Lyssaviruses 검출을 위한 보편적 중첩 역방향 전사 중 합 효소 연쇄 반응의 평가

요약

중첩 된 범-리스 사 바이러스는 역 전사 중 합 효소 연쇄 반응을 특이 적으로 알려진 모든 리즈 사 바이러스를 검출 하기 위해 개발 되었다. 다른 동물 종의 광견병 뇌 샘플을 이용한 검증은이 방법이 금 표준 형광 항 체 시험에 상응 하는 민감도 및 특이성을 가지 며, 일상적인 광견병 진단을 위해 사용 될 수 있음을 보여주었다.

초록

가정 내에서 리 조 바이러스 의 광견병 바이러스 및 기타 종 종을 검출 하는 것은 Rhabdo비리대에 있어서, 상기 팬 리스 사 바이러스 중첩 역방향 전사 중 합 효소 연쇄 반응 (중첩 된 rt-pcr)은 보존 된 영역을 검출 하기 위하여 개발 된 광견병 (N) 유전자의. 이 방법은 바이러스 RNA (cDNA)를 합성 하기 위한 프라이 머로 서의 템플릿 및 올리고 (dT)₁₅ 와 랜덤 hexamers로 서 바이러스가 있는 DNA를 사용 하 여 역 전사 (RT)를 적용 한다. 이어서, 바이러스 성 cDNA는 외부 프라이 머를 사용 하 여 1 라운드 PCR에서 845 bp N 유전자 단편을 증폭 하는 템플릿으로 사용 되 고, 이어서 제 2 라운드 형 PCR에 의해 내부 프라이 머를 이용 하 여 최종 371 bp 단편을 증폭 한다. 이 방법은 광견병 바이러스 (RABV)의 상이한 유전 적 clades를 검출할 수 있다. 중국에서의 10 년의 임상 광견병 진단 및 감시에서 8 개의 국내 동물 종에서 9624 두뇌 표본을 사용 하 여 유효성 검사는, 방법이 직접 형광에 비교 하 여 100% 감도 및 99.97% 특이성을가지고 있음을 보여주었습니다 항 체 시험 (지방), 세계 보건 기구 (WHO)와 동물 건강을 위한 세계 조직 (OIE)에 의해 권장 되는 금 표준 방법. 또한, 상기 방법은 또한 합성의 모방 검출에 의해 평가 된 바와 같이, 바이러스의 분류에 관한 국제 위원회의 제 10 회 보고서에서의 타겟 된 N 유전자 단편을 다른 승인 및 2 개의 신규 리 사이 바이러스 종들에 게 증폭 시킬 수 있다 모든 리즈 사 바이러스의 N 유전자 플라스 미드. 이 방법은 광견병 진단에 대 한 지방에 대 한 편리한 대안을 제공 하 고 중국의 국가 표준 (T36789)로 승인 되었습니다.

서문

광견병은 인 리스 사코 바이러스¹내에서 바이러스에의 한 전 세계적으로 발생 한 질병입니다. 리스 사 바이러스 (가족 Rhabdo비리대)는 5 개의 단백질을 인코딩하는 약 12kb 게놈을 갖는 단일 음성 가닥 RNA 바이러스: N, phosphoprotein, 매트릭스 단백질 (G), 당단백질 및 큰 단백질 또는 중 합 효소 (L). N 유전자, 유전 거리 및 항 원 성 패턴의 뉴클레오티드 서 열에 기초 하 여, 리 사이 바이러스는 고전적인 광견병 바이러스 (RABV) 및 광견병 관련 바이러스 (RRV)를 포함 하는 16 종으로 구분 되었다: 라고스 박쥐 바이러스 ), 모 코 롤라 바이러스 (MOKV), 유럽 박쥐 리스 사 바이러스 1 (EBLV-1), 브라질의 박쥐 리스 사 바이러스 2 (EBLV), 아 라 반 바이러스의 아 반 바이러스,이 코 코 (IKOV),이 르 쿠 바이러스 (GBLV), Irkut (IRKUT), (이로 브 루), Gannoruwa Khujand 바이러스 (쿠 브), 웨스트 코 카 서 스 박쥐 바이러스 (WCBV), 시 나 니 박쥐 바이러스 (L레프) 및 레이다 박쥐 리스 사 바이러스 최근 두 가지 추가 리 사이 바이러스가 확인 되었습니다: 일본 pipistrelle 에서 고립 된 2017 3 및 대만 박쥐 리스 사 바이러스 (Twblv)에서 브란트의 브랜드 박쥐 (myotis 브랜디 티) 로부터 고립 된 (kblv) Pipistrellus abramus), 중국 대만에서 2016 년-2017⁴.

모든 포유류는 광견병에 취약 합니다. 그러나, 총 병리학 적 병 변 또는 특정 임상 징후는 그것의 식별을 허용 하지 않으며, 진단은 실험실 에서만 만들 수 있습니다⁵. 광견병 진단을 위한 가장 널리 사용 되는 방법은 지방, 누구와 oie⁵에 의해 금 표준으로 간주 됩니다.^,6. 그럼에도 불구 하 고, 지방은 저하/자동 화 된 뇌 조직 샘플에 대 한 신뢰할 수 없는 결과를 생성 합니다. 추가적으로, 뇌 척 수액 (CSF), 타 액 및 소변과 같은 생물학적 유체 표본을 분석 하는 데 사용할 수 없으며,이로 인해 antemortem 진단⁷에서의 고용을 크게 배제 합니다. 광견병 조직 배양 감염 시험 (RTCIT) 및 마우스 접종 시험 (MIT)과 같은 대안적인 종래의 진단 시험은 신속한 진단이 필수적 일 때 주요한 단점이 있고, 며칠⁶을 필요로 한다.

다양 한 분자 진단 시험 (예를 들어, RT-PCR에의 한 바이러스 성 RNA의 검출, 효소-결합 면역 흡착 분석 법 [PCR ELISA], 현장 혼성 화 및 실시간 PCR)은 광견병 진단⁸에 대 한 신속 하 고 민감한 기술로 사용 된다. RT-PCR은 현재 일상적인 광견병 진단을 위해 OIE에 의해 권장 되 고 있으며, 각 리 사 바이러스⁵를 검출 하는 것은 지상 동물에 대 한 진단 검사 및 백신의 Oie 매뉴얼에 기재 되어 있다. 여기에서 우리는 지방에 의해 얻어진 것에 필적 하거나 초과 하는 모든 18 개의 리 사 바이러스 종의 특이 하 고 민감한 검출을 허용 하는 범 리 사 바이러스 중첩 RT-PCR을 설명 한다. 상기 방법의 원리는 표적 RNA (리즈 사 바이러스 N 유전자의 보존 부위)를 cDNA로 넣고, 2 차례의 PCR로 cDNA의 증폭을 따른다. 상기 cDNA는 845 bp 단편을 증폭 하기 위해 외부 프라이 머로 1 라운드 PCR을 겪는 다; 이어서, 상기 제 2 라운드 pcr은 371 bp 단편을 내부 프라이 머로 증폭 하기 위한 템플릿으로 서 1 라운드 PCR 산물을 사용 한다. PCR의 2 개의 라운드는 분석의 감도를 현저 하 게 증가 시킵니다.

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프로토콜

이 프로토콜에서 마우스의 사용은 군사 의학 연구소의 동물 복지에 대 한 관리 위원회에 의해 승인 되었다, 군사 의료 과학 아카데미, 중국 (실험실 동물 관리 및 사용 위원회 승인, 허가 2010-02). 실험실 동물의 관리 및 사용을 위한 모든 기관 및 국가 지침이 따랐습니다.

1. RNA 추출

1. 광견병-의심 되는 뇌 조직, 피부 생 검, 타 액 또는 CSF 또는 RABV 감염 세포 배양 물 로부터 RNA를 추출 하 여, 구 아니 늄 추적용-페 놀 클로로 포 름 계 추출 방법 또는 시판 바이러스 RNA 추출 키트를 사용 한다. 준비 된 RNA를 즉시 사용 하거나 필요할 때까지-80 ° c에서 보관 하십시오.

2. 바이러스 성 RNA의 역 전사

1. 표 1 에 나열 된 RT 시 약을 냉동에서 제거 하 고, 얼음에 보관 하 고, 사용 하기 전에이를 해 동 하 고 소용돌이 십시오.
2. 표 1에 나열 된 시 약을 0.2 ML의 PCR 튜브에 µ 반응 믹스 12 리터를 준비 한다. 마스터 믹스의 부피를 필요 이상으로 1 개 이상의 반응 크기로 준비 하 여 파이 펫 팅 변형을 허용 합니다.
3. 템플릿 룸에서 PCR 워크 스테이션 내에서 RT 반응 믹스에 8 µ L 샘플, 포지티브 제어 RNA 또는 네거티브 컨트롤을 추가 합니다. 상기 RT 양성 대조 군으로는 고정 된 RABV 스트레인에 감염 된 세포 배양 물 로부터 추출한 RNA-11 (챌린지 바이러스 표준-11)을-80 ° c에서 보관 하였다. 네거티브 컨트롤에는 RNase가 없는 ddH₂O가 포함 되어 있습니다.
4. 볼 텍 싱에 의해 RT 튜브의 내용물을 섞는다; 이어서, 짧게 원심 분리기.
5. 반응 튜브를 열 사이 클론에 넣습니다. 다음과 같은 조건으로 cDNA 합성 프로그램을 설정 합니다: 42 ° c의 경우 90 분, 95 ° c의 경우 5 분, 그리고 4°c에서 4 ° c를 유지 합니다. 반응 량을 20 µ로 설정 합니다. RT 실행을 시작 합니다.

3.1 라운드 PCR

1. 상기 표 2 에 열거 된 PCR 시 약을 사용 전까지 청정 실에서 얼음 위에 보관 하 고; 그런 다음, 해 동 하 고 소용돌이.
2. 상기 표 2에 나열 된 시 약을 사용 하 여 0.2 mL pcr 튜브에 제 1 라운드 pcr 혼합물을 제조 하였다.
3. CDNA 또는 플라스 미드의 2 µ L 샘플을 템플릿 룸 내의 PCR 워크스테이션 내에서 1 라운드 PCR 믹스에 첨가 한다. 상기 PCR 양성 대조 군으로는 상기 RT 방법에 대해 2.3 단계에서 언급 한 바와 같이 제조 된 CV-11 cDNA를 제공 한다. PCR 음성 대조 군에는 ddH₂가 있다.
4. 표 3에 나열 된 매개 변수를 사용 하 여 밀봉 된 튜브를 PCR 열 사이 클론으로 이송 하 고 순환 시킵니다.

4.2 차 PCR

1. 상기 표 4에 열거 된 시 약을 이용 하 여 0.2 mL pcr 튜브에 2 차 pcr 혼합물을 제조 하였다.
2. 1 라운드 PCR 산물의 2 µ L을 제 2 라운드 PCR 믹스에 추가 합니다. 또한, ddH를 2차 PCR의 음성 대조 군으로 서 포함 한다.
3. 3.4 단계에서 주어진 것과 동일한 파라미터를 사용 하 여 PCR 열 순환을 수행 한다.

5. 아가 로스 겔에 전기 영동 하 여 PCR 산물 분석

1. 1.5% 아가 로스를 1.5 g의 스 트리 아세테이트-EDTA의 100 mL에 첨가 하 고,이를 전자 렌지에서가 열 하 여 완전히 용 해 시킨 후에 아가 로스 겔을 제조 하였다.
2. 에 티 듐 브 로마 이드 (EB) 첨가 (최종 농도 0.01%) 또는 다른 상업용 EB 치환. 곰 팡이에 젤을 붓고 적어도 30 분 동안 주위 온도에서 응고 되도록 둡니다.
3. 각 PCR 산물의 5 µ L을 6 배의 로딩 완충 액 1 µ L과 혼합 하 여 로딩 샘플을 준비 한다.
4. 시료와 적합 한 DNA 마커를 웰에 별도로 적재 하 고 겔을 120에서 약 30-45 분 동안 겔을 실행 하 여 염료 라인이 약 75% ~ 80% 아래로 되도록 한다.
5. 전원을 끄고 전원에서 전극을 분리 한 다음 젤 상자에서 젤을 조심 스럽게 제거 하십시오.
6. UV 젤 문서화 장치를 사용 하 여 DNA 단편을 시각화 하 고 촬영 합니다.

6. 내포 된 RT-PCR의 특성화

1. 6.1. 리즈 사 바이러스 플라스 미드 18 의 검출 에 대 한 특이성 및 민감도
   1. 상기 PCR에 대 한 각각의 리즈 사 바이러스 (16 가지 ICTV 종 및 두 개의 신규 한 종)의 전체 N 유전자를 함유 하는 상용 플라스 미드 (18)를 주문 한다.
   2. Avogadro의 번호 (N) 및 다음 공식을 사용 하 여 플라스미드의 카피 수를 계산 한다.
      【 µ 플라스 미드 DNA 660) 】 × 6.022 × 10 23 = 분자의 수/µ l
   3. DdH₂의 모든 18 플라스 미드의 재고 솔루션 (2.24 x 10⁹ 분자/µ l) 준비
   4. DdH₂에 있는 모든 18 플라스 미드의 9 10-접기 연속 희석을 수행 하십시오. 각 플라스 미드 스톡의 µ l을 90 µ l의 ddh₂의 소용돌이 및 원심 분리기와 함께 희석 하십시오.
   5. 3-5 섹션에 설명 된 대로 PCR 증폭을 수행 합니다.
   6. 일련의 리즈 사 바이러스 플라스 미드를 검출 하 여 중첩 된 PCR의 특이성 및 민감도를 분석 한다.
2. D의 결정 etection l imit
   1. 광견병 바이러스 균 주의 역가 조정 CV-11 세포 배양 액을 10^5.5 tcid₅₀/ml (바이러스 역가는 oie 매뉴얼에 따라 결정 됨)⁵.
   2. 6.1.4 단계에서 설명한 바와 같이 CVS-11의 5 10 (재고 액은 10^5.5 tcid₅₀/mL)의 시리얼 희석을 수행 합니다.
   3. 1-5 섹션에 기재 된 바와 같이 모든 바이러스 희석 액의 RNA 추출 및 중첩 된 RT-PCR 증폭 절차를 수행 한다.
3. Compar 의 슨 는 내포 된 rt-pcr "골드 스탠다드" 지방
   1. 모든 임상 샘플을 중첩 된 RT-PCR로 시험 하 고, 그 결과를 지방⁵ 및 N 유전자 염기 서 열 분석⁹로 확인 하였다.
   2. SAS 9.1을 사용 하 여 통계 분석을 위해 정규화 된 데이터를 활용 합니다. 진단 테스트의 통계적 비교를 위해 카파 테스트와 McNemar의 카이 제곱 검정을 사용 하십시오 (SAS 명령: proc 주파수; 테이블/동의). Abinomial 분포를 가정할 때 신뢰 구간을 계산 합니다.
4. 성능 저하 샘플 테스트의 효능 평가
   1. 37 ° c에서 확인 된 2 개의 임상 뇌 조직 샘플을 라 이드 개에 노출 시킵니다.
   2. 중첩 된 RT-PCR, 지방 및 MIT⁵에 의해 37 ° c에서 노출의 각 일에 두 개의 샘플을 분석 하였다.

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결과

18 개의 리 사 바이러스 종을 검출 하는 중첩 된 RT-PCR의 결과는 도 1에 나타나 있다. 모든 PCR 양성 대조 군에서는 1 차 및 371 bp에서 845 bp에 예상 되는 것을 나타내 었으 며, 네거티브 컨트롤에는 밴드가 없는 2 라운드 증폭. 총 18 개 리즈 사 바이러스는 예상 845 및/또는 371 bp 대역을 생산 하 여, 중첩 된 RT-PCR이 모든 리즈 사 바이러스를 검출 했음을 나타낸다. 16 개의 리 사 바이러...

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토론

현재 RABV는 중국의 거의 모든 인간과 동물 광견병 뿐만 아니라 다른 나라에 대 한 책임을 맡고 있는 주요 리 사이 바이러스입니다. 또한, IRKV 변이체는 2012에서 중국 북동부에 있는 길 림 성의 Murina leucogaster 박쥐 로부터 먼저 확인 되었고, 2017¹¹에 있는 랴오닝 성에 서 개 사망을 야기 하는 것으로 보고 되었다. 가장 최근에는, 2017에서 대만, 중국의 일...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 × TAE	Various	Various
6 × loading buffer	TakaRa	9156
Agarose	US Everbright® Inc	A-2015-100g
ddH2O	Various	Various
DL 2,000 Marker	Takara	3427A
dNTPs (10 mM)	TakaRa	4019
dNTPs (2.5 mM)	TakaRa	4030
Electrophoresis System	Tanon	EPS300
Ex-Taq (5 U/μL)	TakaRa	RR001
Gel Imaging System	UVITEC	Fire Reader
Microcentifuge tubes	Various	Various
M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL)	TakaRa	2641A
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermoscientific	ND1000
Oligo (dT)15	TakaRa	3805
PCR Machine	BIO-RAD	T100
PCR Tubes	Various	Various
Phusion High-Fidelity DNA Polymearase	NEW ENGLAND BioLabs	M0530S
Pipettors	Various	Various
Random Primer	TakaRa	3801
RNase Inhibitor (40 IU/µL)	TakaRa	2313A
RNase-free ddH2O	TakaRa	9102
Taq Buffer (10×)	TakaRa	9152A
Tips	Various	Various
Vortex mixer	Various	Various