Lyssaviruses tespiti için evrensel Iç Içe Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu değerlendirilmesi

Özet

Bir Pan-Lyssavirus iç içe Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu özellikle tüm bilinen lyssaviruses algılamak için geliştirilmiştir. Farklı hayvan türlerinin kuduz beyin örneklerini kullanarak doğrulama Bu yöntemin altın standart floresan antikor testi için bir duyarlılık ve özgüllük eşdeğer olduğunu gösterdi ve rutin kuduz tanısı için kullanılabilir.

Özet

Kuduz virüsü ve aile RhabdoviridaeIçinde cins Lyssavirus diğer üye türlerini algılamak için, Pan-Lyssavirus yuvalanmış Ters transkripsiyon polimeraz zincir REAKSIYONU (Iç Içe RT-PCR) koruma altındaki bölgeyi tespit etmek için geliştirilmiştir lyssaviruses 'in nüklizoprotein (N) geni. Yöntem Ters transkripsiyon uygular (RT) olarak viral RNA kullanarak şablon ve oligo (dT)₁₅ ve rasgele hexamers sentezlemek için astar olarak VIRAL tamamlayıcı DNA (cDNA). Daha sonra, viral cDNA bir 845 BP N gen parçası dış astar kullanarak ilk yuvarlak PCR yükseltmek için bir şablon olarak kullanılan, ikinci tur iç içe PCR tarafından son 371 BP parçası iç astar kullanarak yükseltmek için takip. Bu yöntem, kuduz virüsleri (RABV) farklı genetik klades algılayabilir. Doğrulama, kullanarak 9.624 beyin numuneleri sekiz yerli hayvan türlerinden 10 yıl içinde klinik kuduz teşhis ve gözetim Çin, yöntemi olduğunu gösterdi 100% duyarlılık ve 99,97% özgüllüğü ile karşılaştırıldığında doğrudan floresan antikor testi (FAT), Dünya Sağlık Örgütü (WHO) ve Dünya Hayvan Sağlığı Örgütü (OIS) tarafından önerilen altın standart yöntemdir. Buna ek olarak, yöntem de özellikle% 15 diğer onaylı ve iki roman Lissavirüse türü hedeflenen N gen parçası yükseltmek olabilir 10 rapordaki Uluslararası komitenin taksonomi üzerinde virüslerin (ICTV) sentezlenmiş bir mimik tespiti tarafından değerlendirilir Tüm lyssaviruses, N gen plazmids. Yöntem, kuduz tanısı için FAT 'e uygun bir alternatif sağlar ve Çin 'in Ulusal Standardı (GB/T36789-2018) olarak onaylanmıştır.

Giriş

Kuduz, Lyssavirus¹cinsi içinde virüslerin neden olduğu dünya çapında bir zoonotik hastalıktır. Lyssaviruses (aile Rhabdoviridae), beş proteini kodlayan yaklaşık 12 KB genomu olan tek negatıf telli RNA virüsleridir: N, Fosfoprotein (P), matris proteini (M), glikoprotein (G) ve büyük protein veya polimeraz (L). N geni, genetik mesafe ve antijenik desenlerin nükvendotid dizilerine dayanarak, lyssaviruses klasik kuduz virüsü (RABV) ve kuduz ile ilgili virüsler (RRV) içeren 16 türe bölünmüştür: Lagos bat Virus (LBV), Duvenhage virüsü (DUVV ), Mokola virüsü (mokv), Avrupa bat Lissavirüse 1 (eblv-1), Avrupa bat Lissavirüse 2 (eblv-2), Avustralya bat Lissavirüse (ablv), Aravan virüs (arav), Ikoma virüsü (ıkov), bokeloh bat Lissavirüse (bblv), gannoruwa bat Lissavirüse (gblv), Irkut virüsü (ırkv), Khujand virüs (khuv), Batı Kafkas bat virüs (wcbv), Shimoni bat Virus (shibv), ve Lleida bat Lissavirüse (llebv)². Son zamanlarda, iki ek lyssaviruses tespit edilmiştir: Kotalahti bat Lissavirüse (KBLV) bir Brandt 's yarasa (Myotis brandtii) içinde Finlandiya 'da 2017³ ve Tayvan bat Lissavirüse (twblv) bir Japon Pipistrelle izole () izole Pipistrellus abramus) Içinde Tayvan, Çin içinde 2016 – 2017⁴.

Tüm memeliler kuduz hassastır; Ancak, hiçbir brüt patognomonik lezyonlar veya spesifik klinik belirtiler kimlik izin verir, ve tanı sadece laboratuvarda yapılabilir⁵. Kuduz tanısı için en yaygın olarak kullanılan yöntem, hem kim hem de OIE^5,6tarafından altın standardı olarak kabul edilen yağ şeklindedir. Yine de, FAT bozulabilir/Autolyzed beyin dokusu örnekleri üzerinde güvenilir olmayan sonuçlar üretebilir. Buna ek olarak, beyin omurilik sıvısı (CSF), tükürük ve idrar gibi biyolojik sıvı örneklerinin tahlil edilmesi için kullanılamaz, böylece büyük ölçüde ölüm öncesi tanı⁷' de istihdamını engelliyor. Alternatif konvansiyonel tanı testleri, kuduz doku kültürü enfeksiyon testi (rtcıt) ve fare aşı testi (MIT) gibi, birkaç gün gerektirir⁶, hızlı bir tanı gerekli olduğunda büyük bir dezavantajı.

Çeşitli moleküler tanı testleri (örn., RT-PCR tarafından viral RNA tespiti, PCR – enzim bağlantılı İmmünosorbent tahlil [PCR-ELıSA], situ hybridization, ve gerçek zamanlı PCR) kuduz tanısı için hızlı ve hassas teknikler olarak kullanılır⁸. RT-PCR artık rutin kuduz tanısı için OIS tarafından tavsiye edilir, ve bir heminested (hn) PCR tüm lyssaviruses⁵algılamak Için tanısal testler ve karasal hayvanlar Için aşılar RIVE Kılavuzu 'nda açıklanmıştır. Burada bir Pan-Lissavirüse iç içe RT-PCR, hangi tüm 18 Lissavirüse türlerin spesifik ve hassas algılama sağlayan veya FAT tarafından elde aşan karşılaştırılabilir tarif. Yöntemin prensibi, cDNA 'ya hedef RNA 'nın (Lissavirüse N geni tarafından bulunan bölge) bir RT 'dir ve ardından iki tur PCR ile cDNA amplifikasyonu tarafından izlenir. CDNA bir 845 BP parçası yükseltmek için dış astar ile ilk yuvarlak PCR uğrar; daha sonra, ikinci tur PCR ilk yuvarlak PCR ürünü bir 371 BP parçası iç astar ile yükseltmek için bir şablon olarak kullanır. PCR iki tur önemli ölçüde tahlil duyarlılığı artar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu protokolde fareler kullanımı askeri veteriner hekimliği Enstitüsü hayvan refahı Yönetim Komitesi, Askeri Tıp Bilimleri Akademisi, Çin (laboratuar hayvan bakımı ve kullanım Komitesi yetkilendirme, izin tarafından onaylanmıştır numarası JSY-DW-2010-02). Laboratuar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için tüm kurumsal ve ulusal yönergeler takip edildi.

1. RNA ekstraksiyonu

1. Guanidinyum isothiocyanate-fenol-kloroform bazlı ekstraksiyon yöntemleri veya ticari olarak kullanılabilen viral RNA ekstraksiyon kitleri kullanılarak kuduz şüphelisi beyin dokusu, cilt biyopsisi, tükürük veya CSF veya rabv enfekte hücre kültüründen RNA özü. Hazırlanmış RNA 'ya hemen kullanın veya gerekli olana kadar-80 °C ' de saklayın.

2. viral RNA 'nın ters transkripsiyonu

1. Tablo 1 ' de listelenen RT reaktifleri dondurucudan çıkarın, buzdan saklayın ve kullanmadan önce onları çözün ve girdap yapın.
2. Tablo 1' de listelenen reaktifler Ile 0,2 ml PCR tüpünde 12 ΜL RT reaksiyon karışımı hazırlayın. Ana karışımı bir hacmi gerekli olandan daha büyük en az bir reaksiyon boyutu hazırlayarak pipetleme varyasyonları için izin verin.
3. Bir şablon odasında PCR iş istasyonu içindeki RT reaksiyon karışımında 8 μL örnek, pozitif kontrol RNA veya negatif kontrol ekleyin. RT pozitif kontrolü, sabit RABV gerinim CVS-11 (zorluk virüsü standardı-11) ile enfekte hücre kültüründen çıkarılan ve-80 °C ' de saklanan RNA 'dır. Negatif denetim RNase-Free ddH₂O içerir.
4. RT tüpler içeriğini vortexing ile karıştırın; sonra, kısaca Santrifüjü.
5. Reaksiyon tüplerini termal bisikletçiye yükleyin. CDNA sentezi programını aşağıdaki koşullara göre ayarlayın: 42 °C için 90 dk, 95 °C 5 dakika ve 4 °C bekletin. Reaksiyon hacmini 20 μL olarak ayarlayın. RT çalışmasını başlatın.

3. ilk yuvarlak PCR

1. Masa 2 ' de listelenen PCR reaktifleri, kullanım kadar temiz bir odada buz üzerinde tutun; sonra, çözüyor ve onları girdap.
2. İlk yuvarlak PCR karışımını, Tablo 2' de listelenen reaktifler Ile 0,2 ml PCR tüpüne hazırlayın.
3. Bir şablon odasında bir PCR iş istasyonu içinde ilk yuvarlak PCR karışımı içine cDNA veya plazmid 2 μL örnek ekleyin. PCR pozitif kontrol CVS-11 cDNA adım 2,3 yukarıda RT yöntemi için belirtildiği gibi hazırlanmıştır. PCR negatif denetim ddH₂O.
4. Mühürlü tüpleri bir PCR termal bisikletçine aktarın ve Tablo 3' te listelenen parametreleri kullanarak döngüye gidin.

4. ikinci tur PCR

1. İkinci Tur PCR karışımını, Tablo 4' te listelenen reaktifler kullanılarak 0,2 ml PCR tüpünde hazırlayın.
2. İkinci Tur PCR karışımından 2 μL ilk yuvarlak PCR ürününü ekleyin. Buna ek olarak, ddH₂O ikinci yuvarlak PCR negatif bir denetim olarak içerir.
3. 3,4 adımda verilen aynı parametreleri kullanarak PCR Termal Bisiklet gerçekleştirin.

5. ağak jelleri üzerinde Elektroforez tarafından PCR ürünlerinin Analizi

1. Bir 1,5% agaroz jel ekleyerek hazırlayın 1,5 g agaroz için 100 ml Tris-asetat-EDTA (Tae) ve bir mikrodalga fırında ısıtarak iyice çözünmesi.
2. Etidyum bromür (EB) (% 0,01 son konsantrasyonda) ekleyin veya başka bir ticari EB ikame. Jel kalıp içine dökün ve en az 30 dakika için ortam sıcaklığında katılaşma için bırakın.
3. Her PCR ürününün 5 μL 'i 1 μL 6x yükleme tamponunu karıştırarak yükleme örneklerini hazırlayın.
4. Numuneleri ve uygun DNA işaretleyicisini kuyulara ayrı olarak yükleyin ve jeli yaklaşık 30-45 dk. 120 V 'ye kadar boya hattı yaklaşık% 75-% 80 ' e kadar jel ile çalıştırın.
5. Elektriği kapatın, elektrotları güç kaynağından ayırın ve ardından jeli jel kutusundan dikkatle çıkarın.
6. DNA parçalarını görselleştirmek ve fotoğraf çekmek için cihaz belgeleyen bir UV jeli kullanın.

6. Iç Içe RT-PCR karakterizasyonu

1. 6,1. 18 lyssaviruses plazmids tespiti için özgüllük ve hassasiyet
   1. PCR için her Lissavirüse (16 ICTV türü ve iki roman türü) tam N geni içeren 18 ticari plazmids sipariş.
   2. Avogadro 'nun numarasını (N_A) ve aşağıdaki formülü kullanarak Plasmid 'nin kopya numarasını hesaplayın.
      [(g/μL plazmid DNA)/(plazmid uzunluğu BP x 660)] x 6,022 x 10²³ = moleküllerin sayısı/μL
   3. DdH₂O 'da tüm 18 plazmids stok çözümlerini (2,24 x 10⁹ molekülleri/μL) hazırlayın.
   4. DdH₂o, tüm 18 plazmids 9 10 kat seri dilüsyonları gerçekleştirin. 90 μL DDH₂o ile her bir Plasmid stokunda 10 μL seyreltme. Vortex ve santrifüjler kısaca.
   5. 3-5 bölümlerde açıklandığı gibi PCR amplifikasyonu gerçekleştirin.
   6. Bir dizi Lissavirüse plazmid algılayarak iç içe PCR 'nin özgüllüğü ve hassasiyetini analiz edin.
2. Belirlenmesi d yapılmasına l yok
   1. Kuduz virüs gerinim CVS-11 hücre kültürünün titresini 10^5,5 tcid₅₀/ml 'ye ayarlayın (virüs titresini OIS kılavuzuna göre belirlenir)⁵.
   2. CVS-11 ' i n 5 10 kat seri seyreltme işlemini gerçekleştirin (hisse senedi çözümü 10^5,5 tcid₅₀/ml) adımda açıklandığı gibi 6.1.4.
   3. 1-5 bölümlerde açıklandığı gibi tüm viral dillerin RNA ekstraksiyonu ve iç içe RT-PCR amplifikasyon prosedürlerini gerçekleştirin.
3. Compar iSon en iç Içe RT-PCR "altın standardı" yağ ile
   1. Tüm klinik numuneleri iç içe RT-PCR ile sınayın ve sonra sonuçları FAT⁵ ve N gen sıralaması⁹ile onaylayın.
   2. SAS 9,1 ile istatistiksel analiz için normalleştirilmiş verileri kullanın. Tanı testlerinin istatistiksel karşılaştırması için Kappa testi ve McNemar 'ın Chi-squared testini kullanın (SAS komutu: proc FREQ; tablo/katılıyorum). Abinomial dağılım varsayarak güven aralıklarını hesaplayın.
4. Bozulmuş numunelerin testinde etkinliğinin değerlendirilmesi
   1. 37 °C ' de kuduz köpeklerin iki teyit edilmiş klinik beyin dokusu örneğini açığa çıkarın.
   2. 37 °C ' de, iç içe RT-PCR, FAT ve MıT⁵' de her bir pozlama gününde iki numuneyi tahlil etme.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

18 Lissavirüse türünün tespit edilmesi için yuvalanmış RT-PCR sonuçları Şekil 1' de gösterilir. Tüm PCR pozitif kontroller negatif kontrol hiçbir bant ile ikinci tur amplifikasyonlar ilk-ve 371 BP beklenen 845 BP gösterdi. Tüm 18 lyssaviruses beklenen 845 ve/veya 371 BP bantları, iç içe RT-PCR tüm 18 lyssaviruses algıladı gösteren üretilen. On altı lyssaviruses plazmids PCR iki turda verimli amplifikasyon vardı, ama iki, yani ARAV ve ıKOV, ya ilk veya ikinci tur PCR...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Şu anda, rabv Çin 'de neredeyse tüm insan ve hayvan kuduz sorumlu büyük bir Lissavirüse, yanı sıra diğer ülkelerde. Buna ek olarak, bir ıRKV varyantı ilk olarak 2012¹⁰' da Northeast China 'Daki Jilin eyaletinde Murina leucogaster bat 'tan tespit edildi ve 2017¹¹' de Liaoning eyaletinde bir köpeğin ölümüne neden olduğu bildirilmiştir. En son, bir roman Lyssavirus, TWBLV, Ayrıca Tayvan, Çin 'de bir Japon Pipistrelle yarasa tespit edildi ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 × TAE	Various	Various
6 × loading buffer	TakaRa	9156
Agarose	US Everbright® Inc	A-2015-100g
ddH2O	Various	Various
DL 2,000 Marker	Takara	3427A
dNTPs (10 mM)	TakaRa	4019
dNTPs (2.5 mM)	TakaRa	4030
Electrophoresis System	Tanon	EPS300
Ex-Taq (5 U/μL)	TakaRa	RR001
Gel Imaging System	UVITEC	Fire Reader
Microcentifuge tubes	Various	Various
M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL)	TakaRa	2641A
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermoscientific	ND1000
Oligo (dT)15	TakaRa	3805
PCR Machine	BIO-RAD	T100
PCR Tubes	Various	Various
Phusion High-Fidelity DNA Polymearase	NEW ENGLAND BioLabs	M0530S
Pipettors	Various	Various
Random Primer	TakaRa	3801
RNase Inhibitor (40 IU/µL)	TakaRa	2313A
RNase-free ddH2O	TakaRa	9102
Taq Buffer (10×)	TakaRa	9152A
Tips	Various	Various
Vortex mixer	Various	Various