler bir 150 mL ölçek (Tablo 1) bir kokteyl ile hazırlayın.
5. ACSF 100 mL 1 mg/mL 150 mL ölçek (Tablo 1) Streptococcus kesir IV proteaz ile hazırlayın.
6. ACSF 100 mL % 1 fetal Sığır serum (FBS) çözüm bir 150 mL ölçek ile hazırlamak ve bir airstone % 5 karbon dioksit dengeli oksijeni ile oksijen.
7. Kafatası küçük bir makas ile açarak ve taze beyin korteksi zarar vermeden iyi forseps kullanarak ayıklama euthanized fareden beynini incelememize.
   Not etmek-Ebilmek var kullanılmış fareler herhangi bir zorlanma, yaş ve cinsiyet istediğiniz gibi. Beyin dondurmak veya virüs veya diğer zararlı/bulaşıcı ile enjekte fareler üzerinde el ile sıralama yapmak değil.
8. Beyin % 5 karbon dioksit denge oksijen kesit tüm süresi sırasında bağlı bir airstone bırakarak soğutulmuş ve oksijenli ACSF unutmayın.
9. Beyin vibratome chuck üzerinde konumlandırın ve 300 µm kalınlık koronal veya sagittal bölümleri kesti. En az ~ 10-50 elde etmek için gerektiği kadar çok sayıda bölümleri toplamak kadar birkaç yüz hücreler hücreleri etiketli. Oksijenli ACSF banyo bu yüzden bir kabı yerleştirilen bir pamuk örgü dilim tutucu dilimleri koyun.
10. Taze dilimleri etkinlik blokerler ve blok 15-20 dakika oda sıcaklığında ACSF içeren bir kabı içine taşıyın. Kabarcıklanma oksijen airstone kullanarak tutmak.
11. Oda sıcaklığında hafif sindirim gerçekleştirmek için proteaz solüsyonu ile ACSF içeren bir ölçek dilimleri taşıma: P4-14 hayvanlar için 20-30 dk ya da en çok 45-60 dk P28-56 hayvanlar için. Kabarcıklanma oksijen tutun.
12. ACSF dilimleri geri etkinlik blokerler çözüm için oda sıcaklığında 5-10 dk ile ACSF içeren kabı taşıyarak proteaz ile yıkayın. Kabarcıklanma oksijen tutun.
13. 100 mm Petri kabına ACSF yüzde 1'içeren tek tek bölümleri geçmek FBS, oda sıcaklığında. Bir floresan diseksiyon kapsamı, microdissect alanları ve ilgi katmanları altında en az 10-50 hücre (en fazla bir kaç yüz) sahip. İyi forseps veya 22-28 G Enjeksiyon iğneler üzerine ahşap sahipleri (şiş) ekleme tarafından bir çift ile mikrodiseksiyon gerçekleştirin.
14. Pasteur pipet hareket ettirmek istimal microdissected adet ~0.8 mL % 1'lik içeren 2 mL microfuge tüp ACSF çözüm içinde FBS.
15. Oda sıcaklığında microfuge tüp disseke dokuda triturate. Açık alev üzerinde haddeleme tarafından çıkış çapı azaltılması ile üç uzun saplı Pasteur pipetler olun. Her pipet ile ~ 10 vuruş yapmak en büyük ve en küçük ile biten başlayarak.
16. Disosiye hücreleri oksijenli ACSF içeren bir 100 mm Petri kabına dağıtmak (Petri kabına ince %1 agar veya açık silikon bileşik 1:10, 5 mm ile kaplı isterseniz oranı). Oda sıcaklığında tutmak.
17. Bekle ~ 5-7 dk hücrelere yavaş yavaş yerleşmek, sonra bir diseksiyon mikroskop altında GFP/RFP sinyal gözlemlemek için.
    Not: Tek hücreler, enkaz ve küçük kümeleri parlak-alanında (BF) görünür.
18. Esnek silikon tüp için bağlı bir kılcal pipet (Kimden adım 1.1) kullanarak bir defada 10-15 GFP/RFP hücreleri seç (0.4-0.8 mm iç çap) ve 100 mm Petri kabına taze oksijenli ACSF içeren hücreleri dağıtmak.
19. Dil ile boru Vana sonuna engelleyerek, kılcal faiz hücre yakın yerleştirin. Hücreleri kılcal blok rahatlatma üzerine eylem kullanarak yakalamak ve hızlı bir şekilde yeniden aşırı sıvı pipet girmesini önlemek için engelleyin. Hücreleri üzerine 100 mm ile taze oksijenli ACSF Petri kabına yavaşça, floresans optik diseksiyon mikroskop altında kılcal ipucu kesilmediğini gözleyerek uçurarak dağıtmak. ~ 100 – 150 toplamak için amacı hücreleri toplam.
20. Adımı 1.19 yineleyin bir veya iki kez daha fazla (bağlı olarak enkaz) ve transfer ~ 50-75 toplam hücreleri için yeni 100 mm Petri kabına, kirletici enkaz gibi parlak alan fark girişim kontrast (DIC) optik en az olduğundan emin yapma.
21. Son olarak, taze microcapillary pipet her seferinde kullanarak, 0.5 µL birimden daha fazla tek bir hücre seçin ve bir tek 0.2 mL microfuge tüp içine (veya bir şerit sekiz 0.2 mL microfuge tüpler) örnek koleksiyon arabelleği astar ile 1 µL içeren sınırdışı N10B1-N10B96 (Tablo 2). Pipet Ucu hücre toplama arabellekte kalmasını sağlamak için microfuge Tüp içeri zorla. Pipetler atmak.
22. RNA amplifikasyon için işlenmeye hazır olana hücreleri tüpler kuru buza koymak ve bunları saklamak uzun vadeli-80 ° C dondurucuda dondurma.

2. ilk yuvarlak RNA amplifikasyon

Not: Aşağıdaki yordam tek sekiz 0.2 mL microfuge tüpler için bandıdır. Tepkiler gerektiği şekilde ölçeklendirin.

1. CDNA ilk iplikçik sentez (birinci tur).
   1. 5 min 5 min için 4 ˚C ardından için 70 ˚C aşamada 1.22 gelen ısı şeritler; iki kez tekrarlayın.
   2. (Bkz: Malzemeler tablo) aşağıdaki maddeler buz ters transkriptaz (RT) ana mix/ilk-strand sentez ana karışımının üzerinde birleştirin: 10 x ilk iplikçikli arabellek (2 µL), dNTP mix (4 µL), RNase inhibitörü (1 µL) ve enzim (1 µL).
   3. Kısaca altındaki her şeyi toplamak için masa üstü bir santrifüj Strip'te santrifüj kapasitesi. Buz üstünde tutun.
   4. RT ana mix/ilk-strand sentez ana Mix 1 µL yukarıdaki tüpler ekleyin (Toplam örnek arabelleği hücre Collection 1 µL + RT 1 µL hacmi 2 µL/tüp =). De pipetting tarafından karıştırın. Kısaca tüm içerik alt toplamak ve buz üzerinde tutmak için spin.
   5. Yukarıdaki tüp/s için bir hava fırın 2 h 42 ° C'de kuluçkaya. Tüpler hemen tepki sonlandırma ve ikinci iplikçikli sentez tutamaçlarından buz koymak.
2. CDNA ikinci iplikçik sentez (birinci tur).
   1. İkinci strand ana mix (80 µL) 1,5 mL tüp içinde aşağıdaki sırada buz yapmak: nükleaz ücretsiz su (63 µL), 10 x ikinci strand arabellek (10 µL), dNTP mix (4 µL), DNA polimeraz (2 µL) ve RNaseH (1 µL). Vortexing, o zaman en altında toplamak ve buz üzerinde tutmak için Döndür tarafından iyi malzemeyi karıştırın.
   2. Başlat termal cycler birim önceden serin, adım 2.2.3 başlamak için hazır olması için aşağıdaki programı çalıştır (kapak ısı = kapalı; 16 ° C 2 h, 4 ° C tutmak için) ve duraklatma 16 ° C'de
   3. İkinci strand ana karıştırmak her tüpün şerit ve tutmak için bir 80 µL/şerit (veya 10 µL/tüp) buz ekleyin. Şerit için termal cycler aktarmak ve yukarıda başlatılan 16 ° C adım devam edin. 16 ° C'de 2 h için şerit kuluçkaya
   4. İkinci-strand sentez adımdan sonra sonraki cDNA arıtma adıma geçin buzda tüpler yerleştirin.
3. Çift telli cDNA arındırmak (birinci tur).
   Not: Tüm centrifugations ~ 8.000 x g oda sıcaklığında de gerçekleştirilir. Zarar vermemek için filtre kartuşu 16.000 x g ı hiçbir zaman aşmaz.
   1. Nükleaz içermeyen bir kuru ısıtma blok içinde daha sonra kullanmak için su 50-55 ° c 100 µL Isıtma başlatın. CDNA kısmi denatürasyon önlemek için 58 ° C ı hiçbir zaman aşmaz.
   2. CDNA bağlama arabellek 250 µL 1,5 mL tüp ekleyin. Precipitates arabelleği için denetleyin, sonra arabellek çözüm precipitates yeniden dağıtılması için 10 dakika için 37 ° c sıcak.
   3. CDNAs tek bir 8-boru şerit cDNA bağlayıcı arabelleğe aktarın. Bu adımda daha da aşağı akım işlemleri (8 hücrelerde 1 tüp) için hücreleri birleştirin. 2 - 3 kez pipetting ve flicking tarafından iyice Mix 3 - 4 kez. Alt içerik toplamak için spin.
   4. CDNA filtre kartuşu sıkıca (bir vitro Transkripsiyon (IVT) seti) yıkama tüpler içine koymak. Yukarıdaki karışımı filtre Merkezi'ne ekleyin. 8000 x g ~ 1 dk ya da filtreden olana, santrifüj kapasitesi. Akışı aracılığıyla atın ve yıkama tüp yerine.
   5. Yıkama arabelleği 500 µL IVT Seti'nden sütununu ekleyin.
      Not: Bu etanol yıkama arabelleğe önceden eklenmiş emin olun.
   6. 8000 x g ~ 1 dk ya da filtreden olana, santrifüj kapasitesi. Akış-through ve santrifüj 8.000 x g ~ 1 kartuş boşaltmak min için yine de atmak.
   7. CDNA filtre cDNA elüsyon tüp (1,5 mL nükleaz ücretsiz tüp) aktarın. Önceden ısıtılmış su nükleaz ücretsiz 8,5 µL filtre Merkezi için geçerlidir. İçin 2 dk bekleyin ve 8.000 x g ~1.5 min için de santrifüj kapasitesi.
   8. Daha önceden ısıtılmış su nükleaz ücretsiz 8,5 µL ile elute ve hemen ilk yuvarlak IVT ilerleyin.
      Not: Çift iplikçikli cDNA kurtarma birimi ~ 16 µL olacaktır.
4. Vitro Transkripsiyon (IVT) reaksiyon cDNA güçlendirilmiş RNA (aRNA) üretim için gerçekleştirmek (birinci tur).
   1. Hibridizasyon hava fırın 37 ° C'ye ayarla
   2. IVT aşağıdaki sırada buz üzerinde ana karışım hazırlamak: eluted çift iplikçikli cDNA adım 2.3.8 16 µL için eklemek 4 µL T7 ATP çözüm (75 mM); 4 µL T7 CTP çözüm (75 mM); 4 µL T7 GTP çözüm (75 mM); 4 µL T7 UTP çözüm (75 mM); 4 µL T7 10 x reaksiyon arabelleği; ve 4 µL T7 enzim karışımı. İyice karıştırın, spin ve buz üzerinde tutun.
   3. IVT ana Mix 24 µL cDNA 16 µL içeren her tüpün ekleyin. İçeriği tarafından pipetting yavaşça ve iyice karıştırın. Tüp 37 ° c 14 h için kuluçkaya.
      Not: Kuluçka için < 12 h ciddi verim etkiler.
   4. Dietil pyrocarbonate (non-DEPC) 60 µL RNase free su 100 µL birime artırmak ve IVT reaksiyonu durdurmak için tedavi ekleyin.
5. ARNA arındırmak.
   Not: Tüm centrifugations ~ 8.000 x g oda sıcaklığında de gerçekleştirilir. Zarar vermemek için filtre kartuşu 16.000 x g ı hiçbir zaman aşmaz.
   1. ~ 200 µL nükleaz ücretsiz kuru ısıtma blok veya PCR makinesi daha sonra kullanmak için 50-55 ° c Su Isıtma başlatın. ARNA kısmi denatürasyon önlemek için 58 ° C ı hiçbir zaman aşmaz.
   2. ARNA nükleaz içermeyen bir 1,5 mL tüp aktarın. ARNA bağlama arabellek 350 µL aRNA örnekleri ekleyin. 250 µL % 100 etanol her tüp ve tarafından 3 kez pipetting (göre do değil girdap karışımı ve spin) karışımı ekleyin.
   3. Mix hemen RNA arıtma sütun için filtre kartuşu ortasına doğru yavaşça ekleyerek aktarın. 8000 x g ~ 1 dk ya da mix tamamen filtreden geçene kadar santrifüj kapasitesi. Akış-üzerinden atmak ve atık toplama tüp yeniden
      Not: RNA etanol eklenmesi presipite başlayacak.
   4. 650 µL yıkama arabelleği her filtre kartuşu ekleyin. Santrifüj ~ 1 dk 8.000 g x veya tüm arabellek geçene kadar az için. Akışı aracılığıyla atın ve yıkama arabellek izlerini kaldırmak ek bir ~ 1 dk için filtreler spin.
   5. Filtre bir taze aRNA toplama tüp aktarın. Önceden ısıtılmış (50-55 ° C) su nükleaz ücretsiz 100 µL filtre Merkezi'ne ekleyin. 2 min için bekleyin sonra ~1.5 dk 8.000 g x veya koleksiyon tüpüne geçene kadar santrifüj kapasitesi.

3. ikinci yuvarlak amplifikasyon

1. İlk strand cDNA sentez (ikinci tur).
   1. Transfer aRNA adım 2.5.5 200 µL microfuge tüp ve vakum konsantre 100 µL için 10 µL. 10 µL azaltılmış hacmi tahmin etmek için 200 µL tüp su ile 65 dk. karşılaştırmak için vakum yoğunlaştırıcı çalıştırmak hiçbir ısı kullanarak elutant.
   2. Hibridizasyon hava 42 ° c fırında
   3. Rastgele hexamer astar, 2 µL IVT Seti'nden aRNA, kısaca, girdap ekleyin ve içeriği toplamak için spin.
   4. Microfuge tüp 70 ° c termal cycler 10 min için kuluçkaya sonra buz üzerinde yerleştirin.
   5. Aşağıdaki RT ana karışım hazırlamak: 10 x ilk strand sentez arabellek, 4 µL dNTP Mix, RNase inhibitörü 1 µL ve ArrayScript enzim 1 µL 2 µL. Mix de 200 µL microfuge metroyla hafifçe vortexing, sonra spin içeriği toplamak ve buza koyun.
   6. 8 add µL RT Master mix (ilk strand) her microfuge tüp. Tüpler için 2 h 42 ° C hava kuluçka yerleştirin.
   7. RNaseH 1 µL yukarıdaki tepki ekleyin. Mix de 2 - 3 kez pipetting ve flicking tarafından 3 - 4 kez ve içeriği toplamak için döndür. PCR makine üzerinde 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya. Kuluçka sonra hemen ikinci iplikçikli sentez adıma geçin.
2. CDNA ikinci iplikçik sentez (ikinci tur).
   1. T7-RA5 astar (at 25 ng/µL çalışma seyreltme, Tablo 2) 3 µL ekleyin ve 2 µL RNase free su her cDNA örnek için. Mix iyi ve içeriği toplamak için spin.
   2. 70 ° c termal cycler 10 min için kuluçkaya. Reaksiyon buza koyun.
   3. RT ana hazırla (ikinci strand) buza mix: 58 µL nükleaz ücretsiz su, 10 ikinci strand arabellek x 10 µL, 4 µL dNTP mix ve DNA polimeraz 2 µL. Mix de vortexing ve içeriği toplamak için döndür. Buz üstünde tutun.
   4. Yukarıdaki karışımı 74 µL her tüpün 3.2.2 adımından ekleyin. De 2-3 kez pipetting tarafından Mix ve flicking 3 - 4 kez, sonra spin içeriği toplamak için. Buz üstünde tutmak ve basılı tutun.
   5. 16 ° c termal cycler kapak ısı kapatın çevirerek önceden ne yapıyorsun? Tüpler 16 ° C'de 2 h için termal cycler yerleştirin
   6. İkinci-strand sentez adımdan sonra tüpler cDNA arıtma adıma geçin veya -20 ° C'de dondurmak için buz yerleştirin
      Not: cDNA arıtma donma önce önerilir.
3. CDNA arıtma gerçekleştirmek (ikinci tur).
   Not: Tüm centrifugations ~ 8.000 x g oda sıcaklığında de gerçekleştirilir. Zarar vermemek için filtre kartuşu 16.000 x g ı hiçbir zaman aşmaz.
   1. Daha sonra kullanılmak üzere bir kuru ısıtma blok 50 – 55 ° C nükleaz ücretsiz su ısıtma başlatın. CDNA kısmi denatürasyon önlemek için 58 ° C ı hiçbir zaman aşmaz.
   2. CDNA nükleaz içermeyen bir 1,5 mL tüp aktarın. CDNA bağlama arabellek 250 µL her tüp için ekleyin. Precipitates arabelleği için kontrol ve arabellek çözüm yeniden dağıtılması için 10 dakika için 37 ° c sıcak. 2-3 kez pipetting ve flicking tarafından iyice Mix 3 - 4 kez. İçeriği toplamak için döndür.
   3. Sıkıca cDNA filtre kartuşu yıkama tüplere sokun. Yukarıdaki karışımı filtre Merkezi'ne ekleyin. 8000 x g ~ 1 dk ya da filtreden olana, santrifüj kapasitesi. Akışı aracılığıyla atın ve yıkama tüp yerine.
   4. Yıkama arabelleği 500 µL ekleyin. Etanol yıkama arabelleğe önceden eklenmiş emin olun. 8000 x g ~ 1 dk ya da filtreden olana, santrifüj kapasitesi.
   5. Akışı aracılığıyla atın ve tekrar 8.000 x g ~ 1 kartuş boşaltmak min için de santrifüj kapasitesi. CDNA filtre cDNA elüsyon tüp aktarın.
   6. Önceden ısıtılmış su nükleaz ücretsiz 8,5 µL filtre Merkezi için geçerlidir. İçin 2 dk bekleyin ve önceden ısıtılmış su nükleaz ücretsiz ~1.5 dk. Elute tekrar ek 8,5 µL ile 8000 x g, santrifüj kapasitesi.
      Not: Çift iplikçikli cDNA kurtarma birimi ~ 16 µL olacaktır.
   7. Hemen yuvarlak IVT ikinci veya gecede cDNA-20 ° C'de dondurmak için devam edin.
4. ARNA üretim IVT tarafından ikinci turunda gerçekleştirin.
   1. Hibridizasyon hava fırın 37 ° C (36 ° C setpoint) ayarlayın.
   2. IVT aşağıdaki sırada buz üzerinde ana karışım hazırlamak: eluted çift iplikçikli cDNA adım 3.3.7 16 µL için eklemek 4 µL T7 ATP çözüm (75 mM); 4 µL T7 CTP çözüm (75 mM); 4 µL T7 GTP çözüm (75 mM); 4 µL T7 UTP çözüm (75 mM); 4 µL T7 10 x reaksiyon arabelleği; ve 4 µL T7 enzim karışımı. İyice karıştırın, kısaca içeriği toplamak için spin ve buz üzerinde tutun.
   3. IVT ana Mix 24 µL cDNA 16 µL içeren her tüpün ekleyin. İçeriği tarafından pipetting yavaşça ve iyice karıştırın. Tüp 37 ° c 14 h için kuluçkaya.
      Not: Kuluçka < 12 h için ciddi verim etkiler.
   4. DEPC 60 µL RNase free su 100 µL birime artırmak ve IVT reaksiyonu durdurmak için tedavi ekleyin.
5. ARNA arıtma gerçekleştirmek (ikinci tur).
   Not: Tüm centrifugations ~ 8.000 x g oda sıcaklığında de gerçekleştirilir. Zarar vermemek için filtre kartuşu 16.000 x g ı hiçbir zaman aşmaz.
   1. ~ 200 µL nükleaz ücretsiz kuru ısıtma blok veya PCR makinesi daha sonra kullanmak için 50-55 ° c Su Isıtma başlatın. ARNA kısmi denatürasyon önlemek için 58 ° C ı hiçbir zaman aşmaz.
   2. ARNA nükleaz içermeyen bir 1,5 mL tüp aktarın. ARNA bağlama arabellek 350 µL aRNA örnekleri ekleyin. 250 µL ACS notu % 100 etanol her tüp ve 3 kez pipetting (göre do değil girdap karışımı ve spin) karışımı ekleyin.
      Not: RNA etanol eklenmesi presipite başlayacak.
   3. Mix hemen RNA arıtma sütun için filtre kartuşu ortasına doğru yavaşça ekleyerek aktarın. 8000 x g ~ 1 dk ya da mix tamamen filtreden geçene kadar santrifüj kapasitesi. Akış-üzerinden atmak ve atık toplama tüp yeniden kullanabilirsiniz.
   4. 650 µL yıkama arabelleği her filtre kartuşu ekleyin. Santrifüj ~ 1 dk 8.000 g x veya tüm arabellek geçene kadar az için. Akışı aracılığıyla atın ve yıkama arabellek izlerini kaldırmak ek bir ~ 1 dk için filtreler spin.
   5. Filtreler taze aRNA toplama tüp aktarın. Önceden ısıtılmış su nükleaz ücretsiz 100 µL filtre Merkezi'ne ekleyin. 2 min için bekleyin sonra ~1.5 dk 8.000 g x veya bu geçene kadar santrifüj kapasitesi.
   6. Bir tüp spektrofotometre (260 nm dalga boyu) ve bioanalyzer için aliquot 2 µL analizler aRNA verim ve kalite kontrol için yayıldı.
      Not: En az 5 ng/µL konsantrasyon olması gerekir; Aksi takdirde, örnek reddetmek. Örnek ~ 1 yıl-80 ° C'de depolanan Donma-çözülme örnekleri kaçının.
   7. Üreticinin protokol (Şekil 2) sonrası aRNA ürünlerin doğru yayılan görselleştirmek için bir bioanalyzer kullanarak örnekleri kontrol edin.

4. güçlendirilmiş RNA parçalanma ve Temizleme

1. Buz (Toplam hacim 40 µL, aRNA üst üste örnek bar kodları Birleştir 2 tüpler) üzerinde aşağıdaki mix: 36 µL aRNA (200 ng toplam) ve RNA parçalanma arabelleği 4 µL. Karışım için 90 94 ° C'de kuluçkaya s.
2. Hemen buz ve RNA parçalanma dur arabelleği 4 µL ekleyin karışımı taşıyın. 100 µL birime 56 µL nükleaz ücretsiz su ekleyerek ayarlayın.
3. 350 eklemek RNA arıtma RLT arabelleğinden µL ( Tablo malzemelerigörmek) kiti ve mix de pipetting tarafından. Alkol 250 µL eklemek, de pipetting tarafından mix ve örnek RNA arıtma spin sütun için transfer. Spin için 15, 8000 x g s.
4. Sütun için yeni koleksiyon tüp aktarmak ve RPE arabelleği 500 µL ekleyin. Spin için 15 s 8.000 x g. atmak akışı aracılığıyla. %80 alkol ve spin 2 min için 500 µL de 8000 x g ekleyin.
5. Sütun yeni bir koleksiyon Tüp, sütun ve spin tam hızda 5 min için açık kapak aktarın.
6. Sütun için yeni bir koleksiyon tüp aktarmak ve 16 µL 1 dk. için tam hızda iplik, nükleaz ücretsiz su ile elute.

5. Kütüphane hazırlık

Not: kullanılan barkodlar kapsamda bir çakışma varsa IVTs bu noktada, havuza alınmış. Fosfataz tesir süresi 40 dk. Poly-nükleotit kinaz tedavi süresi 1 h olmasıdır.

1. İçin 16 µL 0.7 mL PCR tüp içinde parçalanmış aRNA, 4 µL aşağıdaki karışımı ekleyin: 10 x fosfataz arabellek, Antarktika fosfataz 1 µL ve rekombinant ribonükleaz inhibitör (Örneğin, RNaseOUT) 1 µL 2 µL. Aşağıdaki iletişim kuralı ile termal cycler kuluçkaya: 37 ° C 30 dk, 5 dk ve 4 ° C'de tutmak için 65 ° C
2. 5.1. adımdaki 0.7 mL PCR tüp için 30 µL aşağıdaki karışımı ekleyin: 17 µL nükleaz ücretsiz su, 10 x fosfataz arabellek, ATP (10 mM) 5 µL, rekombinant ribonükleaz inhibitör 1 µL 5 µL ve PNK 2 µL. 60 dk 37 ° C'de termal cycler kuluçkaya sonra 4 ° C'de basılı tutun
3. Fosfataz ve PNK-tedavi aRNA sütun Temizleme işlemi gerçekleştirin.
   1. 100 µL birime 50 µL nükleaz ücretsiz su ekleyerek ayarlayın. RLT arabellek 350 µL ekleyin ve iyice karıştırın. Alkol 250 µL eklemek, de pipetting tarafından mix ve örnek RNA arıtma spin sütun için transfer.
   2. Spin için 15 s 8.000 x g., sütun için yeni bir koleksiyon tüp Transfer ve RPE arabelleği 500 µL ekleyin.
   3. Spin için 15 s 8.000 x g., akış yoluyla atmak ve 500 µL % 80 eklemek alkol.
   4. Spin 8.000 x g. Transfer sütun için yeni bir koleksiyon Tüp, 2 dk için sütun ve spin tam hızda 5 min için kapağını açın.
   5. Sütun için yeni bir koleksiyon tüp aktarmak ve 14 µL malzemenin ~ 10 µL hacmi kurtarmak 1 dakika tam hızda iplik, nükleaz ücretsiz su ile elute. Sütun Sil. ~ 10 dk için vakum yoğunlaştırıcı kullanarak 5 µL için ses azaltın.
4. 3' ligate bir ticari kullanarak bağdaştırıcı kiti ( Tablo malzemelerigörmek).
   1. 3' bağdaştırıcısından (RA3) TrueSeq kiti 3 kıvrımlar nükleaz ücretsiz suyla seyreltik ve aliquots-20 ° C'de depolayın
   2. İçin 5 µL fosfataz ve RNA PNK-tedavi seyreltilmiş 3' adaptör 1 µL ekleyin. 70 ° c 2 min için kuluçkaya ve hemen tüp ikincil yapı oluşumunu önlemek için buza yerleştirin.
   3. 4 µL aşağıdaki karışımı ekleyin: 5 HM ligasyonu arabellek (HML), 1 µL RNase inhibitörü ve 1 µL T4 RNA ligaz (kesilmiş) 2 x 2 µL. Önceden ısıtılmış termal cycler 28 ° c için 1 h (ısıtmasız veya kapak açıkken) tüp kuluçkaya.
   4. Termal cycler kalan tepki tüp ile durmak eriyik (STP) 1 µL ekleyin ve hafifçe tüm birim yukarı ve aşağı için 6-8 kez pipette iyice karıştırın. 15 dakika 28 ° c termal cycler tepki tüp kuluçkaya sonra tüp buz üstünde yer devam ediyor.
   5. Toplam hacmi 12 µL. kullanın 6 µL almak ve geri kalan 6 µL-80 ° C'de depolamak için su nükleaz ücretsiz 3 µL Ekle
5. Bir ters transkripsiyon tepki gerçekleştirin.
   1. Aşağıda bir PCR Tüp, birleştirmek: bağdaştırıcı bakmaksızın RNA ve RNA RT astar (RTP) 1 µL 6 µL. 70 ° c 2 min için tüp kuluçkaya sonra hemen buza tüpü yerleştirin.
   2. 5.5 µL aşağıdaki karışımı ekleyin: 5 x ilk strand arabellek, 0.5 µL 12,5 mM dNTP Mix, 100 mm DTT, 1 µL RNase inhibitörü ve transkriptaz 1 µL 1 µL 2 µL. Önceden ısıtılmış termal cycler 50 ° c için 1 h tüpte kuluçkaya sonra tüp buz (örnekleri-20 ° C'de tutulabilir) yerleştirin.
6. PCR güçlendirme 5', 3'-astar ve birleştirilmiş ürün zenginleştirmek için 11-15 çevrimleri ile gerçekleştirin.
   1. Her ters transkripsiyon tepki 35,5 µL aşağıdaki karışımı ekleyin: 8,5 µL ultra saf su, 25 µL PCR karışımı (PML) ve 2 µL RNA PCR astar (RP1). Her reaksiyon için benzersiz olarak dizili bir RNA PCR astar 2 µL ekleyin (RPIX, X = 1 den 24).
   2. Aşağıdaki PCR Bisiklet koşullarını kullanarak termal cycler tüpte yükseltmek: 30 98 ° C s; 12-15 devredir 10 98 ° c s; 60 ° C'de 30 s; 30 72 ° C s; 10 dk 72 ° C; 4 ° C'de tutun

6. PCR ürünü Temizleme ve boyut seçimi

1. Oda sıcaklığında prewarm AmpureXP manyetik boncuklar. Girdap iyi dağınık, onlar kadar boncuk sonra 50 µL PCR reaksiyon (1:1 PCR ürünü: boncuklar) 50 µL ekleyin. İçeriği iyice karıştırmak için on kat kadar karıştırın.
2. 15 dk. yer için en az 5 dk, manyetik bir stand için oda sıcaklığında sıvı açık görüntüleninceye kadar kuluçkaya. Kaldırmak ve süpernatant ile 95 µL atın.
3. Taze hazırlanmış %80 200 µL eklemek alkol. En az 30 s, o zaman kaldır ve atma süpernatant için boncuk bozmadan kuluçkaya. Bunu bir kez daha tekrarlayın.
4. 15 dakika veya kadar tamamen kuru boncuk kuruması. Resuspension arabellek 32,5 µL ile resuspend. Birimin tümü iyice karıştırmak için on kat yukarı ve aşağı pipette.
5. 2 dk. yer 5 min için manyetik bir stand için oda sıcaklığında sıvı açık görüntüleninceye kadar kuluçkaya. 30 µL süpernatant ile yeni bir tüp aktarın. 20 µL nükleaz ücretsiz su 50 µL toplam hacmi elde etmek için ekleyin.
6. Boyut seçimi katı faz ters çevrilebilir immobilizasyon (SPRI) manyetik boncuklar ile PCR ürünlerinin gerçekleştirin.
   1. 0.7 x birim (35 µL) adım 6.5 ve karışımı iyice pipetting tarafından hazırlanan tüp SPRI boncuk ekleyin. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
   2. Tüp manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve 5 min için ya da boncuk ayrı kadar bekleyin. Süpernatant dikkatli bir şekilde boncukları bozmadan çıkarın.
   3. Taze hazırlanmış %85 200 µL eklemek alkol. 30 s sonra Kaldır alkol bekleyin. Boncuk 10 dakika kuruması.
7. 20 µL nükleaz ücretsiz su ekleyin. Geri mıknatıs üzerinde tüp yerleştirmek, için 5 dakika bekleyin ve sıvı kısmı rahatsız edici veya boncuk dokunmadan pipet. -20 ° C'de DNA depolamak

7. Kütüphane miktarı ve kalitesi belirlenmesi

1. DNA toplama 260 nm dalga boyu, Spektrofotometre ile kontrol edin (konsantrasyon bekleniyor en az ~ 5 – 10 ng/µL).
2. 1 µL her örneğinin boyutu dağıtım incelemek için bir yüksek-duyarlı DNA çip kullanarak bir bioanalyzer üzerinde çalıştırmak (tepe 300 – 400 bp bekleniyor (bkz. Şekil 3)).

8. örnek gönderim

1. Sıralama PCR Barkod (1:1 oran) üst üste birleştirin. Örneğin, PCR ürünleri örneklerinin RPI-1 ve RPI 2, RPI-3 ve RPI-4 ile birlikte eşit nanogram miktarlarda her birleştirmek, temel'ın toplam giriş örnek miktar gereksinimi öneriler RNA göre sıralama.
2. Sonra birleştirerek, toplam konsantrasyonu 5 ng/µL ve en az bir 10 µL birim veya sıralama tesisi çekirdek tarafından önerilen olarak ayarlayın.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan iletişim kuralını kullanarak, GABAergic nöronlar el ile edildi (Şekil 1) sıralanmış ve RNA güçlendirilmiş sonra cDNA Kütüphanesi (Şekil 2) yaptım.. yüksek derinliği⁸' de sıralı. Güçlendirilmiş RNA (aRNA) ürünleri değişmekteydi arasında 200 – 4000 bp boyutunda bir tepe dağıtım biraz üzerinde 500 ile bp (Şekil 3A). Boncuk s...

Tartışmalar

Sıralama iletişim kuralı el ile de seyrek olan nüfus farelerin beyninde etiketli veya aksi takdirde geçerli yüksek üretilen iş hücre kullanarak çalışma mümkün değildir nadir hücre nüfusu temsil eden nöron bir denetimli RNA sıralama için uygundur sıralama ve güçlendirme yöntemleri. FACS için genellikle tabi hücreler kılıf ve örnek satır baskıların ~ 9 – 14 PSI, meme boyutuna bağlı olarak aralığında geçmesi ve olay oranları istenen. Ayrıca, meme üzerine çıkıp, hücreleri sert y...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
ERCC RNA Spike-In Control Mixes	Thermo Fisher	Cat# 4456740
SuperScript III	Thermo Fisher	Cat# 18080093
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor	Thermo Fisher	Cat# 10777019
RNA fragmentation buffer	New England Biolabs	Cat# E6105S
RNA MinElute kit	Qiagen	Cat# 74204
Antarctic phosphatase	New England Biolabs	Cat# M0289
Poly nucleotide kinase	New England Biolabs	Cat# M0201
T4 RNA ligase2, truncated	New England Biolabs	Cat# M0242
Ampure Xp magnetic  beads	Beckman Coulter	Cat# A63880
SPRIselect size selection magnetic beads	Thermo Fisher	Cat# B23317
DL-AP5	Tocris	Cat# 0105
CNQX	Tocris	Cat# 1045
TTX	Tocris	Cat# 1078
Protease from Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	Cat# P5147
Message Amp II kit	Thermo Fisher	Cat# AM1751
Carbogen	Airgas	Cat# UN3156
Sylgard 184	Sigma-Aldrich	Cat# 761036
Illumina TrueSeq smallRNA kit	Illumina	Cat# RS-200-0012
Bioanalyzer RNA Pico chip	Agilent	Cat# 5067-1513
Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip	Agilent	Cat# 5067-4626
Bioanalyzer 2100	Agilent
Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.  (Leica model MZ-16F).	Leica	Model MZ-16F
Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm.	Warner instruments	Model GC100-15, Order# 30-0017
Capillary pipette puller	Sutter Instruments Co	P-97
Vibratome	Thermo Microm	HM 650V
Vibratome tissue cooling unit	Thermo Microm	CU 65