Sequenziamento di RNA unicellulare di neuroni di topo fluorescente contrassegnati con cernita manuale e doppia trascrizione In Vitro con conteggi assoluti sequenziamento (DIVA-Seq)

Riepilogo

Questo protocollo descrive il manuale procedura per isolare singoli neuroni fluorescente contrassegnati seguiti in vitro basati su trascrizione di mRNA amplificazione per la sequenza di RNA di alta profondità unicellulare di ordinamento.

Abstract

Sequenziamento di singola cellula RNA (RNA-seq) è ormai uno strumento ampiamente implementato per diluire l'espressione genica. Piattaforme di RNA-sequenziamento unicellulare commercialmente disponibili elaborano tutti gli input cellule indiscriminatamente. A volte, fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) sono usata a Monte per isolare una popolazione specificamente con etichetta di interesse. Una limitazione di FACS è la necessità di un numero elevato di celle di input con frazioni significativamente con etichetta, che è pratico per la raccolta e profilatura popolazioni rare o scarsamente etichettati neurone dal cervello del topo. Qui, descriviamo un metodo per raccogliere manualmente sparse fluorescente etichettati singoli neuroni da appena dissociato del tessuto di cervello di topo. Questo processo consente per l'acquisizione di neuroni con etichetta singola con elevata purezza e successiva integrazione con protocollo in vitro basati su trascrizione amplificazione che mantiene rapporti di trascrizione endogena. Descriviamo un metodo di amplificazione lineare doppia che utilizza identificatori univoci molecola (UNMIS) per generare singoli mRNA conteggi. Due turni di risultati di amplificazione in un elevato grado di rilevazione del gene al singola cella.

Introduzione

Sequenziamento di singola cellula RNA (RNA-seq) ha trasformato la trascrittomica studi. Mentre su larga scala singola cellula RNAseq può essere eseguita utilizzando una varietà di tecniche, come le goccioline^1,2, microfluidica³, nanogrids⁴e micropozzetti⁵, maggior parte dei metodi non possono ordinare tipi di cella definita che esprimono codificato geneticamente fluorofori. Per isolare una popolazione di selezionare la cella, fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) sono spesso usata con etichettate celle in una cella singola modalità di ordinamento. Tuttavia, FACS presenta alcune restrizioni e richiede fasi di lavorazione meticolosa del campione. In primo luogo, un gran numero di celle di input è in genere necessari (spesso parecchie milioni cellule / mL), con una frazione significativa (> 15 – 20%) contenente la popolazione con etichetta. In secondo luogo, preparazioni di cellule possono richiedere vari cicli di passaggi di centrifugazione su gradiente di densità rimuovere frazione glial, detriti e mucchi di cella che potrebbero altrimenti intasare l'ugello o flusso delle cellule. In terzo luogo, FACS impiega solitamente di colorazione e decolorazione passaggi per live/dead colorazione (ad esempio, 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), ioduro di propidio (PI) e coloranti Cytotracker), che prendere ulteriore tempo. In quarto luogo, come una regola empirica per ordinamento (ad esempio DAPI e proteina fluorescente verde/rosso (GFP/RFP)), di solito due campioni di due colori e un controllo sono necessari, che richiedono un campione senza etichetta per essere elaborati oltre il ceppo del mouse desiderato. In quinto luogo, filtro viene spesso eseguito più volte prima e durante l'ordinamento di campione per prevenire in maniera proattiva le righe di esempio intasato in una macchina di FACS. Sesto, il tempo deve essere assegnato in configurazioni di FACS più comunemente utilizzati per inizializzare e stabilizzare il flusso fluido e realizzare la calibratura della gocciolina. Settimo, controllo campioni vengono in genere eseguiti in sequenza prima della raccolta del campione reale per impostare la pagina di matrici di compensazione, rifiuto del doppietto, impostazione gates, utenti ecc o procedere sei e sette stessi prima del tempo o richiedono la assistenza di un tecnico in parallelo. Infine, post-FACS, spesso ci sono misure per garantire che solo etichettati singole cellule sono presenti in ciascun pozzetto; ad esempio, controllando i campioni in un setup di screening ad alto contenuto ad esempio un imager piatto veloce.

Per aggirare la procedura descritta sopra e facilitare un relativamente rapido, mirato sequenziamento di una piccola popolazione di singoli neuroni fluorescente contrassegnati, descriviamo un manuale di procedura seguita da due turni di un altamente sensibile in vitro di ordinamento protocollo di amplificazione, chiamato doppio in vitro trascrizione con conteggi assoluti sequenziamento (DIVA-Seq). La generazione della libreria di amplificazione e cDNA di RNA è adattata da Eberwine et al. ⁶ e Hashimshony et al. ⁷, con alcune modifiche per soddisfare interneuroni del mouse che hanno più piccoli volumi cellulare; ancora, abbiamo anche trovato che è altrettanto utile per eccitanti neuroni piramidali.

Protocollo

Tutte le procedure compreso gli oggetti degli animali sono state approvate da IACUC al Cold Spring Harbor Laboratory, NY (IACUC #16-13-09-8).

1. manuale l'ordinamento dei neuroni di topo fluorescente contrassegnati

1. Tirare il vetro microcapillari (Vedi Tabella materiali) per 10 – 15 µm di diametro uscita mediante un apposito estrattore del capillare con le seguenti impostazioni: calore: 508, pull: vuoto, vel: ora vuoto,: vuoto.
2. Collegare il tubo di 120 – 150 cm flessibile in silicone (~0.8 mm diametro interno) per una siringa filtro 0,2 µm polivinilidene difluoruro (PVDF) membrana e una valvola bidirezionale della tubazione utilizzando connettori tubo adatto.
3. Preparare 500 mL di freddo (4 ° C) liquido cerebrospinale artificiale (ACSF, tabella 1) e ossigenare di bubbling 5% anidride carbonica bilanciato ossigeno attraverso una pietra porosa per 15 minuti o fino a quando la soluzione cancella completamente.
4. Preparare 100 mL di ACSF con un cocktail di bloccanti di attività in un becher da 150 mL (tabella 1).
5. Preparare 100 mL di ACSF con 1 mg/mL proteasi di Streptococcus frazione IV in un becher da 150 mL (tabella 1).
6. Preparare 100 mL di ACSF con soluzione all'1% di siero bovino fetale (FBS) in un becher da 150 mL e ossigenare con 5% di anidride carbonica bilanciato ossigeno attraverso una pietra porosa.
7. Sezionare il cervello di un topo eutanasizzato aprendo il cranio con una piccola forbice ed estraendo il cervello fresco utilizzando una pinzetta senza danneggiare la corteccia.
   Nota: I topi di qualsiasi ceppo, età e sesso possono essere utilizzati come desiderato. Non congelare il cervello o eseguire l'ordinamento manuale sui topi iniettati con virus o altri agenti infettivi/pericolosi.
8. Mantenere il cervello in ACSF refrigerati e ossigenato, lasciando una pietra porosa collegata all'ossigeno di equilibrio del 5% di anidride carbonica durante tutta la durata del sezionamento.
9. Posizionare il cervello sul mandrino vibratome e tagliare sezioni coronali o sagittali a 300 µm spessore. Raccogliere come molte sezioni come necessario per ottenere un minimo di ~ 10 – 50 etichettati cellule fino a parecchie centinaia di cellule. Mettete le fette su un supporto di cotone fetta ingranato, collocato all'interno di un becher in modo essi sono immersi in ACSF ossigenato.
10. Spostare fette fresche in un becher contenente ACSF con attività bloccanti e blocco per 15 – 20 minuti a temperatura ambiente. Mantenere il bubbling ossigeno utilizzando pietra porosa.
11. Spostare le fette in un becher contenente ACSF con la soluzione di proteasi per effettuare la digestione delicata a temperatura ambiente: 20-30 min per P4-14 animali o fino a 45 – 60 min per animali P28-56. Tenere ossigeno bubbling.
12. Lavare ACSF con proteasi tornando fette al becher contenente ACSF con attività bloccanti soluzione per 5 – 10 minuti a temperatura ambiente. Tenere ossigeno bubbling.
13. Spostare singole sezioni in una capsula Petri 100 mm contenente ACSF con 1% FBS a temperatura ambiente. In un ambito di dissezione fluorescente, microdissect aree e livelli di interesse avere un minimo di 10 – 50 celle (fino a poche centinaia). Eseguire la microdissezione con una coppia di una pinzetta o collegando gli aghi per iniezione 22 – 28 G su supporti in legno (spiedini).
14. Utilizzando una pipetta Pasteur, spostare i pezzi microdissected in una provetta di microfuge 2 mL contenente ~0.8 mL di 1% FBS in soluzione ACSF.
15. Triturare il tessuto dissecato nel tubo microfuge a temperatura ambiente. Fare tre pipette Pasteur gambo lungo con uscita diametri decrescenti di rotolare sopra una fiamma aperta. Eseguire ~ 10 colpi con ogni pipetta, partenza con il più grande e finale con i più piccoli.
16. Dispensare le cellule dissociate in una capsula Petri 100 mm contenente ACSF ossigenato (capsula di Petri può essere sottilmente rivestito con 5 mm di 1% agar o silicone trasparente composto alle 01:10 ratio, se lo si desidera). Conservare a temperatura ambiente.
17. Attendere circa 5-7 min affinchè le cellule gradualmente stabilirsi, quindi osservare il segnale GFP/RFP sotto un microscopio di dissezione.
    Nota: Cellule singole, detriti e piccoli ciuffi sarà visibile nel campo luminoso (BF).
18. Prendere cellule GFP/RFP 10 – 15 alla volta utilizzando una pipetta capillare (dal punto 1.1) attaccata al cordone in silicone flessibile (0,4 – 0,8 mm di diametro interno) e dispensare le cellule in una capsula Petri 100 mm contenente ACSF ossigenato fresco.
19. Bloccando l'estremità della valvola della tubazione con la lingua, è necessario posizionare il capillare vicino alla cella di interesse. Catturare le cellule mediante azione capillare su alleviare il blocco e rapidamente bloccare nuovamente per evitare che il liquido in eccesso la pipetta. Dispensare le cellule su un 100mm Petri con fresco ossigenato ACSF soffiando delicatamente, osservando la punta capillare in ottica di fluorescenza del microscopio di dissezione. Scopo di raccogliere ~ 100 – 150 cellule totale.
20. Ripetere il passaggio 1.19 una o due volte più (a seconda di detriti) e trasferimento di un totale di ~ 50 – 75 cellule ad un nuovo piatto di Petri 100mm, assicurandosi che i contaminanti come detriti sono minime in ottica di interferenza differenziale campo chiaro contrasto (DIC).
21. Infine, utilizzando una pipetta microcapillary fresco ogni volta, scegliere una singola cella in non più di 0,5 µ l di volume ed espellere in un tubo di microfuge singola 0,2 mL (o una striscia di otto provette da 0,2 mL microfuge) contenente 1 µ l di tampone di raccolta del campione con primer N10B1-N10B96 (tabella 2). Rompere la punta della pipetta nella provetta microfuge per assicurare che la cella rimane nel buffer di raccolta. Scartare le pipette.
22. Congelare le cellule mettendo tubi su ghiaccio secco e la loro memorizzazione a lungo termine in un congelatore a-80 ° C fino a quando non sono pronti per essere elaborati per l'amplificazione di RNA.

2. primo amplificazione di RNA rotondo

Nota: La procedura seguente è per singola striscia di otto provette da 0,2 mL microfuge. Scala le reazioni come necessario.

1. Sintetizzare il primo filone del cDNA (primo turno).
   1. Strisce di calore dal passaggio 1.22 a 70 ˚ c per 5 min seguita da 4 ˚ c per 5 min; Ripetere due volte.
   2. Montare sul ghiaccio della trascrittasi inversa (RT) master mix/primo-filo sintesi master mix utilizzando i seguenti ingredienti (Vedi Tabella materiali): 10 x primo-filo buffer (2 µ l), miscela del dNTP (4 µ l), inibitore di RNAsi (1 µ l) e degli enzimi (1 µ l).
   3. Centrifugare brevemente la striscia su una centrifuga da tavolo per raccogliere tutto nella parte inferiore. Tenere il ghiaccio.
   4. Aggiungere 1 µ l di mix master master mix/primo-filo sintesi di RT ai tubi sopra (volume totale di 1 µ l di sample buffer da collezione cell + 1 µ l di RT = 2 µ l/tubo). Mescolare bene il pipettaggio. Brevemente girare per raccogliere l'intero contenuto nella parte inferiore e tenerlo sul ghiaccio.
   5. Incubare il tubo/s sopra a 42 ° C per 2 h in un forno ad aria. Mettere i tubi sul ghiaccio immediatamente per terminare la reazione e procedere alla fase di sintesi secondo-filo.
2. Sintetizzare il secondo filo del cDNA (primo turno).
   1. Rendere il secondo filo mix master (80 µ l) sul ghiaccio nel seguente ordine in una provetta da 1,5 mL: acqua priva di nucleasi (63 µ l), 10 x secondo strand buffer (10 µ l), miscela del dNTP (4 µ l), DNA polimerasi (2 µ l) e RNaseH (1 µ l). Mescolare gli ingredienti bene da Vortex, poi giro a raccogliere nella parte inferiore e conservare il ghiaccio.
   2. Avviare il termociclatore, eseguire il seguente programma di pre-raffreddare l'unità, essere pronti per iniziare a passo 2.2.3 (coperchio calore = off; 16 ° C per 2 h, presa di 4 ° C) e mettere in pausa a 16 ° C.
   3. Aggiungere un 80 µ l/striscia (o 10 µ l/tubo) di secondo mix master strand in ogni provetta della striscia e di tenere il ghiaccio. Trasferire la striscia per il termociclatore e riprendere il passo di 16 ° C avviato sopra. Incubare la striscia per 2 h a 16 ° C.
   4. Dopo la fase di sintesi secondo-filo, posizionare i tubi sul ghiaccio per procedere al passaggio successivo per la purificazione del cDNA.
3. Purificare il cDNA incagliato doppio (primo turno).
   Nota: Tutte le centrifugazioni vengono eseguite a ~ 8.000 x g a temperatura ambiente. Mai superare i 16.000 x g per evitare danni alla cartuccia del filtro.
   1. Iniziare il riscaldamento 100 µ l di acqua priva di nucleasi a 50 – 55 ° C per un uso successivo in un blocco di riscaldamento a secco. Mai superare i 58 ° C per evitare la parziale denaturazione del cDNA.
   2. Aggiungere 250 µ l di tampone di associazione di cDNA in una provetta da 1,5 mL. Controllare i precipitati nel buffer, quindi riscaldare la soluzione tampone a 37 ° C per 10 min per ri-sciogliere precipitati.
   3. Trasferimento cDNA da una singola striscia di 8-tubo nel buffer di associazione di cDNA. Unire le celle in questo passaggio per ulteriori processi di downstream (8 celle a 1 tubo). Mescolare accuratamente pipettaggio 2 - 3 volte e sfogliando 3 - 4 volte. Girare per raccogliere il contenuto nella parte inferiore.
   4. Installare la cartuccia di filtro cDNA in tubi di lavaggio (da un kit in vitro trascrizione (IVT)). Aggiungere il mix di cui sopra al centro del filtro. Centrifugare a 8.000 x g per ~ 1 min o fino a quando non è attraverso il filtro. Scartare il flusso continuo e sostituire il tubo di lavaggio.
   5. Aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio da IVT kit alla colonna.
      Nota: Assicurarsi che l'etanolo è stato aggiunto in precedenza per il tampone di lavaggio.
   6. Centrifugare a 8.000 x g per ~ 1 min o fino a quando non è attraverso il filtro. Eliminare il flusso continuo e centrifugare nuovamente a 8.000 x g per ~ 1 min svuotare la cartuccia.
   7. Trasferire il filtro di cDNA in una provetta di eluizione di cDNA (provetta da 1,5 mL nucleasi-free). Applicare 8,5 µ l di acqua priva di nucleasi pre-riscaldato al centro del filtro. Attendere 2 min e centrifugare a 8.000 x g per ~1.5 min.
   8. Eluire nuovamente con 8,5 µ l di acqua pre-riscaldata priva di nucleasi e procedere immediatamente per il primo turno IVT.
      Nota: Il volume di recupero del cDNA Double-stranded sarà ~ 16 µ l.
4. Eseguire una reazione di trascrizione (IVT) in vitro per la produzione di RNA (aRNA) amplificato da cDNA (primo turno).
   1. Impostare il forno di aria di ibridazione a 37 ° C.
   2. Preparare il mix master per IVT su ghiaccio nel seguente ordine: 16 µ l del cDNA double-stranded eluito dal passaggio 2.3.8, aggiungere 4 µ l di soluzione di T7 ATP (75 mM); 4 µ l di soluzione di T7 CTP (75 mM); 4 µ l di soluzione di T7 GTP (75 mM); 4 µ l di soluzione di T7 UTP (75 mM); 4 µ l di tampone di reazione 10x T7; e 4 µ l di miscela di enzima T7. Mescolare bene, far girare e tenere sul ghiaccio.
   3. Aggiungere 24 µ l di master mix IVT in ogni provetta contenente 16 µ l di cDNA. Mescolare il contenuto pipettando delicatamente e accuratamente. Incubare la provetta a 37 ° C per 14 h.
      Nota: Incubazione per < 12h colpisce gravemente la resa.
   4. Aggiungere 60 µ l di pirocarbonato dietilico non (non-DEPC) trattati acqua RNAsi-libera per aumentare il volume a 100 µ l e interrompere la reazione di IVT.
5. Purificare l'aRNA.
   Nota: Tutte le centrifugazioni vengono eseguite a ~ 8.000 x g a temperatura ambiente. Mai superare i 16.000 x g per evitare danni alla cartuccia del filtro.
   1. Iniziare il riscaldamento ~ 200 µ l di acqua priva di nucleasi a 50 – 55 ° C per un uso successivo in un blocco di riscaldamento a secco o macchina PCR. Mai superare i 58 ° C per evitare la parziale denaturazione di aRNA.
   2. Trasferire aRNA in una provetta di nucleasi-free di 1,5 mL. Aggiungere 350 µ l di tampone di aRNA associazione per ogni campione di aRNA. Aggiungere 250 µ l di etanolo al 100% a ciascuna provetta e mescolare per 3 volte di pipettaggio (non centrifugare per mescolare e filare).
   3. Trasferire immediatamente il mix alla colonna di purificazione RNA aggiungendo delicatamente al centro della cartuccia filtrante. Centrifugare a 8.000 x g per ~ 1 min o fino a quando la miscela è passato completamente attraverso il filtro. Scartare il flusso continuo e riutilizzare il tubo di raccolta dei rifiuti
      Nota: RNA inizierà a precipitazione sull'aggiunta di etanolo.
   4. Aggiungere 650 µ l di tampone di lavaggio per ogni cartuccia di filtro. Centrifugare per ~ 1 min 8.000 x g o fino a quando non ha superato l'intero buffer. Scartare il flusso continuo e girare i filtri per altri ~ 1 min rimuovere le tracce del tampone di lavaggio.
   5. Trasferire il filtro in una provetta di raccolta fresca aRNA. Aggiungere 100 µ l di acqua pre-riscaldata di nucleasi-free (50-55 ° C) al centro del filtro. Attendere per 2 min, quindi centrifugare per ~1.5 min a 8.000 x g o fino a quando non ha superato nella provetta di raccolta.

3. seconda amplificazione rotondo

1. Sintetizzare cDNA del primo filo (secondo turno).
   1. Trasferimento aRNA da passo 2.5.5 ad un tubo di microfuge 200 µ l e vuoto concentrare i 100 µ l elutant a 10 µ l. non utilizzando nessun calore, eseguito il concentratore a vuoto per un minimo di 65 confronta con 10 µ l di acqua in un tubo di 200 µ l per stimare il volume ridotto.
   2. Preriscaldare il forno aria di ibridazione a 42 ° C.
   3. Aggiungere 2 µ l di primer hexamer casuale dal kit IVT a aRNA, vortice brevemente e gira per raccogliere il contenuto.
   4. Incubare la provetta microfuge a 70 ° C per 10 min in un termociclatore, quindi posizionarlo sul ghiaccio.
   5. Preparare la seguente miscela di master RT: 2 µ l di 10 x primo buffer di sintesi strand, 4 µ l di miscela del dNTP, 1 µ l di inibitore di RNAsi e 1 µ l di enzima ArrayScript. Mix bene in un tubo di microfuge 200 µ l delicatamente nel Vortex, poi girare per raccogliere il contenuto e mettere sul ghiaccio.
   6. Aggiungere 8 µ l di master RT mescolare (prima sezione) a ciascuna provetta microfuge. Disporre le provette in un incubatore di aria di 42 ° C per 2 h.
   7. Aggiungere 1 µ l di RNaseH alla reazione di cui sopra. Mescolare bene 2 - 3 volte il pipettaggio e sfogliando 3 - 4 volte e spin per raccogliere il contenuto. Incubare a 37 ° C per 30 min su una macchina PCR. Dopo l'incubazione, procedere al passaggio di sintesi secondo-filo immediatamente.
2. Sintetizzare il secondo filo di cDNA (secondo turno).
   1. Aggiungere 3 µ l di primer T7-RA5 (alla diluizione di lavoro 25 ng / µ l, tabella 2) e 2 µ l di acqua RNAsi-libere per ogni campione di cDNA. Mescolare bene e far girare per raccogliere il contenuto.
   2. Incubare a 70 ° C per 10 min in un termociclatore. Luogo la reazione sul ghiaccio.
   3. Preparare il RT master mix (seconda parte) su ghiaccio: 58 µ l di acqua priva di nucleasi, 10 µ l di seconda strand tampone 10x, 4 µ l di miscela del dNTP e 2 µ l di DNA polimerasi. Mescolare bene su vortex e spin per raccogliere il contenuto. Tenere il ghiaccio.
   4. Aggiungere 74 µ l della miscela sopra ad ogni provetta dal punto 3.2.2. Mix ben pipettando 2 – 3 volte e sfogliando 3 - 4 volte, poi girare per raccogliere il contenuto. Il ghiaccio e tenere.
   5. Pre-raffreddare il termociclatore a 16 ° C disattivando il calore del coperchio. Disporre le provette nel termociclatore per 2 h a 16 ° C.
   6. Dopo la fase di sintesi secondo-filo, posizionare i tubi sul ghiaccio per procedere con il passaggio di purificazione del cDNA, o congelare a-20 ° C.
      Nota: purificazione del cDNA è consigliabile prima del congelamento.
3. Eseguire la purificazione del cDNA (secondo turno).
   Nota: Tutte le centrifugazioni vengono eseguite a ~ 8.000 x g a temperatura ambiente. Mai superare i 16.000 x g per evitare danni alla cartuccia del filtro.
   1. Iniziare il riscaldamento acqua priva di nucleasi a 50 – 55 ° C per un uso successivo in un blocco di riscaldamento a secco. Mai superare i 58 ° C per evitare la parziale denaturazione del cDNA.
   2. Trasferire il cDNA in una provetta di nucleasi-free di 1,5 mL. Aggiungere 250 µ l di tampone di associazione di cDNA in ogni provetta. Controllare i precipitati nel buffer e riscaldare la soluzione tampone a 37 ° C per 10 min per ri-sciogliere. Mescolare accuratamente pipettaggio 2 – 3 volte e sfogliando 3 - 4 volte. Spin a raccogliere il contenuto.
   3. Mettere saldamente la cartuccia del filtro del cDNA nei tubi di lavaggio. Aggiungere il mix di cui sopra al centro del filtro. Centrifugare a 8.000 x g per ~ 1 min o fino a quando non è attraverso il filtro. Scartare il flusso continuo e sostituire il tubo di lavaggio.
   4. Aggiungere 500 µ l di tampone di lavaggio. Assicurarsi di etanolo è stato aggiunto in precedenza per il tampone di lavaggio. Centrifugare a 8.000 x g per ~ 1 min o fino a quando non è attraverso il filtro.
   5. Scartare il flusso continuo e centrifugare nuovamente a 8.000 x g per ~ 1 min svuotare la cartuccia. Trasferire il filtro di cDNA in una provetta di eluizione di cDNA.
   6. Applicare 8,5 µ l di acqua priva di nucleasi pre-riscaldato al centro del filtro. Attendere 2 min e centrifugare a 8.000 x g per ~1.5 min Elute nuovo con ulteriori 8,5 µ l di acqua priva di nucleasi pre-riscaldato.
      Nota: Il volume di recupero del cDNA Double-stranded sarà ~ 16 µ l.
   7. Procedere immediatamente alla seconda rotonda IVT o congelare il cDNA a-20 ° C durante la notte.
4. Eseguire un secondo ciclo di produzione di aRNA da IVT.
   1. Impostare l'ibridazione aria forno a 37 ° C (36 ° C valore nominale).
   2. Preparare il mix master per IVT su ghiaccio nel seguente ordine: 16 µ l del cDNA double-stranded eluito dal punto 3.3.7, aggiungere 4 µ l di soluzione di T7 ATP (75 mM); 4 µ l di soluzione di T7 CTP (75 mM); 4 µ l di soluzione di T7 GTP (75 mM); 4 µ l di soluzione di T7 UTP (75 mM); 4 µ l di tampone di reazione 10x T7; e 4 µ l di miscela di enzima T7. Mescolare bene, far girare brevemente per raccogliere il contenuto e tenere sul ghiaccio.
   3. Aggiungere 24 µ l di master mix IVT in ogni provetta contenente 16 µ l di cDNA. Mescolare il contenuto pipettando delicatamente e accuratamente. Incubare la provetta a 37 ° C per 14 h.
      Nota: Incubazione per < 12 h colpisce gravemente resa.
   4. Aggiungere 60 µ l di non-DEPC trattata acqua RNAsi-libera per aumentare il volume a 100 µ l e interrompere la reazione di IVT.
5. Eseguire la purificazione di aRNA (secondo turno).
   Nota: Tutte le centrifugazioni vengono eseguite a ~ 8.000 x g a temperatura ambiente. Mai superare i 16.000 x g per evitare danni alla cartuccia del filtro.
   1. Iniziare il riscaldamento ~ 200 µ l di acqua priva di nucleasi a 50 – 55 ° C per un uso successivo in un blocco di riscaldamento a secco o macchina PCR. Mai superare i 58 ° C per evitare la parziale denaturazione dell'aRNA.
   2. Trasferire l'aRNA in una provetta di nucleasi-free di 1,5 mL. Aggiungere 350 µ l di tampone di aRNA associazione per ogni campione di aRNA. Aggiungere 250 µ l di etanolo al 100% grado ACS a ciascuna provetta e mescolare 3 volte di pipettaggio (non centrifugare per mescolare e filare).
      Nota: RNA inizierà a precipitazione sull'aggiunta di etanolo.
   3. Trasferire immediatamente il mix alla colonna di purificazione RNA aggiungendo delicatamente al centro della cartuccia filtrante. Centrifugare a 8.000 x g per ~ 1 min o fino a quando la miscela è passato completamente attraverso il filtro. Scartare il flusso continuo e riutilizzare il tubo di raccolta dei rifiuti.
   4. Aggiungere 650 µ l di tampone di lavaggio per ogni cartuccia di filtro. Centrifugare per ~ 1 min 8.000 x g o fino a quando non ha superato l'intero buffer. Scartare il flusso continuo e girare i filtri per altri ~ 1 min rimuovere le tracce del tampone di lavaggio.
   5. Trasferire i filtri in una provetta di raccolta fresca aRNA. Aggiungere 100 µ l di acqua pre-riscaldata nucleasi-free al centro del filtro. Attendere per 2 min, quindi centrifugare per ~1.5 min a 8.000 x g o fino a quando non ha superato.
   6. Aliquotare 2 µ l in un tubo per spettrofotometro (a 260 Nm) e bioanalyzer sviluppa analisi per verificare la qualità e la resa di aRNA.
      Nota: La concentrazione deve essere almeno 5 ng / µ l; in caso contrario, rifiutare il campione. Il campione può essere conservato per ~ 1 anno a-80 ° C. Evitare congelamento-scongelamento dei campioni.
   7. Controllare i campioni utilizzando una bioanalyzer per visualizzare la corretta diffusione dei prodotti di aRNA seguendo il protocollo del produttore (Figura 2).

4. amplificato RNA frammentazione e pulitura

1. Mescolare le seguenti operazioni sul ghiaccio (volume totale 40 µ l, unire 2 tubi di codici a barre campione non sovrapposte aRNA): 36 µ l di aRNA (Totale 200 ng) e 4 µ l di tampone di frammentazione di RNA. Incubare la miscela a 94 ° C per 90 s.
2. Spostare immediatamente la miscela di ghiaccio e aggiungere 4 µ l di tampone di arresto di RNA frammentazione. Regolare il volume a 100 µ l aggiungendo 56 µ l di acqua esente da nucleasi.
3. Aggiungere 350 µ l di tampone RLT dalla purificazione di RNA kit (Vedi Tabella materiali) e miscelare bene pipettando. Aggiungere 250 µ l di EtOH, miscelare bene pipettando e trasferire il campione nella colonna di spin di purificazione RNA. Girare per 15 s a 8.000 x g.
4. Trasferire la colonna al nuovo tubo di raccolta e aggiungere 500 µ l di tampone RPE. Girare per 15 s a 8.000 x g. scartare il flusso continuo. Aggiungere 500 µ l di 80% EtOH e spin per 2 min a 8.000 x g.
5. Trasferire la colonna ad un nuovo tubo di raccolta, aprire il coperchio della colonna e spin per 5 min a piena velocità.
6. Trasferire la colonna ad un nuovo tubo di raccolta ed eluire con 16 µ l di acqua priva di nucleasi, filatura a tutta velocità per 1 min.

5. Biblioteca preparazione

Nota: IVTs possono essere riuniti a questo punto, se non vi siano sovrapposizioni in codici a barre utilizzati. Il tempo di trattamento della fosfatasi è tempo di trattamento di 40 min. Poly-nucleotide chinasi è 1h.

1. 16 µ l di frammentata aRNA in una provetta PCR 0,7 mL, aggiungere 4 µ l della seguente miscela: 2 µ l di 10 x buffer di fosfatasi, 1 µ l di fosfatasi Antartico e 1 µ l di inibitore ricombinante della ribonucleasi (ad esempio, RNaseOUT). Incubare in un termociclatore con il seguente protocollo: 37 ° C per 30 min, 65 ° C per 5 min e tenere a 4 ° C.
2. Il tubo PCR 0,7 mL dal passaggio 5.1, aggiungere 30 µ l della seguente miscela: 17 µ l di acqua priva di nucleasi, 5 µ l di 10x buffer di fosfatasi, 5 µ l di ATP (10 mM), 1 µ l di inibitore ricombinante ribonucleasi e 2 µ l di PNK. Incubare in termociclatore a 37 ° C per 60 min, poi tenere a 4 ° C.
3. Eseguire una pulitura di colonna di fosfatasi e aRNA PNK-trattati.
   1. Regolare il volume a 100 µ l aggiungendo 50 µ l di acqua esente da nucleasi. Aggiungere 350 µ l di tampone RLT e mescolare bene. Aggiungere 250 µ l di EtOH, miscelare bene pipettando e trasferire il campione nella colonna di spin di purificazione RNA.
   2. Girare per 15 s a 8.000 x g. trasferire la colonna ad un nuovo tubo di raccolta e aggiungere 500 µ l di tampone RPE.
   3. Girare per 15 s a 8.000 x g. scartare il flusso continuo e aggiungere 500 µ l di 80% EtOH.
   4. Giro per 2 min a 8.000 x g. trasferimento della colonna ad un nuovo tubo di raccolta, aprire il coperchio della colonna e spin per 5 min a piena velocità.
   5. Trasferire la colonna ad un nuovo tubo di raccolta ed eluire con 14 µ l di acqua priva di nucleasi, filatura a tutta velocità per 1 minuto recuperare un ~ 10 µ l di volume di materiale. Scartare la colonna. Ridurre il volume a 5 µ l utilizzando un concentratore a vuoto per circa 10 min.
4. Legare una 3' adattatore utilizzando uno spot kit (Vedi Tabella materiali).
   1. Diluire il 3' adattatore (RA3) da pieghe kit 3 TrueSeq con acqua priva di nucleasi e conservare le aliquote a-20 ° C.
   2. 5 µ l di fosfatasi e RNA PNK-trattati, aggiungere 1 µ l di diluito 3' adattatore. Incubare a 70 ° C per 2 min e quindi inserire immediatamente il tubo sul ghiaccio per evitare la formazione di struttura secondaria.
   3. Aggiungere 4 µ l della seguente miscela: 2 µ l di tampone di legatura HM (HML), 1 µ l di inibitore di RNAsi e 1 µ l di ligasi T4 RNA 2 (troncati): 5x. Incubare la provetta il termociclatore pre-riscaldata a 28 ° C per 1 h (non riscaldata o con il coperchio aperto).
   4. Con il tubo di reazione rimanenti il termociclatore, aggiungere 1 µ l di soluzione bloccante (STP) e delicatamente Pipettare l'intero volume su e giù 6 – 8 volte per mescolare accuratamente. Continuare a incubare la provetta di reazione il termociclatore a 28 ° C per 15 min, quindi posizionare il tubo sul ghiaccio.
   5. 3 µ l di acqua priva di nucleasi di ottenere un volume totale di 12 µ l. uso 6 µ l e memorizzare le rimanenti 6 µ l a-80 ° C.
5. Eseguire una reazione di trascrizione inversa.
   1. Combinare le operazioni seguenti in una provetta PCR: 6 µ l di RNA adattatore-legati e 1 µ l di primer di RNA RT (RTP). Incubare la provetta a 70 ° C per 2 min, quindi immediatamente mettere il tubo sul ghiaccio.
   2. Aggiungere 5,5 µ l della seguente miscela: 2 µ l di 5 x primo strand buffer, 0,5 µ l di miscela del dNTP 12,5 mM, 1 µ l di 100 mM DTT, 1 µ l di inibitore di RNAsi e 1 µ l della trascrittasi inversa. Incubare la provetta nel termociclatore pre-riscaldato a 50 ° C per 1 h, quindi posizionare il tubo sul ghiaccio (campioni possono essere conservati a-20 ° C).
6. Eseguire l'amplificazione di PCR con 11-15 cicli per arricchire 5', prodotto dei 3'-primer.
   1. Ad ogni reazione di trascrizione inversa, aggiungere 35,5 µ l della miscela seguente: 8,5 µ l di acqua ultra-pura, 25 µ l di miscela di PCR (PML) e 2 µ l di primer di RNA PCR (RP1). Ogni reazione, aggiungere 2 µ l di un primer di RNA PCR indicizzato in modo univoco (RPIX, X = 1 a 24).
   2. Amplificare il tubo nel termociclatore usando le seguenti condizioni PCR in bicicletta: 98 ° C per 30 s; cicli di 12-15 di 98 ° C per 10 s; 60 ° C a 30 s; 72 ° C per 30 s; 72 ° C per 10 min; quindi tenere a 4 ° C.

6. PCR prodotto pulitura e selezione dimensione

1. Preriscaldare la AmpureXP biglie magnetiche a temperatura ambiente. Vortice le perline fino a quando non sono ben distribuiti, quindi aggiungere 50 µ l per la reazione di PCR (PCR prodotto: perle di 1:1) di 50 µ l. Mescolare il contenuto a dieci volte per mescolare accuratamente.
2. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti posto su un supporto magnetico per almeno 5 minuti, fino a quando il liquido appare chiaro. Rimuovere e scartare 95 µ l del surnatante.
3. Aggiungere 200 µ l di preparati 80% EtOH. Incubare per almeno 30 s, quindi rimuovere e scartare il supernatante senza disturbare le perline. Ripetere questa operazione una volta di più.
4. Asciugare le perline per 15 minuti o fino a quando è completamente asciutto. Risospendere con 32,5 µ l di tampone di risospensione. Pipettare l'intero volume su e giù dieci volte per mescolare accuratamente.
5. Incubare a temperatura ambiente per 2 min posto su un supporto magnetico per 5 min, fino a quando il liquido appare chiaro. Trasferire 30 µ l del surnatante in una nuova provetta. Aggiungere 20 µ l di acqua priva di nucleasi per ottenere un volume totale di 50 µ l.
6. Effettuare una selezione di dimensioni dei prodotti di PCR con biglie magnetiche di fase solida reversibile immobilizzazione (SPRI).
   1. Aggiungere volume x 0,7 (35 µ l) di perline SPRI il tubo preparato in passaggio 6.5 e mescolare accuratamente pipettando. Incubare per 5 min a temperatura ambiente.
   2. Mettete il tubo su un supporto magnetico e aspettare per 5 minuti o fino a quando le perline separate. Rimuovere il surnatante con attenzione senza disturbare le perline.
   3. Aggiungere 200 µ l di preparati al momento 85% EtOH. Attendere per 30 s, quindi rimuovere l'EtOH. Asciugare le perline per 10 min.
7. Aggiungere 20 µ l di acqua priva di nucleasi. Riposizionare il tubo sul magnete, attendere 5 min e pipettare fuori la porzione liquida senza disturbare o toccare le perline. Conservare il DNA a-20 ° C.

7. determinazione della biblioteca quantità e qualità

1. Controllare la concentrazione di DNA con uno spettrofotometro a 260 Nm (previsto concentrazione è almeno ~ 5-10 ng / µ l).
2. Eseguire 1 µ l di ciascun campione in un bioanalyzer utilizzando un chip di DNA ad alta sensibilità per esaminare la distribuzione di dimensione (previsto picco è a 300-400 bp (Vedi Figura 3)).

8. esempio presentazione

1. Combinare non sovrapposte sequenziamento PCR codici a barre (rapporto 1:1). Ad esempio, combinare prodotti di PCR dei campioni con RPI-1 e RPI-2, RPI-3 e RPI-4 insieme in quantità uguale nanogrammo ogni, secondo il RNA sequenziamento esempio di input totale importo requisito alle raccomandazioni di principale.
2. Dopo la combinazione, regolare la concentrazione totale di 5 ng / µ l e almeno un volume di 10 µ l o come raccomandato dal nucleo del sequenziamento.

Risultati

Utilizzando il protocollo descritto in precedenza, GABAergici neuroni erano manualmente ordinati (Figura 1) e RNA è stato amplificato, poi trasformato in una libreria di cDNA (Figura 2) ed ordinato a elevata profondità⁸. I prodotti amplificati di RNA (aRNA) ha variato fra 200 – 4.000 bp in dimensioni, con una distribuzione di picco leggermente di sopra di 500 bp (Figura 3A...

Discussione

Il manuale di protocollo di ordinamento è adatto per un supervisione sequenziamento di RNA del neurone popolazioni che sono sia scarsamente etichettati nel cervello di topi o rappresentano una popolazione di cellule rari che altrimenti non è fattibile per studiare mediante cella di alto-rendimento corrente metodi di ordinamento e di amplificazione. Cellule sottoposte a FACS solitamente subiscono pressioni di linea guaina e campione nella gamma di psi ~ 9 – 14, a seconda delle dimensioni dell'ugello e desiderato tassi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ERCC RNA Spike-In Control Mixes	Thermo Fisher	Cat# 4456740
SuperScript III	Thermo Fisher	Cat# 18080093
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor	Thermo Fisher	Cat# 10777019
RNA fragmentation buffer	New England Biolabs	Cat# E6105S
RNA MinElute kit	Qiagen	Cat# 74204
Antarctic phosphatase	New England Biolabs	Cat# M0289
Poly nucleotide kinase	New England Biolabs	Cat# M0201
T4 RNA ligase2, truncated	New England Biolabs	Cat# M0242
Ampure Xp magnetic  beads	Beckman Coulter	Cat# A63880
SPRIselect size selection magnetic beads	Thermo Fisher	Cat# B23317
DL-AP5	Tocris	Cat# 0105
CNQX	Tocris	Cat# 1045
TTX	Tocris	Cat# 1078
Protease from Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	Cat# P5147
Message Amp II kit	Thermo Fisher	Cat# AM1751
Carbogen	Airgas	Cat# UN3156
Sylgard 184	Sigma-Aldrich	Cat# 761036
Illumina TrueSeq smallRNA kit	Illumina	Cat# RS-200-0012
Bioanalyzer RNA Pico chip	Agilent	Cat# 5067-1513
Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip	Agilent	Cat# 5067-4626
Bioanalyzer 2100	Agilent
Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.  (Leica model MZ-16F).	Leica	Model MZ-16F
Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm.	Warner instruments	Model GC100-15, Order# 30-0017
Capillary pipette puller	Sutter Instruments Co	P-97
Vibratome	Thermo Microm	HM 650V
Vibratome tissue cooling unit	Thermo Microm	CU 65