Séquençage de l’ARN des cellules individuelles des neurones de souris fluorescent étiquetés à l’aide de tri manuel et Double Transcription In Vitro de chefs absolus séquençage (DIVA-Seq)

Résumé

Ce protocole décrit le manuel de procédure pour isoler les neurones fluorescent étiquetés suivies in vitro l’amplification des ARNm axée sur la transcription pour l’ordonnancement de RNA seule cellule haute-profondeur de tri.

Résumé

Séquençage de RNA unicellulaires (RNA-seq) est maintenant un outil largement utilisé pour analyser l’expression des gènes. Plates-formes de RNA-sequencing unicellulaires commercialement disponibles traitent toutes les entrées des cellules sans discernement. Parfois, la cellule activée par fluorescence triant (FACS) est utilisé en amont d’isoler une population spécifiquement marquée d’intérêt. Une limitation des FACS est la nécessité d’un nombre élevé de cellules d’entrée avec fractions nettement marquées, qui n’est pas pratique pour la collecte et le profilage des populations de neurone rares ou peu marqué par le cerveau de souris. Nous décrivons ici une méthode pour recueillir manuellement clairsemée fluorescent étiqueté de neurones fraîchement dissociées tissu de cerveau de souris. Ce processus permet de capturer des neurones seule avec haute pureté et intégration ultérieure avec un protocole de transcription basé sur l’amplification in vitro qui préserve les ratios de transcription endogène. Les auteurs décrivent une méthode de double amplification linéaire qui utilise des identificateurs de la molécule unique (UMIs) pour générer des comtes d’ARNm individuels. Deux séries de résultats d’amplification dans un degré élevé de détection de gènes par une cellule unique.

Introduction

Séquençage de RNA unicellulaires (RNA-seq) a transformé la transcriptomique études. Tandis que RNAseq de cellule unique à grande échelle peut être effectuée en utilisant une variété de techniques, telles que les gouttelettes^1,2, microfluidique³, nanogrids⁴et⁵de micropuits, la plupart des méthodes ne peut pas trier les types cellulaires définis qui expriment des fluorophores codés génétiquement. Pour isoler une population cellulaire select, cellule activée par fluorescence triant (FACS) est souvent utilisé pour trier des cellules marquées en mode single-cell. Cependant, les FACS a certaines restrictions et nécessite des étapes de traitement d’échantillon méticuleux. Tout d’abord, un grand nombre de cellules d’entrée est généralement nécessaires (souvent plusieurs millions de cellules par mL), avec une fraction significative (> 15 à 20 %) contenant la population marquée. Deuxièmement, des préparations de cellules peuvent exiger plusieurs séries d’étapes de centrifugation en gradient de densité pour éliminer la fraction gliale, débris et amas de cellule qui pourraient obstruer sinon la cellule buse ou le débit. Troisièmement, les FACS emploie généralement de coloration et de décoloration des étapes pour vivre/morts de coloration (p. ex., 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), l’iodure de propidium (PI) et des colorants Cytotracker), qui prennent plus de temps. Quatrièmement, comme une règle de tri (par exemple le DAPI et protéine fluorescente verte/rouge (GFP/DP)), habituellement deux échantillons de deux couleurs et un contrôle sont nécessaires, nécessitant un échantillon sans étiquette à traiter en plus de la souche de souris désiré. Cinquièmement, le filtrage est souvent exécuté plusieurs fois avant et Pendant l’échantillon tri pour empêcher proactivement les lignes échantillon bouché dans une machine de FACS. Sixièmement, le temps doit avoir accumulé dans des configurations de FACS plus couramment utilisées pour initialiser et stabiliser le flux de fluide et procéder au calage du droplet. Septième, contrôle des échantillons sont généralement exécuter dans l’ordre avant la collecte de l’échantillon réel à mettre en place des matrices de rémunération, rejet de doublet, définition gates, etc. utilisateurs soit procédez comme six et sept s’avance ou exiger le intervention d’un technicien en parallèle. Enfin, post-FACS, il y a souvent des mesures pour s’assurer que seulement marqué unique, les cellules sont présentes dans chaque puits ; par exemple, en cochant les échantillons dans une installation de projection haute teneur comme un imageur de plaque rapide.

Pour contourner les étapes décrites ci-dessus et de faciliter un relativement rapide, ciblé le séquençage d’une petite population de neurones fluorescent étiquetés, les auteurs décrivent un manuel de procédure suivie de deux manches d’une très sensibles in vitro de tri protocole d’amplification, appelée double in vitro transcription de chefs absolus séquençage (DIVA-Seq). La génération de RNA d’amplification et de cDNA de bibliothèque est adaptée de Eberwine et al. ⁶ et Hashimshony et al. ⁷, avec certaines modifications en fonction des interneurones de souris qui ont de plus petits volumes cellulaires ; en outre, nous avons constaté également qu’il est tout aussi utile pour les neurones pyramidaux excitateurs.

Protocole

Toutes les procédures y compris les sujets animaux ont été approuvés par IACUC à Cold Spring Harbor Laboratory, NY (IACUC #16-13-09-8).

1. Manuel de tri des neurones de souris fluorescent étiquetés

1. Tirer microcapillaries de verre (voir Table des matières) pour 10 à 15 µm sortie diamètre moyen d’un extracteur capillaire avec les paramètres suivants : chaleur : 508, tirer : vierge, vel : horaire vide, : vide.
2. Fixer tube de silicone flexible de 120 à 150 cm (~0.8 mm diamètre intérieur) à un filtre de seringue en membrane 0,2 µm polyvinylidène difluoride (PVDF) et d’une vanne de tube bidirectionnel à l’aide de raccords de tubulure adapté.
3. Préparer 500 mL de liquide céphalo-rachidien artificiel de frais (4 ° C) (ACSF, tableau 1) et oxygéné par propagation équilibré du dioxyde de carbone à 5 % d’oxygène à travers un diffuseur pendant 15 min ou jusqu'à ce que la solution efface complètement.
4. Préparer 100 mL du FSCA avec un cocktail de bloqueurs de l’activité dans un bécher de 150 mL (tableau 1).
5. Préparer 100 mL du FSCA avec 1 mg/mL Streptococcus fraction IV protéase dans un bécher de 150 mL (tableau 1).
6. Préparer 100 mL du FSCA avec 1 % sérum fœtal (SVF) solution dans un bécher de 150 mL et oxygéner avec 5 % de gaz carbonique équilibré d’oxygène grâce à un diffuseur.
7. Disséquer le cerveau d’une souris euthanasié en ouvrant le crâne avec un petit ciseau et extraire le cerveau frais à l’aide de pinces fines sans endommager le cortex.
   Remarque : La souris de toute souche, âge et sexe peuvent être utilisés comme vous le souhaitez. Ne pas congeler le cerveau ou effectuer un tri manuel sur des souris injectées avec des virus ou d’autres agents infectieux/dangereux.
8. Garder le cerveau en FSCA réfrigéré et oxygénée, laissant un diffuseur attaché à l’oxygène de balance de dioxyde de carbone de 5 % pendant toute la durée de la coupe.
9. Positionner le cerveau sur le mandrin vibratome et coupes coronales ou sagittale à 300 µm d’épaisseur. Recueillir autant de sections que nécessaire pour obtenir un minimum de ~ 10 à 50 étiquetés cellules jusqu'à plusieurs centaines de cellules. Mettez les tranches sur un support de tranche maillé coton, placé à l’intérieur d’un bécher, donc ils sont baignés dans FSCA oxygéné.
10. Déplacer des tranches fraîches dans un bécher contenant FSCA avec bloqueurs de l’activité et bloc pendant 15 à 20 min à température ambiante. Garder les bulles d’oxygène à l’aide de diffuseurs.
11. Passer les tranches dans un bécher contenant FSCA avec la solution de protéase pour réaliser la digestion douce à température ambiante : 20 à 30 min pour les P4-14 animaux ou jusqu'à concurrence de 45 à 60 min pour animaux P28-56. Garder les bulles d’oxygène.
12. Lavent FSCA avec la protéase en replaçant les tranches dans le bécher contenant FSCA avec solution de bloqueurs de l’activité pendant 5 à 10 min à température ambiante. Garder les bulles d’oxygène.
13. Déplacer les sections individuelles à un 100 mm boîte de Pétri contenant le FSCA avec 1 % FBS à température ambiante. Sous couches d’intérêt, les zones de microdissect et d’une portée de dissection fluorescent ayant un minimum de 10 à 50 cellules (jusqu'à quelques centaines). Effectuer la microdissection avec une paire de pinces fines ou en attachant des aiguilles à injection 22 – 28 G sur des supports en bois (brochettes).
14. À l’aide d’une pipette Pasteur, déplacer les morceaux de microdissected dans un tube à centrifuger 2 mL contenant ~0.8 mL 1 % FBS dans solution fsca.
15. Triturer le tissu découpé dans le tube à centrifuger à température ambiante. Faire des pipettes de Pasteur trois longues tiges avec une diminution des diamètres de sortie en les faisant rouler au-dessus d’une flamme nue. Effectuer environ 10 coups avec chaque pipette, commençant par le plus grand et en terminant par la plus petite.
16. Distribuer les cellules dissociées dans un 100 mm boîte de Pétri contenant le FSCA oxygéné (Pétri peut être finement enduite avec 5 mm de 1 % d’agar ou silicone transparent composé à 01:10 ratio, si vous le souhaitez). Conserver à température ambiante.
17. Attendez environ 5-7 min pour les cellules à progressivement s’installer, puis observez le signal GFP/DP sous un microscope à dissection.
    NOTE : Les cellules individuelles, les débris et les petites touffes sera visibles dans le vif des champs (BF).
18. Choisir les cellules GFP/DP 10-15 à la fois à l’aide d’une pipette capillaire (à l’étape 1.1) attachée à un tube souple en silicone (0,4 – 0,8 mm de diamètre intérieur) et distribuer les cellules dans un 100 mm boîte de Pétri contenant frais FSCA oxygéné.
19. En bloquant l’extrémité de la soupape du tuyau avec la langue, positionner le tube capillaire à proximité de la cellule d’intérêt. Capturer des cellules à l’aide de l’action capillaire à soulager le bloc et rapidement bloquer à nouveau afin d’éviter l’excès de liquide de pénétrer dans la pipette. Distribuer les cellules sur un 100 mm boîte de Pétri avec frais oxygéné FSCA en soufflant doucement, tout en observant l’embout capillaire sous l’optique de la fluorescence du microscope à dissection. But de recueillir ~ 100 – 150 cellules totales.
20. Répétez l’étape 1,19 fois plus (selon les débris) et le transfert total de ~ 50 – 75 cellules à une nouvelle boîte de Pétri 100 mm, en s’assurant que les contaminants tels que les débris sont minimes en optique (DIC) de contraste interférentiel différentiel lumineux-zone.
21. Enfin, en utilisant une pipette microcapillaire frais chaque fois, choisir une seule cellule à pas plus de volume de 0,5 µL et expulser dans un tube à centrifuger unique de 0,2 mL (ou une bande de huit des microtubes 0,2 mL) contenant 1 µL de tampon de collection avec des amorces N10B1-N10B96 (tableau 2). Casser l’embout de la pipette dans le tube à centrifuger pour s’assurer que la cellule reste dans la mémoire tampon de collection. Jeter les pipettes.
22. Geler les cellules en mettant des tubes sur la glace sèche et leur stockage à long terme dans un congélateur à-80 ° C jusqu'à ce qu’ils sont prêts à être transformés pour l’amplification de la RNA.

2. première ronde ARN Amplification

Remarque : La procédure suivante permet de bande unique de huit microtubes de 0,2 mL. Les réactions à l’échelle selon les besoins.

1. Synthétiser le premier brin du cDNA (premier tour).
   1. Bandes de chaleur de l’étape de 1,22 à 70 ° c pendant 5 min, suivie de 4 ° c pendant 5 min ; répéter deux fois.
   2. Assembler le mélange principal de synthèse maître du mix/premier-brin de la transcriptase inverse (RT) de glace en utilisant les ingrédients suivants (voir la Table des matières) : 10 x tampon premier-brin (2 µL), Mélange dNTP (4 µL), inhibiteur de RNase (1 µL) et enzymatiques (1 µL).
   3. Brièvement, centrifuger la bande sur une centrifugeuse de table pour recueillir tout en bas. Rester sur la glace.
   4. Ajouter 1 µL du mélange maître de maître mix/premier-brin synthèse RT aux tubes ci-dessus (volume total de 1 µL de tampon de prélèvement de cellules + 1 µL de RT = 2 µL/tube). Mélangez bien en pipettant également. Tourner brièvement pour recueillir tout le contenu en bas et le garder sur la glace.
   5. Incuber le tube/s ci-dessus à 42 ° C pendant 2 h dans un four. Mettre les tubes sur la glace immédiatement pour mettre fin à la réaction et passez à l’étape de la synthèse du deuxième brin.
2. Synthétiser le deuxième volet de l’ADNc (premier tour).
   1. Faire le deuxième fil master mix (80 µL) sur la glace dans l’ordre suivant dans un tube de 1,5 mL : eau exempte de nucléase (63 µL), 10 x deuxième brin tampon (10 µL), Mélange dNTP (4 µL), ADN polymérase (2 µL) et RNaseH (1 µL). Mélanger les ingrédients bien par Vortex, puis un essorage pour recueillir en bas et rester sur la glace.
   2. Démarrer le thermocycleur, exécutez le programme suivant pour refroidir préalablement l’unité, être prêt à commencer l’étape 2.2.3 (couvercle thermique = off, 16 ° C pendant 2 h, cale de 4 ° C) et faire une pause à 16 ° C.
   3. Ajouter un 80 µL/bande (ou 10 µL/tube) du deuxième fil master mix dans chaque tube de la bande et les garder sur la glace. Transférer la bande dans le thermocycleur et reprendre l’étape 16 ° C a lancé au-dessus. Incuber la bande pendant 2 h à 16 ° C.
   4. Après l’étape de la synthèse du deuxième brin, placer les tubes sur la glace pour passer à la prochaine étape de purification de cDNA.
3. Purifier le double brin de cDNA (premier tour).
   Remarque : Tous les centrifugations sont effectuées à ~ 8 000 x g à la température ambiante. Ne jamais dépasser 16 000 x g, pour éviter d’endommager la cartouche du filtre.
   1. Démarrer le chauffage 100 µL d’eau exempte de nucléase à 50 – 55 ° C pour une utilisation ultérieure dans un bloc chauffant à sec. Ne dépassez jamais 58 ° C pour éviter la dénaturation partielle de cDNA.
   2. Ajouter 250 µL de tampon de liaison ARNC dans un tube de 1,5 mL. Recherchez les précipités dans la mémoire tampon, puis chauffer la solution tampon à 37 ° C pendant 10 min à dissoudre à nouveau précipités.
   3. Transfert des ADNc d’une bande de 8-tube unique au tampon de liaison ARNC. Combiner les cellules dans cette étape de processus plus en aval (8 cellules dans 1 tube). Mélanger soigneusement en 2 ou 3 fois de pipetage et pichenette 3 - 4 fois. Essorage pour collecter le contenu au fond.
   4. Mettre la cartouche de filtre d’ADNc dans des tubes de lave (d’un kit de transcription (IVT) in vitro ) fermement. Ajouter le mélange ci-dessus au centre du filtre. Centrifuger à 8 000 x g pendant environ 1 min ou jusqu'à ce que c’est à travers le filtre. Jeter le cheminement et le remplacer le tube de lavage.
   5. Ajouter 500 µL de tampon de lavage du kit IVT à la colonne.
      Remarque : Assurez-vous que l’éthanol a été ajoutée au tampon de lavage précédemment.
   6. Centrifuger à 8 000 x g pendant environ 1 min ou jusqu'à ce que c’est à travers le filtre. Jeter les intermédiaires et centrifuger à nouveau à 8 000 x g pendant environ 1 min vider la cartouche.
   7. Transférer le filtre de l’ADNc d’un ADNc d’élution (tube de 1,5 mL exempte de nucléase). Appliquer 8,5 µL d’eau d’exempte de nucléase préchauffé au centre du filtre. Attendez 2 min et centrifuger à 8 000 x g pendant ~1.5 min.
   8. Éluer à nouveau avec 8,5 µL de pré chauffé eau exempte de nucléase et procéder immédiatement à la première IVT ronde.
      Remarque : Le volume de reprise des ADNc Double brin sera ~ 16 µL.
4. Effectuer une réaction de transcription (IVT) in vitro pour la production d’ARN (aRNA) amplifiée de cDNA (premier tour).
   1. Mettre le four à hybridation air à 37 ° C.
   2. Préparer le mélange maître IVT sur la glace dans l’ordre suivant : 16 µL de l’ADNc double brin éluée étape 2.3.8, ajouter 4 µL d’une solution de T7 ATP (75 mM) ; 4 µL d’une solution de T7 CTP (75 mM) ; 4 µL d’une solution de GTP T7 (75 mM) ; 4 µL d’une solution de T7 UTP (75 mM) ; 4 µL de tampon de réaction 10 x T7 ; et 4 µL du mélange enzymatique T7. Bien mélanger, tourner et tenir sur la glace.
   3. Ajouter 24 µL du mélange maître IVT dans chaque tube contenant 16 µL de cDNA. Mélanger le contenu de pipetage doucement et soigneusement. Incuber les tubes à 37 ° C pendant 14 h.
      Remarque : Une Incubation de < h 12 affecte gravement le rendement.
   4. Ajouter 60 µL de non-diéthyl pyrocarbonate (non-DEPC) traités eau exempte de RNase pour augmenter le volume à 100 µL et arrêter la réaction IVT.
5. Purifier l’aRNA.
   Remarque : Tous les centrifugations sont effectuées à ~ 8 000 x g à la température ambiante. Ne jamais dépasser 16 000 x g, pour éviter d’endommager la cartouche du filtre.
   1. Démarrer le chauffage ~ 200 µL d’eau exempte de nucléase à 50 – 55 ° C pour une utilisation ultérieure dans un bloc chauffant à sec ou de la machine PCR. Ne dépassez jamais 58 ° C pour éviter la dénaturation partielle d’aRNA.
   2. Transférer aRNA dans un tube exempte de nucléase de 1,5 mL. Ajouter 350 µL de tampon de liaison aRNA dans chaque échantillon d’aRNA. Ajouter 250 µL d’éthanol à 100 % à chaque tube et mélanger par 3 fois par pipetage (ne pas vortex pour mélanger et de spin).
   3. Transférer le mélange immédiatement dans la colonne de purification de RNA en l’ajoutant doucement vers le centre de la cartouche filtrante. Centrifuger à 8 000 x g pendant environ 1 min ou jusqu'à ce que le mélange a entièrement traversé le filtre. Jeter le cheminement et réutiliser le tube de collecte des déchets
      NOTE : RNA commencera la précipitation lors de l’addition d’éthanol.
   4. Ajouter 650 µL de tampon de lavage à chaque cartouche filtrante. Centrifuger pendant environ 1 min à 8 000 x g, ou jusqu'à ce que la mémoire tampon entière a passé. Jeter les intermédiaires et faites tourner les filtres pour un min ~ 1 supplémentaire éliminer les traces de la mémoire tampon de lavage.
   5. Transférer le filtre dans un tube de collection frais aRNA. Ajouter 100 µL de l’eau exempte de nucléase préchauffé (50-55 ° C) au centre du filtre. Attendez pendant 2 min, puis centrifuger pendant ~1.5 min à 8 000 x g, ou jusqu'à ce qu’il a passé dans le tube de prélèvement.

3. deuxième cycle d’Amplification

1. Synthétiser le premier cDNA de brin (second tour).
   1. ARNA transfert d’étape 2.5.5 à un tube à centrifuger 200 µL et vide concentrer l’éluat à 10 µL. à l’aide d’aucune chaleur, la pompe à vide pour 65 min. Comparez avec 10 µL d’eau dans un tube de 200 µL d’estimer le volume réduit de 100 µL.
   2. Préchauffer le four d’air de l’hybridation à 42 ° C.
   3. Ajouter 2 µL d’amorces hexamère aléatoire du kit IVT à aRNA, vortex brièvement et faites tourner pour collecter le contenu.
   4. Incuber le tube à centrifuger à 70 ° C pendant 10 min dans un thermocycleur, puis placez-le sur la glace.
   5. Préparer le mélange de maître RT suivant : 2 µL de 10 x premier tampon de synthèse strand, 4 µL du mélange dNTP, 1 µL d’inhibiteur de RNase et 1 µL d’enzyme ArrayScript. Mix bien dans un tube à centrifuger 200 µL par délicatement mélangé au Vortex, puis tourner pour collecter le contenu et placer sur la glace.
   6. Ajouter 8 µL du master RT mélanger (premier volet) de chaque tube à centrifuger. Placer les tubes dans un incubateur à air 42 ° C pendant 2 h.
   7. Ajouter 1 µL de RNaseH dans la réaction ci-dessus. Mélangez bien en 2 ou 3 fois de pipetage et pichenette 3 - 4 fois et un essorage pour collecter le contenu. Incuber à 37 ° C pendant 30 min sur une machine PCR. Après incubation, passez à l’étape de la synthèse du second brin immédiatement.
2. Synthétiser le second brin d’ADNc (second tour).
   1. Ajouter 3 µL d’amorce T7-RA5 (à 25 dilution de travail ng/µL, tableau 2) et 2 µL d’eau exempte de RNase dans chaque échantillon de cDNA. Bien mélanger et tourner pour collecter le contenu.
   2. Incuber à 70 ° C pendant 10 min dans un thermocycleur. Placez la réaction sur la glace.
   3. Préparer le master RT mélanger (second volet) sur glace : 58 µL d’eau exempte de nucléase, 10 µL de deuxième brin mémoire tampon 10 x, 4 µL du mélange dNTP et 2 µL de l’ADN polymérase. Bien mélanger en vortex et un essorage pour collecter le contenu. Rester sur la glace.
   4. Ajouter 74 µL du mélange ci-dessus dans chaque tube de l’étape 3.2.2. Mélangez bien en 2 à 3 fois de pipetage et pichenette 3 - 4 fois, puis essorer pour collecter le contenu. Rester sur la glace et maintenez.
   5. Refroidir préalablement le thermocycleur à 16 ° C en désactivant la chaleur couvercle. Placer les tubes dans le thermocycleur pendant 2 h à 16 ° C.
   6. Après l’étape de la synthèse du deuxième brin, placer les tubes sur la glace pour passer à l’étape de purification de cDNA ou congeler à-20 ° C.
      Remarque : purification de l’ADNc est recommandée avant la congélation.
3. Effectuer la purification de l’ADNc (second tour).
   Remarque : Tous les centrifugations sont effectuées à ~ 8 000 x g à la température ambiante. Ne jamais dépasser 16 000 x g, pour éviter d’endommager la cartouche du filtre.
   1. Démarrer le chauffage de l’eau exempte de nucléase à 50 – 55 ° C pour une utilisation ultérieure dans un bloc chauffant à sec. Ne dépassez jamais 58 ° C pour éviter la dénaturation partielle de cDNA.
   2. Transférer l’ADNc dans un tube exempte de nucléase de 1,5 mL. Ajouter 250 µL de tampon de liaison ARNC dans chaque tube. Recherchez les précipités dans la mémoire tampon et réchauffer la solution tampon à 37 ° C pendant 10 min à dissoudre à nouveau. Mélanger soigneusement en 2 à 3 fois de pipetage et pichenette 3 - 4 fois. Essorage pour collecter le contenu.
   3. Mettre fermement la cartouche de filtre d’ADNc dans les tubes de lavage. Ajouter le mélange ci-dessus au centre du filtre. Centrifuger à 8 000 x g pendant environ 1 min ou jusqu'à ce que c’est à travers le filtre. Jeter le cheminement et le remplacer le tube de lavage.
   4. Ajouter 500 µL de tampon de lavage. Assurez-vous que l’éthanol a été ajoutée au tampon de lavage précédemment. Centrifuger à 8 000 x g pendant environ 1 min ou jusqu'à ce que c’est à travers le filtre.
   5. Jeter le cheminement et centrifuger à nouveau à 8 000 x g pendant environ 1 min vider la cartouche. Transférer le filtre de l’ADNc dans un tube d’élution cDNA.
   6. Appliquer 8,5 µL d’eau d’exempte de nucléase préchauffé au centre du filtre. Attendez 2 min et centrifuger à 8 000 x g pendant ~1.5 min. élution avec supplémentaires 8,5 µL de pré chauffé eau exempte de nucléase.
      Remarque : Le volume de reprise des ADNc Double brin sera ~ 16 µL.
   7. Procéder immédiatement à la deuxième ronde IVT ou geler l’ADNc à-20 ° C durant la nuit.
4. Effectuer une deuxième série de production d’aRNA par IVT.
   1. Réglez la température d’air hybridation à 37 ° C (36 ° C point de consigne).
   2. Préparer le mélange maître IVT sur la glace dans l’ordre suivant : 16 µL de l’ADNc double brin éluée étape 3.3.7, ajouter 4 µL d’une solution de T7 ATP (75 mM) ; 4 µL d’une solution de T7 CTP (75 mM) ; 4 µL d’une solution de GTP T7 (75 mM) ; 4 µL d’une solution de T7 UTP (75 mM) ; 4 µL de tampon de réaction 10 x T7 ; et 4 µL du mélange enzymatique T7. Bien mélanger, tourner brièvement pour collecter le contenu et tenir sur la glace.
   3. Ajouter 24 µL du mélange maître IVT dans chaque tube contenant 16 µL de cDNA. Mélanger le contenu de pipetage doucement et soigneusement. Incuber les tubes à 37 ° C pendant 14 h.
      Remarque : Une Incubation de 12 h < affecte sévèrement rendement.
   4. Ajouter 60 µL de DEPC-non traités eau exempte de RNase pour augmenter le volume à 100 µL et arrêter la réaction IVT.
5. Accomplissent la purification aRNA (second tour).
   Remarque : Tous les centrifugations sont effectuées à ~ 8 000 x g à la température ambiante. Ne jamais dépasser 16 000 x g, pour éviter d’endommager la cartouche du filtre.
   1. Démarrer le chauffage ~ 200 µL d’eau exempte de nucléase à 50 – 55 ° C pour une utilisation ultérieure dans un bloc chauffant à sec ou de la machine PCR. Ne dépassez jamais 58 ° C pour éviter la dénaturation partielle de l’aRNA.
   2. Transférer l’aRNA dans un tube exempte de nucléase de 1,5 mL. Ajouter 350 µL de tampon de liaison aRNA dans chaque échantillon d’aRNA. Ajouter 250 µL d’éthanol 100 % ACS à chaque tube et mélanger 3 fois par pipetage (ne pas vortex pour mélanger et de spin).
      NOTE : RNA commencera la précipitation lors de l’addition d’éthanol.
   3. Transférer le mélange immédiatement dans la colonne de purification de RNA en l’ajoutant doucement vers le centre de la cartouche filtrante. Centrifuger à 8 000 x g pendant environ 1 min ou jusqu'à ce que le mélange a entièrement traversé le filtre. Jeter le cheminement et réutiliser le tube de collecte des déchets.
   4. Ajouter 650 µL de tampon de lavage à chaque cartouche filtrante. Centrifuger pendant environ 1 min à 8 000 x g, ou jusqu'à ce que la mémoire tampon entière a passé. Jeter les intermédiaires et faites tourner les filtres pour un min ~ 1 supplémentaire éliminer les traces de la mémoire tampon de lavage.
   5. Transférer les filtres dans un tube de prélèvement de frais aRNA. Ajouter 100 µL de l’eau préchauffée sans nucléase au centre du filtre. Attendez pendant 2 min, puis centrifuger pendant ~1.5 min à 8 000 x g, ou jusqu'à ce qu’il a passé.
   6. Aliquote 2 µL dans un tube pour spectrophotomètre (à 260 nm longueur d’onde) et bioanalyzer répandre des analyses pour vérifier la qualité et le rendement d’aRNA.
      Remarque : La Concentration doit être au moins 5 ng/µL ; dans le cas contraire, refuser l’échantillon. L’échantillon peut être conservé pendant environ 1 an à-80 ° C. Évitez les échantillons de gel-dégel.
   7. Vérifier les échantillons à l’aide d’un bioanalyzer pour visualiser la diffusion appropriée d’aRNA produits suivant le protocole du fabricant (Figure 2).

4. amplifié RNA Fragmentation et nettoyage

1. Mélanger ce qui suit sur la glace (volume total 40 µL, combiner 2 tubes de codes à barres échantillon non-cumul aRNA) : 36 µL d’aRNA (total de 200 ng) et 4 µL de tampon de fragmentation de RNA. Incuber le mélange à 94 ° C pendant 90 s.
2. Tout de suite passer le mélange de glace et ajouter 4 µL de tampon de butée de fragmentation RNA. Réglez le volume à 100 µL en ajoutant 56 µL d’eau exempte de nucléase.
3. Ajouter 350 µL de tampon RLT de la purification de RNA kit (voir Table des matières) et bien mélanger en pipettant également. Ajouter 250 µL d’EtOH et mélanger bien en pipettant également transférer l’échantillon dans la colonne de spin RNA purification. Tournez pendant 15 s à 8 000 x g.
4. Transférer la colonne à nouveau tube de prélèvement et ajouter 500 µL de tampon RPE. Tournez pendant 15 s à 8 000 x g. jeter le cheminement. Ajouter 500 µL de 80 % EtOH et essorage pendant 2 min à 8 000 x g.
5. Transférer la colonne pour un nouveau tube de prélèvement, ouvrez le couvercle de la colonne et un essorage pendant 5 min à pleine vitesse.
6. Transférer la colonne dans un nouveau tube de prélèvement et éluer avec 16 µL d’eau exempte de nucléase, tournant à plein régime pendant 1 min.

5. Bibliothèque préparation

NOTE : Parallèles peuvent être regroupés à ce stade, s’il n’y a pas de chevauchement dans les codes-barres utilisés. Le temps de traitement de phosphatase est durée de traitement de 40 min. Poly nucléotide kinase est à 1 h.

1. Dans 16 µL d’aRNA fragmenté dans un tube PCR de 0,7 mL, ajouter 4 µL du mélange suivant : 2 µL de 10 x tampon phosphatase 1 µL de phosphatase Antarctique et 1 µL d’inhibiteur de la ribonucléase recombinants (par exemple, RNaseOUT). Incuber dans un thermocycleur avec le protocole suivant : 37 ° C pendant 30 min, 65 ° C pendant 5 min et maintenez à 4 ° C.
2. Le tube de PCR de 0,7 mL de l’étape 5.1, ajouter 30 µL du mélange suivant : 17 µL d’eau exempte de nucléase, 5 µL de 10 x tampon phosphatase, 5 µL de l’ATP (10 mM), 1 µL d’inhibiteur de la ribonucléase recombinante et 2 µL du PNK. Incuber dans le thermocycleur à 37 ° C pendant 60 min, puis maintenez à 4 ° C.
3. Effectuer un nettoyage de la colonne de la phosphatase et imprégnées d’insecticide PNK aRNA.
   1. Ajuster le volume à 100 µL en ajoutant 50 µL d’eau exempte de nucléase. Ajouter 350 µL de tampon RLT et bien mélanger. Ajouter 250 µL d’EtOH et mélanger bien en pipettant également transférer l’échantillon dans la colonne de spin RNA purification.
   2. Tournez pendant 15 s à 8 000 x g. transférer la colonne dans un nouveau tube de prélèvement et ajouter 500 µL de tampon RPE.
   3. Tournez pendant 15 s à 8 000 x g. jeter le cheminement et ajouter 500 µL de 80 % EtOH.
   4. Essorage pendant 2 min à 8 000 x g. transfert la colonne vers un nouveau tube de prélèvement, ouvrez le couvercle de la colonne et un essorage pendant 5 min à pleine vitesse.
   5. Transférer la colonne dans un nouveau tube de prélèvement et éluer avec 14 µL d’eau exempte de nucléase, tourne à plein régime pendant 1 min récupérer un ~ 10 µL volume du matériau. Jeter la colonne. Réduire le volume à 5 µL en utilisant une pompe à vide pendant environ 10 min.
4. Ligaturer un 3' carte à l’aide d’un film publicitaire nécessaire (voir la Table des matières).
   1. Diluer l’adaptateur 3' (RA3) des plis kit 3 TrueSeq avec de l’eau exempte de nucléase et stocker les aliquotes à-20 ° C.
   2. À 5 µL de la phosphatase et imprégnées d’insecticide PNK RNA, ajouter 1 µL d’adaptateur dilué de 3'. Incuber à 70 ° C pendant 2 min et ensuite placer immédiatement le tube sur la glace pour empêcher la formation de la structure secondaire.
   3. Ajouter 4 µL du mélange suivant : 2 µL de 5 x HM ligature un tampon (HML), 1 µL d’inhibiteur de RNase et 1 µL de ligase d’ARN T4 2 (tronqué). Incuber le tube sur le thermocycleur préalablement chauffé à 28 ° C pendant 1 h (lorsque le couvercle est ouvert ou non chauffé).
   4. Avec le tube de réaction restant sur le thermocycleur, ajouter 1 µL de solution d’arrêt (STP) et Pipetez doucement tout le volume up et down 6 à 8 fois pour bien mélanger. Continuer à incuber le tube de réaction sur le thermocycleur à 28 ° C pendant 15 min, puis placer le tube sur la glace.
   5. Ajouter 3 µL d’eau exempte de nucléase pour obtenir un volume total de 12 µL. utilisation 6 µL et stocker le reste 6 µL à-80 ° C.
5. Effectuer une réaction de transcription inverse.
   1. Combinez ce qui suit dans un tube PCR : 6 µL d’ARN adaptateur-ligaturé et de 1 µL d’amorce ARN RT (RTP). Incuber les tubes à 70 ° C pendant 2 min, puis immédiatement placer le tube sur la glace.
   2. Ajouter 5,5 µL du mélange suivant : 2 µL de 5 x premier tampon strand, 0,5 µL du mélange dNTP 12,5 mM, 1 µL de 100 mM TNT, 1 µL d’inhibiteur de RNase et 1 µL de la transcriptase inverse. Incuber le tube dans le thermocycleur préchauffé à 50 ° C pendant 1 h, puis placer le tube sur la glace (les échantillons peuvent être conservés à-20 ° C).
6. Effectuer l’amplification PCR avec 11-15 cycles d’enrichir 5', produit ligaturé 3'-primer.
   1. Ajouter à chaque réaction de transcription inverse, 35,5 µL du mélange suivant : 8,5 µL d’eau ultra pure, 25 µL du mélange PCR (PML) et 2 µL d’amorces de PCR de l’ARN (RP1). Pour chaque réaction, ajouter 2 µL d’une amorce de PCR de l’ARN indexée de manière unique (RPIX, X = 1 à 24).
   2. Amplifier le tube dans le thermocycleur en utilisant les conditions suivantes de cyclisme PCR : 98 ° C pendant 30 s ; 12-15 cycles de 98 ° C pendant 10 s ; 60 ° C à 30 s ; 72 ° C pendant 30 s ; 72 ° C pendant 10 min ; puis maintenez à 4 ° C.

6. PCR produit nettoyage et sélection de la taille

1. Préchauffer l’AmpureXP billes magnétiques à la température ambiante. Vortex les perles jusqu'à ce qu’ils soient bien dispersés, puis ajouter 50 µL dans la réaction de PCR 50 µL (PCR produit : perles de 1:1). Mélanger le contenu à dix fois pour bien mélanger.
2. Incuber à température ambiante pendant 15 min. Place sur un support magnétique pendant au moins 5 min, jusqu'à ce que le liquide semble évident. Retirez et jetez les 95 µL du liquide surnageant.
3. Ajouter 200 µL de fraîchement préparée 80 % EtOH. Incuber pendant au moins 30 s, puis les retirer et les jeter le surnageant sans déranger les perles. Répétez cette procédure une fois de plus.
4. Sécher les perles pendant 15 min ou jusqu'à ce que complètement sec. Resuspendre 32,5 µl de tampon de resuspension. Distribuer la totalité du volume et descendre dix fois pour bien mélanger.
5. Incuber à température ambiante pendant 2 min. Place sur un support magnétique pendant 5 min, jusqu'à ce que le liquide semble évident. Transférer 30 µL du liquide surnageant dans un nouveau tube. Ajouter 20 µL d’eau exempte de nucléase pour obtenir un volume total de 50 µL.
6. Effectuez la sélection de la taille des produits PCR avec billes magnétiques de la phase solide réversible immobilisées (SPRI).
   1. Ajouter 0,7 x Band (35 µL) de perles SPRI dans le tube établi en étape 6.5 et mélanger soigneusement par pipetage. Incuber 5 min à température ambiante.
   2. Placer le tube sur un support magnétique et attendre pendant 5 min ou jusqu'à ce que les perles séparées. Retirez délicatement le surnageant sans déranger les perles.
   3. Ajouter 200 µL de fraîchement préparée 85 % EtOH. Attendre 30 s, puis enlevez l’EtOH. Sécher les perles pendant 10 min.
7. Ajouter 20 µL d’eau exempte de nucléase. Placer le tube de retour sur l’aimant, attendre 5 min et Pipeter la partie liquide sans déranger ni toucher les perles. Stocker l’ADN à-20 ° C.

7. détermination du montant de bibliothèque et de la qualité

1. Vérifier la concentration d’ADN avec un spectrophotomètre à longueur d’onde de 260 nm (prévu concentration est au moins environ 5 à 10 ng/µL).
2. Courir 1 µL de chaque échantillon sur un bioanalyzer à l’aide d’une puce à ADN haute sensibilité pour examiner la distribution granulométrique (attendu de pointe à 300 – 400 bp (voir Figure 3)).

8. présentation de type

1. Combiner les codes-barres non-cumul de PCR de séquençage (ratio 1:1). Par exemple, combiner des produits PCR des échantillons avec RPI-1 et 2-RPI, RPI-3 et RPI-4 en montants égaux nanogramme chacun, selon l’ARN séquençage du total de l’échantillon d’entrée montant exigence recommandations.
2. Après la combinaison, ajuster la concentration totale de 5 ng/µL et au moins un volume de 10 µL ou tel que recommandé par le noyau d’installation de séquençage.

Résultats

En utilisant le protocole décrit ci-dessus, GABAergiques neurones ont été manuellement triés (Figure 1) et ARN a été amplifié, puis transformé en une banque d’ADNc (Figure 2) et séquencé à haute profondeur⁸. Les produits amplifiés de RNA (aRNA) variaient entre 200 – 4 000 bp dans la taille, avec une distribution de pointe légèrement supérieure à 500 bp (Figure 3 a

Discussion

Le manuel de protocole de tri est adapté pour un séquençage de RNA encadré de neurone des populations qui sont soit peu marquées dans le cerveau de souris ou représentent une population de cellules rares qui est par ailleurs pas possible d’étudier à l’aide de la cellule active de haut débit méthodes de tri et d’amplification. Soumis à des FACS habituellement les cellules subissent des pressions de ligne gaine et échantillon de l’ordre de ~ 9 – 14 lb/po2, selon la taille de la buse et désiré taux d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
ERCC RNA Spike-In Control Mixes	Thermo Fisher	Cat# 4456740
SuperScript III	Thermo Fisher	Cat# 18080093
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor	Thermo Fisher	Cat# 10777019
RNA fragmentation buffer	New England Biolabs	Cat# E6105S
RNA MinElute kit	Qiagen	Cat# 74204
Antarctic phosphatase	New England Biolabs	Cat# M0289
Poly nucleotide kinase	New England Biolabs	Cat# M0201
T4 RNA ligase2, truncated	New England Biolabs	Cat# M0242
Ampure Xp magnetic  beads	Beckman Coulter	Cat# A63880
SPRIselect size selection magnetic beads	Thermo Fisher	Cat# B23317
DL-AP5	Tocris	Cat# 0105
CNQX	Tocris	Cat# 1045
TTX	Tocris	Cat# 1078
Protease from Streptomyces griseus	Sigma-Aldrich	Cat# P5147
Message Amp II kit	Thermo Fisher	Cat# AM1751
Carbogen	Airgas	Cat# UN3156
Sylgard 184	Sigma-Aldrich	Cat# 761036
Illumina TrueSeq smallRNA kit	Illumina	Cat# RS-200-0012
Bioanalyzer RNA Pico chip	Agilent	Cat# 5067-1513
Bioanalyzer High Sensitvity DNA chip	Agilent	Cat# 5067-4626
Bioanalyzer 2100	Agilent
Dissection microscope with fluorescence and bright field illumination with DIC optics.  (Leica model MZ-16F).	Leica	Model MZ-16F
Glass microcapillary: Borosilicate capillary tubes 500/pk. OD= 1 mm, ID=0.58 mm, wall= 0.21 mm, Length= 150 mm.	Warner instruments	Model GC100-15, Order# 30-0017
Capillary pipette puller	Sutter Instruments Co	P-97
Vibratome	Thermo Microm	HM 650V
Vibratome tissue cooling unit	Thermo Microm	CU 65